指纹图谱方法
第五章指纹图谱
S1 S2 S3 S4 S5 对照指纹图谱
1.000 0.997 0.995 0.995 0.997 0.998
0.997 1.000 0.998 0.997 0.996 0.999
0.995 0.998 1.000 0.998 0.991 0.999
0.995 0.997 0.998 1.000 0.990 0.999
♦ 液相色谱 ● 色谱柱：比较试验加以选择
流动相：至少用三种不同组成比较
流动相 1
流动相 2
流动相 3
适宜的柱温和检测波长
15 203
20
210
25
236
30
254
35
365
五、方法学验证
1. 稳定性试验
供试品溶液的稳定性
表3 川芎指纹图谱稳定性试验相似度计算结果（n=5）
对照指纹图谱 S1 S2 S3 S4 S5
红外光谱图
小蓟丁酮提取物的红外 指纹图谱
• 中国药典规定：小 蓟在开花时采。 • 根据1384cm-1处 吸收峰的有无，可 以鉴别其采集时间 是否正确。
质谱（ＭＳ）
• 按照带电粒子的质荷比（ｍ／ｚ）和其相 对丰度大小排列组成图谱。 • 中药特征提取物置质谱仪中进行轰击裂解 为不同的碎片，获得提取物中化学成分的 MS图，不同中药由于所含化学成分的种类 及组成比例的不同，所得质谱图中分子离 子峰和碎片离子峰亦不一致。
HPCE, CE/MS 光谱技术 UV IR
波谱技术 MS NMR X-射线衍射法 分子生物学技术
薄层色谱
●可在同板同时分析多达18个样品， ●展距局限在 10cm~20cm ，‘柱效’ 时效高 相对较低，对复杂组分 ●所用的是正相展开剂，其组成变 不提高分离度则难以提 化灵活，可适应多种成分的分离 取指纹特征的药材受到 限制。 ●离线操作，即可直观比较图谱， 又可扫描得到轮廓图和处理数据 ●开放系统，对环境温 度、相对湿度要求较高 ●占机时间短
DNA指纹图谱分析
DNA指纹图谱法的基本操作：从生物样品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可运用PCR 技术扩增出高可变位点（如VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等）或者完整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。
琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。
利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。
如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。
琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。
用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。
长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。
它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。
DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。
DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。
电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。
三. 实验材料和试剂1. DNA样品2.化学试剂和溶液（1）DNA样品反应缓冲液：100mM Tris，200mM NaCl，20mM MgCl2，2mM DTT，pH 8.0 （2）EcoRⅠ限制性内切酶（3）PstⅠ限制性内切酶（4）电泳缓冲液（50×TAE）Tris 242g冰醋酸57.1mlEDTA（0.5mol/L pH 8.0）100ml使用时用蒸馏水稀释50倍。
（5）样品缓冲液（DNA sample loading dye）0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青40%（W/V）蔗糖（6）溴化乙锭（EB）10mg/ml（7）琼脂糖agarose（电泳级）（8）DNA分子量标记物：Lambda HindⅢDNA markers3. 仪器设备和消耗品电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、水浴锅、移液器（10μl，200μl，1000μl）、离心管、一次性枪头（200μl，1000μl）。
