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阪崎肠杆菌检验
GB 4789.40--2010
Enterobacter sakazakii(ES)
2
内 容
第一部分：一般特征 第二部分：致病性
第三部分：ES的检验
3
阪崎肠杆菌(E． sakazakii) 是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无 芽孢杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种，在一定 条件下可引起人和动物致病。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡 率高达50% 以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来 源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。
1.
干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时 可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落 可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。 光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。
2.
6
本实验室
1.
大多数分离株呈流蜡样， 粉紫色、圆形、光滑、凸 起、饱满，并散发出特殊 气味； 干燥、顶端发白的粉紫色 菌落； 从配方粉中初次分离到的 该 菌 在 VRBGA 平 板 上 过 夜 培养后呈现特殊的菌落形 态：菌落干燥、边缘有褶 皱，极富弹性。传代后， 菌落皱褶减少，延长培养 时间，可见皱褶逐渐增加。
14
二、主要感染渠道 ！！！
乳品安全标准（报批稿）
《婴儿配方食品》 《特殊医学用途配方食品》
0-6个月龄
15
第三部分
食品卫生微生物学检验
阪崎肠杆菌检验
本标准修改采用
1.
ISO/TS 22964 （ 1st edition 2006-02-01 ）Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii FDA July 2002; Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula
11
四、增殖能力
6℃，21℃，37℃分别是13.7h，1.7h，19－21min
研究发现，与本底相比，25℃ 放置6h 该菌的相对危
险性可增加30倍；25℃放置10h可增加30 000倍。
2004 年 2 月 FAO/WHO 在日内瓦召开的 PIF 中 ES 专家研 讨会上提出 PIF 中微量的 ES （ ＜ 3 CFU/100g ）污染 也能导致感染的发生。
选择性增菌
5.1 前增菌和增菌
BPW（合适时可选择无菌水） 左图：未混合； 右图：混合后。
21Biblioteka Baidu
mLST-Vm
mLST-Vm，即在大肠菌群增菌肉汤LST中另加入 适量的NaCl和Vm 。
研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希氏
菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能力。加入0.5 M 的
NaCl在保证ES良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他 细菌的生长。 Vm可有效地抑制G+菌的生长。而较高的生长温度可以进一 步抑制其他细菌的生长。
2.
17
第一法：阪崎肠杆菌的检验
第二法：阪崎肠杆菌的计数
18
第一法 阪崎肠杆菌的检验
19
阪崎肠杆菌检验程序
检样 100 g/mL+BPW稀释液 900 mL 36℃±1℃，18 h±2h
1mL + mLST-Vm 10mL 44℃±0.5℃，24 h±2h
DFI琼脂 36℃±1℃，24 h±2h 挑取蓝绿色菌落 TSA 25℃±1℃，48 h±4h 挑取黄色菌落 生化鉴定 报 告 生 化 鉴 定 选择性分离 前 增 菌
22
5.2 分离
显色培养基的基本原理相似，二者都是根据ES能产生α-葡萄糖苷
酶，分解底物XaGlc产生有色菌落。
23
显色培养基对 ES 的选择性较好， ES 形成的特征性菌 落易于辨认，以DFI为例：
硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量α-葡萄糖苷酶但H2S 阳性菌株（如普通变形杆菌）。
1.
2.
在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API 20E和Vitek GNI+。
典型ES：黄色
阴性对照E. coli ATCC 25922：白色菌落
27
5.3 鉴定（生化反应）
29
商业生化鉴定系统的应用
推荐使用的ES生化鉴定方法有很多，主要有API 20E，ID 32E，Biolog GN2 MicroPlate，VITEK GNI+等。
上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。
12
第二部分：致病性
一．
易感人群
二．
三． 四．
主要感染渠道
配方粉中ES的污染状况 PIF中ES的来源及中毒发生的原因
13
一、易感人群
婴儿：
1. 2. 3.
脑膜炎 坏死性小肠结肠炎 菌血症 严重的神经系统后遗症
高危人群：主要是婴儿，新生儿、尤其是早产儿、低出 生体重等免疫力低下的婴儿。
死亡率：50%，20-50 %
3.
ES都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落
其他常见菌在DFI平板的菌落颜色
a. 白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛 菌属的多种菌等 b. 黄色菌落：赫氏埃希氏菌 c. 黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种
• ESIA:蓝色，1-3mm • 国产显色培养基
24
26
黄色素 TSA： 25℃培养后
第一部分：一般特征
一．
培养特征
二．
三． 四．
生化反应
抵抗力 增殖能力
与其他常见肠杆菌相似
5
一、培养特征
阪崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、血平板、麦康凯(MacConkey， MAC)琼脂、伊红美蓝琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。
ES在VRBGA平板上首次划线分离时，37℃培养24h可生成2种不同的 形态学特征：
7
2.
