食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验

食品微生物之检验方法－阪崎肠杆菌之检验

1 适用范围：本方法适用于一般食品及奶粉中阪崎肠杆菌之检验。

2 检验方法：

2.1 工作环境：工作平台须宽敞、洁净、光线良好，操作平台光度为100呎烛光以上，密闭室内换气良好，尽可能没有灰尘及流动空气。每15分钟落菌数不得超过15 CFU／培养皿。

2.2 器具及材料：

2.2.1 干热灭菌器。

2.2.2 高压灭菌釜。

2.2.3 搅拌均质器（Blender）或铁胃（Stomacher）：适用于无菌操作者。

2.2.4 天平：可称量到2000 g者，灵敏度为0.1 g；可称量到120 g者，灵敏度为1 mg。

2.2.5 冰箱：能维持5 ± 3℃者。

2.2.6 吸管或吸管尖：已灭菌，1 mL吸管应有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管应有0.1 mL 之刻度。

2.2.7 吸管辅助器（Pipette aid）或微量分注器。

2.2.8 稀释瓶：160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、铁弗龙（Teflon）或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质，附螺旋盖。

2.2.9 培养皿：已灭菌，内径约9 cm，深度约15 mm，底皿之内外面应平坦，无气泡、刮伤或其它缺点。

2.2.10 增菌用容器：附螺旋盖之125 mL、250 mL、2 L三角锥瓶或广口瓶；玻璃、聚乙烯、铁弗龙或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质。

2.2.11 pH测定仪。

2.2.12 培养箱：能维持内部温度在± 1℃以内者。

2.2.13 温度计：量测温度范围1～55℃，最小刻度0.1℃。

2.2.14 水浴：加盖，具水流循环系统，能维持水温温差在± 0.2℃以内者。

2.2.15 接种针及接种环（直径约3 mm）：镍铬合金、铂铱或铬线材质，或可抛弃式者。

2.2.16 曲玻棒：可灭菌者，直径3～4 mm，涂抹区域45～55 mm。

2.2.17 试管：10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm试管，或其它适用者。

2.2.18 旋涡混合器（Vortex mixer）。

2.2.19 显微镜：能放大至1000倍以上之一般光学显微镜。

2.2.20 载玻片及盖玻片：适用于染色及镜检用。

2.2.21 研钵、杵。

2.2.22 药勺、剪刀、小刀、镊子：可灭菌。

2.2.23 滤纸及褐色试药瓶。

2.2.24 无菌滤膜：孔径0.45 μm或以下之亲水性醋酸纤维膜。

2.2.25 杜兰发酵管（Durham fermentation tube）：外径9 × 22 mm或其它适用者。

2.2.26 试药：氯化钠、硫酸月桂酸钠（sodium lauryl sulfate）、胆盐No. 3（bile salts No. 3）、中性红（neutral red）、结晶紫（crystal violet）、柠檬酸铁铵（ferric ammonium citrate）、脱氧胆酸钠（sodium desoxycholate）、硫代硫酸钠（sodium thiosulfate）、草酸铵（ammonium

oxalate）、碘化钾、碘、沙黄O（safranin O）、对-二甲胺基苯甲醛（p-dimethyl aminobenzaldehyde）、四甲基对位苯二胺盐酸盐（N,N,N',N'-tetramethyl -ρ-phenylenediamine‧2HCl）、磷酸二氢钠（NaH2PO4‧H2O）、硝基苯哌喃半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside）、亮绿（brilliant green）、酚红（phenol red）、溴甲酚紫（bromcresol purple）、溴麝香草蓝（bromthymol blue）、肌酸（creatine）、甲基红（methyl red）、α-萘酚（α-naphthol）、氢氧化钾、95%乙醇、无水乙醇、戊醇（amyl alcohol）或异戊醇（isoamyl alcohol）、乳糖、蔗糖、半乳糖醇（dulcitol）、核糖醇（adonitol）、棉子糖（raffinose）、山梨醇（sorbitol）、阿拉伯糖醇（D-arabitol）、氰化钾、氢氧化钠、L-离胺酸（L-lysine）、L-鸟胺酸（L-ornithine）、L-精胺酸（L-arginine）、矿物油或液态石蜡油（paraffin oil）及盐酸等均采用化学试药级。

2.2.27 试剂：

2.2.27.1 无菌蒸馏水：

蒸馏水900 mL、90 mL、9 mL，分装于增菌容器或试管中，以121℃灭菌15分钟。2.2.27.2 0.85%生理食盐水：

取氯化钠8.5 g溶于1000 mL蒸馏水中，分装于试管内，以121℃灭菌15分钟。

2.2.27.3 柯瓦克氏试剂（Kovacs’ reagent）：

取对-二甲胺基苯甲醛5 g溶于戊醇或异戊醇75 mL中，再徐徐加入盐酸25 mL，混合均匀后应呈黄色并须保存于4℃冰箱中。

2.2.27.4 甲基红指示剂（Methyl red indicator）：

取甲基红0.1 g溶于95%乙醇300 mL后，再加蒸馏水使成500 mL。

2.2.27.5 欧普氏试剂（Voges-Proskauer test reagents, VP reagents）：

溶液A：取α-萘酚5 g溶于无水乙醇100 mL中。

溶液B：取氢氧化钾40 g溶于蒸馏水中，并使成100 mL。

2.2.27.6 0.5%氰化钾溶液（0.5% potassium cyanide solution）：

取氰化钾0.5 g溶于无菌蒸馏水100 mL中（氰化钾为剧毒物质，本操作务必在抽气柜内进行）。

2.2.27.7 矿物油或液态石蜡油：

取矿物油或液态石蜡油20～50 mL，装入有盖容器中约1/2满，以121℃灭菌30分钟。

2.2.27.8 革兰氏染色液（Gram stain solution）：

2.2.27.8.1 哈克氏（Hucker’s）结晶紫液（初染剂）：

溶液A：取结晶紫2 g溶于95%乙醇20 mL中。

溶液B：取草酸铵0.8 g溶于蒸馏水80 mL中。

将溶液A与溶液B混合，静置24小时后以滤纸过滤，取滤液作为初染剂。

2.2.27.8.2 革兰氏碘液（媒染剂）：

取碘化钾2 g及碘1 g置于研砵中，经研磨5～10秒钟后，加蒸馏水1 mL研磨，次加蒸馏水5 mL研磨，再加蒸馏水10 mL，研磨至碘化钾和碘完全溶于水中，将此溶液注入褐色瓶中，再以适量蒸馏水洗涤研砵及杵后，并入洗液，加蒸馏水使成300 mL。

2.2.27.8.3 哈克氏复染液（复染剂）：

取沙黄O 2.5 g溶于95%乙醇100 mL中，供作复染原液。使用时，取原液10 mL加蒸