中药指纹图谱(课件)
分离效果好
GC利用气体作为流动相，能够实现中药中挥发性成分的快速、 有效分离。
分析速度快
GC分析周期短，适用于中药中大量样品的快速分析。
灵敏度高
GC检测器灵敏度高，能够检测到中药中微量的挥发性成分。
薄层色谱法（TLC）
操作简便
TLC操作简便易行，无需特殊设备，适用于中药指纹图谱的初步 分析。
分离效果好
感谢您的观看
THANKS
1 2 3
色谱柱选择
根据中药样品的成分特点，选择合适的色谱柱类 型及规格，确保各成分在色谱柱上得到良好的分 离。
流动相选择
根据样品的溶解性和色谱柱的特性，选择合适的 流动相组成及比例，以获得良好的色谱峰形和分 离效果。
色谱条件优化
通过调整流动相的流速、柱温等色谱条件，进一 步优化色谱分离效果，提高指纹图谱的准确性和 稳定性。
03
常见中药指纹图谱类型及 特点
高效液相色谱法（HPLC）
分离效能高
重复性好
HPLC采用高效微粒固定相，能够实现 中药复杂体系中各组分的有效分离。
HPLC方法稳定可靠，重复性好，能够 满足中药指纹图谱的批量化分析需求。
灵敏度高
采用高灵敏度的检测器，能够检测到 中药中微量甚至痕量的有效成分。
气相色谱法（GC）
指导工艺改进
根据生产工艺稳定性评 价结果，可以指导工艺 改进和优化，提高生产 效率和产品质量。
05
中药指纹图谱在真伪鉴别 中应用
伪品识别与防范策略
伪品定义及危害
阐述伪品概念，分析伪品对 中药市场及患者用药安全造 成的严重影响。
常见伪品类型
列举常见的中药伪品，如以 次充好、掺杂使假、品种混 淆等。
指纹图谱
样品前处理：1.冷冻保存：-80℃组织应在离体30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。
1.从组织提取基因组DNA一、材料外囊、外膜、“外膜”附近肝组织、正常肝组织（多组标本）二、设备移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
三、试剂1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
四、操作步骤:1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。
2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。
3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。
4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。
5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。
6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。
待分层后,3000rpm离心 5分钟。
7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。
8. 移去上层乙醚,保留下层水相。
9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。
室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。
10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE 中,-20℃保存。
11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。
基因组DNA的检测（即定性及定量分析）上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。
DNA指纹图谱在农作物品种鉴定中的应用
DNA(脱氧核糖核酸)是细胞染色体中的遗传基因,其分子各个片段就代表各个遗传信息。
由于DNA指纹图谱直接反映DNA水平上的差异,它成为当今最先进的遗传标记系统。
DNA指纹图谱技术主要有:限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polym or2 phism,简称RF LP)、随机扩增多态性(Random am plified polym orphic DNA,简称RAPD)、小卫星DNA (Mini2satellite DNA)、微卫星DNA (Microsatellite DNA)、内部简单重复序列(ISSR)、扩增片段长度多态性(Am plified fragment length polym or2 phism,简称AF LP)等等。
一、DNA指纹图谱的方法11RF LP方法RF LP方法是G rodzicker等人于1974年发明的。
它是一种利用限制性酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技术。
RF LP方法于上个世纪80年代开始应用于植物,在水稻、小麦、玉米、蕃茄和马铃薯等作物上的研究都已有报道。
但RF LP的多态信息含量是相对而言的,在一些作物上RF LP探针可进行品种间及种间的鉴别,而在小麦、马铃薯、大豆等作物上的多态性较低。
特别是小麦,它是严格的自花授粉作物,基因组较大,多态性很低(即使在相当分散的品种间也是如此)。
因而,RF LP方法在指纹图谱中的应用受到限制。
21RAPD方法RAPD方法是Willams等人于1990年发明的。
它是利用扩增DNA片段长度差异来检测生物个体的分子标记技术。
它可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下,对其进行基因组指纹图谱的构建。
其相对于RF LP方法较简便,DNA用量也较少,且省去了使用放射性同位素,受到了许多学者的重视。
Welth1991年曾用RAPD分析玉米杂交种的品种纯度,He等人1992年曾用RAPD识别小麦品种,在花生、小麦、水稻等作物上也曾进行过深入研究。
中药指纹图谱相似度评价方法的比较
中药指纹图谱相似度评价方法的比较一、本文概述中药指纹图谱作为一种全面、综合地反映中药内在质量的技术手段，已经在中药质量控制、真伪鉴别以及新药研发等领域得到了广泛应用。
指纹图谱相似度评价则是评估中药指纹图谱质量、稳定性的重要指标，其评价方法的优劣直接关系到中药质量评价的准确性。
本文旨在对现有的中药指纹图谱相似度评价方法进行比较分析，探讨各种方法的优缺点，以期为提高中药质量控制水平提供理论支持和实践指导。
本文将首先介绍中药指纹图谱相似度评价的基本概念和研究意义，然后重点阐述几种常用的相似度评价方法，包括夹角余弦法、相关系数法、谱峰匹配法等。
在此基础上，本文将通过对比分析这些方法的计算原理、适用范围、优缺点等方面，为读者提供一个全面、深入的相似度评价方法比较视角。
本文将展望中药指纹图谱相似度评价方法的未来发展趋势，以期为推动中药现代化、国际化进程提供有益参考。
二、中药指纹图谱相似度评价方法概述中药指纹图谱相似度评价是中药质量控制领域的一个重要研究方向，旨在通过科学、客观的方法来评估中药的内在质量。
随着现代分析技术的不断发展，越来越多的相似度评价方法被应用于中药指纹图谱的研究中。
这些方法大致可以分为以下几类：谱图直观比较法：这是最简单直接的相似度评价方法，通过直接观察指纹图谱的峰形、峰位和峰强度等信息，对中药样品进行直观的比较和判断。
这种方法简单易行，但主观性较强，容易受到观察者的经验和技能影响。
相似度计算法：这类方法通过数学公式或算法，对中药指纹图谱进行量化分析，从而得出样品间的相似度。
常用的相似度计算法包括相关系数法、夹角余弦法、欧氏距离法等。
这些方法具有客观性强、结果可重复等优点，但也需要选择合适的计算参数和阈值。
模式识别法：模式识别技术，如人工神经网络、聚类分析、主成分分析等，也被广泛应用于中药指纹图谱的相似度评价中。
这些方法能够通过学习和训练，自动识别指纹图谱中的特征信息，并对中药样品进行分类和识别。
指纹图谱
＊选择试验方法及试验条件须根据供试品的特 点和需要设计合适的试验方案，在保证专属 性、重现性的前提下，宜选择简单、实用、 便于实施的方法和试验条件。
＊色谱中的参照峰由于作用不同于含量测定， 提高其分离度应以不牺牲色谱泊整体特征为 前提，所以不应孤立地苛求分离度必需达到 含量测定的要求。
中药材指纹图谱 质量控制及仪器方法
江苏省中医药研究院 钱大玮 段金廒
一、中药材指纹图谱的基本含义
定义：中药材指纹图谱是指某种(或某产地） 中药材中所共有的，具有特征性的某类 或几类成分的色谱或光谱的图谱。
特点：(1)通过指纹图谱的特征性,能有效鉴 别样品的真伪；
(2)通过指纹图谱主要特征峰的面积和比 例的制定，能有效控制样品质量，保证 样品质量的相对稳定。
2 应用实例
图9 黄连TLC指纹图谱
（六）高效毛细管电泳（HPCE）指纹图谱
1. 仪器简介
仪器装置通常包括高压电源、进样系统、 毛细管柱、检测器和记录系统5部分,其中毛细管 柱是分离的核心部分。
2. 应用实例
图 10 天麻及其伪品HPCE图 a天麻水提液 b天花粉水提液 c黄精水提液 d 商陆水提液e大九股牛水提液
（九）质谱（ MS）指纹图谱
将中药提取液置质谱仪中进行电子轰击 电离，可获得提取液中化学成分的MS图，不 同中药提取液所含成分不同，所得质谱图显 示的分子离子峰及进一步的裂解碎片峰亦不 一致，可资鉴别。但质谱法对提取液中主要 成分的含量要求较高，实验费用亦较大，能 否作为常用的检测方法尚待继续探索。
版一部119页红花项下的各项规定。
中药技术现代化技术-指纹图谱
02
发展新型检测技术和仪器
研发更精确、更灵敏的检测方法和仪器，满足指纹图谱需求。
03
强化传统理念与现代技术融合
在传承中药理念的基础上，运用现代技术手段，推动中药指纹图谱的发
展。
未来发展趋势预测
技术不断创新
随着科技的进步，中药指纹图谱技术将不断创新，提高准确性和 可靠性。
应用范围扩大
中药指纹图谱将逐渐应用于更多领域，如药品质量控制、新药研 发等。
指导。
中药生产过程监控
指纹图谱技术可以实时监控中 药生产过程中的关键环节，确 保生产过程的稳定性和可控性。
通过对生产过程中指纹图谱的 变化分析，可以及时发现生产 过程中的异常情况，避免生产 事故的发生。
指纹图谱技术还可以应用于中 药生产过程的优化和改进，提 高生产效率和产品质量。
中药疗效评价与机理研究
的快速筛选和鉴定。
03 中药指纹图谱建立方法与 流程
样品选择与制备
01
选择具有代表性的中药样品，确 保其能够反映该中药的整体质量 特性。
02
对样品进行适当的制备处理，如 粉碎、提取、浓缩等，以获得符 合指纹图谱分析要求的样品。
数据采集与处理
采用高效、灵敏的现代分析仪器，如 色谱仪、光谱仪等，对中药样品进行 全面的化学成分分析。
面临挑战
技术标准化难度大
中药成分复杂，不同药材、不同批次间存在差异，制定统一标准 面临挑战。
检测方法与仪器限制
现有检测方法和仪器精度、灵敏度等方面可能无法满足指纹图谱要 求。
传统理念与现代技术融合
如何将传统中药理念与现代技术相结合，是中药指纹图谱面临的重 要问题。
解决方案探讨
01
加强标准化建设
食品安全快速检测指纹图谱方法开发
食品安全快速检测指纹图谱方法开发近年来，食品安全问题成为社会关注的焦点。
为了提高食品安全检测的效率和准确性，科学家们开发了一种新的检测方法——食品安全快速检测指纹图谱方法。
这种方法基于生物技术和化学分析技术，能够快速、准确地判断食品的质量和安全性。
本文将详细介绍食品安全快速检测指纹图谱方法的开发原理、应用场景和优势。
食品安全快速检测指纹图谱方法的开发原理主要基于两个关键技术：生物技术和化学分析技术。
首先，通过使用高通量测序技术，可以获取食品样品中的DNA或RNA序列信息。
然后，利用生物信息学方法对这些序列进行比对和分析，得到食品的特征指纹图谱。
接下来，利用化学分析技术，对食品样品进行色谱、质谱或光谱等分析，获取食品中的化学成分信息。
最后，将生物和化学信息进行综合分析，建立食品安全指纹图谱数据库，并通过模式识别算法进行快速检测和识别。
食品安全快速检测指纹图谱方法可以应用于各个环节的食品安全检测和溯源。
首先，在生产环节，可以对原料和生产过程中的食品进行检测，确保食品的质量和安全性。
其次，在运输和储存环节，可以监测食品的保存状态，及时发现问题，防止食品变质和污染。
最后，在销售和消费环节，可以对市场上的食品进行抽检，保障食品供应链的安全。
与传统的食品安全检测方法相比，食品安全快速检测指纹图谱方法具有几个明显的优势。
首先，它可以快速检测大量样品，提高检测效率。
传统方法通常需要较长时间才能得到结果，而指纹图谱方法只需几个小时就能完成检测。
其次，该方法具有较高的准确性和可靠性。
由于使用了多个指纹特征和多个指标分析，能够更全面地评估食品的质量和安全性。
再次，这种方法可以定量分析食品中的成分含量。
通过比较不同样品的指纹图谱，可以准确判断食品是否有变质或掺假现象。
最后，该方法还可以与大数据、云计算等新技术结合，构建食品安全大数据平台，便于信息共享和监管。
尽管食品安全快速检测指纹图谱方法在食品安全领域有着广阔的应用前景，但仍然存在一些技术挑战和问题需要克服。
中药指纹图谱操作技巧指南
中药指纹图谱操作指南说明：本实验研究规程指南为在原技术要求的基础上规范中药注射剂色谱指纹图谱试验研究而制订。
本指南未能概括的内容，通过实践可自行补充调整，但申报资料或复核资料中须有相应的说明和申述。
指南中的"色谱指纹图谱"指采用柱色谱及薄层色谱等各种色谱技术实验研究的指纹图谱。
光谱指纹图谱将另行规定。
一、供试品收集供试品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，由于不可能对一个药材的所有样本进行试验，而且生长环境条件对药材代谢产物有影响，所以要收集有代表性的供试品。
收集不少于10批供试品的含义是指样本的数和量要有足够的代表性。
(一) 原料药材：在药材的化学成分与中医临床疗效的之间的关联尚未能阐明的现阶段，基本上是在承认其传统的功能主治及临床验证的基础上进行指纹图谱的实验研究。
原料药材的指纹图谱主要是反映其自然状态的内在质量情况，研究其指纹图谱是以此作为选择原药材投料或混批提取的依据，同时作为研究注射剂成品指纹图谱相关性的基础。
由于自然条件的变化，药材个体之间指纹图谱的差异是正常的，在品种鉴定无误的基础上，力争药材有较为固定和稳定的来源，个体之间的指纹图谱主要特征大致相似即可，使成品指纹图谱特征的稳定有起码的保证。
药材的"批" 不是工业生产的"批"，是指相互独立的供试品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的供试品分成若干份供试品，以保证试验结果的代表性。
由于收集药材供试品受主观和客观的条件限制，供试验的供试品严格讲均没有统计学的意义，所以供试品数越多越好，10批是最低的要求。
供试品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括：药材名称供试品来源（真实记录供试品来自何处：传统产地收集或是资源丰富的产地收集，或者来自GAP基地供应；还是产地购买、市场购买或委托购买，等，以便于生产原料的采购选择和测试数据的可追溯）。
收集时间（购买时间）及收集人货源情况调查（货源是否充足和稳定）基原鉴定及鉴定人：产地或GAP基地收集的药材结合植物形态鉴定品种。
中药指纹图谱研究
（二）起草说明
• 目的在于说明制定指纹图谱检测标准中各个项
目的理由，规定各项目指标的依据、技术条件
和注意事项等。
• 既要有理论解释，又要有实践工作的总结及试 验数据。
二．中药材指纹图谱研究的 一般方法
• 主要介绍与中药（新药）注射剂指纹图 谱技术申报要求有关的研究内容
样品收集
• 为了确保指纹谱的系统性，必须进行具 有广泛代表性的样品收集，尤其是不同 产地、不同采收期及加工方式的样品的 收集，只有保证了样品的代表性，才能 保证建立的指纹谱的有效性。
（一）指纹图谱的检测标准
1）通过指纹图谱的特征性，能有效 鉴别样品的真伪或产地； 2）通过指纹图谱主要特征峰的面积 或比例的制定，能有效控制样品的 质量，确保样品质量的相对稳定。
2．中药材指纹图谱的定义：
• 中药材指纹图谱系指中药材经适当 处理后，采用一定的分析手段，得到的 能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。 • 如果原药材需经过特殊炮制（如醋 制、酒制、炒炭等），则应制定原药材 和炮制品指纹图谱的检测标准。
（三）中药指纹图谱建立的 意义与原则
• 建立于中药成分的系统研究结果之上的指 纹图谱，是现阶段可以全面的反映中药的内在 质量的一个有效手段。世界公认，中药化学成 分的多样性与复杂性是发挥其疗效的物质基础， 同时也是质量评价的重点与难点。 • 中药药效的发挥，不能为一个或一种化学 成分所体现，那么，建立全面反映所含成分的 指纹图谱， 有效地体现中药成分的复杂性，从 而更好地评价中药的质量，中药指纹图谱必将 成为中药质量评价的发展趋势。
指纹图谱计算方法
前言
目前根据整体谱图进行质量控制的数据处理方 法主要有模式识别与人工神经网络的方法，它 们给出的答案是一种分类及定性的信息，不直 接定量比较两张指纹图谱间的相似度。但在很 多情况下我们需要利用这种相似度的计算提供 定量的评价信息，为中药质量控制提供依据。 基于这种情况我们提出了一种定量直接比较两 张指纹谱相似度的新方法：向量夹角法
大连化物所
大连化物所
2 2 2 X ＝ x12 + x 2 + x 3 + ... x n 为向量X的模
向量夹角法的基本原理
每个色谱指纹图谱都可以看作一组对应保留时 间下的峰高(或峰面积)的数值，可以把这组数 值看作多维空间中的向量 两个指纹图谱间相似性的问题转化为多维空间 的两个向量的相似性问题，利用上式能够定量 表征指纹图谱间的相似性
大连化物所
向量夹角法计算相似度的基本步骤
一 在统一的样品处理与分析测试条件下获得 色谱指纹图谱； 二 进行谱图积分获得保留时间、峰高等信息 三 根据分析时的基线噪声水平，将信噪比<5 的色谱峰除去不作考虑； 四 用计算机自动进行两个指纹图谱之间的峰 匹配，并利用上式计算相似度
大连化物所物所
实例:不同吴茱萸样品相似度比较
广西上林汤洗7编 湖南怀化
湖南新晃甘草炮制
广西灌阳
四川广元
广西百色
广西文市镇
广西灌阳茶用
广西上林甘草炮制
广西凌云仰村
贵州遵义
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
大连化物所
实例:不同吴茱萸样品相似度比较
表 1：相似度计算结果 Table 1: Results of similarity of Chromatogram No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Origin (产地与炮制方法) Shanglin ,GuangXi (广西上林汤洗7遍) Huaihua, HuNan (湖南怀化) Xinhuang, HuNan (湖南新晃甘草炮制) Guanyang ,GuangXi (广西灌阳县) Guangyuan, SiChuan (四川广元) Baise ,GuangXi (广西百色) Wenshizhen, GuangXi (广西文市镇) Guanyang, GuangXi (广西灌阳茶用) Shanglin ,GuangXi (广西上林甘草炮制) Lingyun, GuangXi (广西凌云仰村) Zuni, GuiZhou (贵州遵义) Similarity 42.30% 78.60% 84.90% 85.20% 85.20% 85.80% 87.50% 87.90% 89.70% 92.10% 100%
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
方法
1 参照物的选择及溶液制备绿原酸为金银花的主要成分，而且所选择的金银花药材供试品溶液提取方法很容易将绿原酸提取出来，在色谱图中容易辨认，所以选择绿原酸作为参照物。
参照物溶液的制备方法：取绿原酸对照品适量，加50％甲醇配制成每毫升含0.06 mg的溶液，即得。
2 检测波长及流动相的选择根据文献报道，绿原酸类化合物是金银花的主要活性成分，经测定绿原酸参照物溶液和金银花药材提取液在327 nm处均有最大吸收，因此，选择327 nm 为测定波长。
在用同一浓度的样品溶液、色谱柱、流速（0.7 ml/min）、检测波长和HPLC 仪器的条件情况下，通过对多种溶剂系统进行考察，最后确定的最佳流动相为甲醇-0.1%磷酸（40∶60），流速为0.7 ml/min，检测时间30 min。
3 提取方法的选择金银花中主要有效成分为绿原酸、异绿原酸，它们是奎宁酸和咖啡酸的酯，其中绿原酸含量高，是金银花及其相关制剂的活性指标成分。
参照文献资料［4，5］，经对多种提取溶剂研究，结果表明，以50%甲醇溶液作为提取溶液进行超声提取，能将金银花中绿原酸类成分充分提取，提取液中有效成份不需要进一步提取分离与富集，可以直接进样分析。
4 供试品溶液的制备取金银花药材，置硅胶干燥器中干燥24 h，研细，取约0.
5 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，加50％甲醇50 ml，超声处理30 min，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 ml，置50 ml量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
5 测定法及数据处理分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录30min的色谱图。
用中国药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”（版本2004A）进行数据处理，将多个批次的色谱图进行比较，得到可全面反映多个色谱图特征的金银花药材的对照指纹图谱。
以此模式为基准，计算每个色谱图与之相比较的相似度（范围应在0.90～1.99之间）。