3.
二、生化反应
8
DNASE-脱氧核糖核酸酶
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
10
三、抵抗力
耐热性
渗透压
干燥
不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消 毒过程能有效的灭活ES。 ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株， 增加PIF（婴儿配方奶）加工后污染的危险性，使其在PIF （婴儿配方奶） 中长期存活。
GB 4789.40--2010
Enterobacter sakazakii(ES)
2
内 容
第一部分：一般特征 第二部分：致病性
第三部分：ES的检验
3
阪崎肠杆菌(E． sakazakii) 是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无 芽孢杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种，在一定 条件下可引起人和动物致病。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡 率高达50% 以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来 源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。
1.
干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时 可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落 可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。 光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。
2.
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本实验室
1.
大多数分离株呈流蜡样， 粉紫色、圆形、光滑、凸 起、饱满，并散发出特殊 气味； 干燥、顶端发白的粉紫色 菌落； 从配方粉中初次分离到的 该 菌 在 VRBGA 平 板 上 过 夜 培养后呈现特殊的菌落形 态：菌落干燥、边缘有褶 皱，极富弹性。传代后， 菌落皱褶减少，延长培养 时间，可见皱褶逐渐增加。
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二、主要感染渠道 ！！！
乳品安全标准（报批稿）
《婴儿配方食品》 《特殊医学用途配方食品》
0-6个月龄
15
第三部分
食品卫生微生物学检验
阪崎肠杆菌检验
本标准修改采用
1.
ISO/TS 22964 （ 1st edition 2006-02-01 ）Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii FDA July 2002; Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula
11
四、增殖能力
6℃，21℃，37℃分别是13.7h，1.7h，19－21min
研究发现，与本底相比，25℃ 放置6h 该菌的相对危
险性可增加30倍；25℃放置10h可增加30 000倍。
2004 年 2 月 FAO/WHO 在日内瓦召开的 PIF 中 ES 专家研 讨会上提出 PIF 中微量的 ES （ ＜ 3 CFU/100g ）污染 也能导致感染的发生。
选择性增菌
5.1 前增菌和增菌
BPW（合适时可选择无菌水） 左图：未混合； 右图：混合后。
21Biblioteka Baidu
mLST-Vm
mLST-Vm，即在大肠菌群增菌肉汤LST中另加入 适量的NaCl和Vm 。
研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希氏
菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能力。加入0.5 M 的
NaCl在保证ES良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他 细菌的生长。 Vm可有效地抑制G+菌的生长。而较高的生长温度可以进一 步抑制其他细菌的生长。
2.
17
第一法：阪崎肠杆菌的检验
第二法：阪崎肠杆菌的计数
18
第一法 阪崎肠杆菌的检验
19
阪崎肠杆菌检验程序
检样 100 g/mL+BPW稀释液 900 mL 36℃±1℃，18 h±2h
1mL + mLST-Vm 10mL 44℃±0.5℃，24 h±2h
DFI琼脂 36℃±1℃，24 h±2h 挑取蓝绿色菌落 TSA 25℃±1℃，48 h±4h 挑取黄色菌落 生化鉴定 报 告 生 化 鉴 定 选择性分离 前 增 菌
22
5.2 分离
显色培养基的基本原理相似，二者都是根据ES能产生α-葡萄糖苷
酶，分解底物XaGlc产生有色菌落。
23
显色培养基对 ES 的选择性较好， ES 形成的特征性菌 落易于辨认，以DFI为例：
硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量α-葡萄糖苷酶但H2S 阳性菌株（如普通变形杆菌）。
1.
2.
在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API 20E和Vitek GNI+。
典型ES：黄色
阴性对照E. coli ATCC 25922：白色菌落
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5.3 鉴定（生化反应）
29
商业生化鉴定系统的应用
推荐使用的ES生化鉴定方法有很多，主要有API 20E，ID 32E，Biolog GN2 MicroPlate，VITEK GNI+等。
上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。
12
第二部分：致病性
一．
易感人群
二．
三． 四．
主要感染渠道
配方粉中ES的污染状况 PIF中ES的来源及中毒发生的原因
13
一、易感人群
婴儿：
1. 2. 3.
脑膜炎 坏死性小肠结肠炎 菌血症 严重的神经系统后遗症
高危人群：主要是婴儿，新生儿、尤其是早产儿、低出 生体重等免疫力低下的婴儿。
死亡率：50%，20-50 %
3.
ES都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落
其他常见菌在DFI平板的菌落颜色
a. 白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛 菌属的多种菌等 b. 黄色菌落：赫氏埃希氏菌 c. 黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种
• ESIA:蓝色，1-3mm • 国产显色培养基
24
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黄色素 TSA： 25℃培养后
第一部分：一般特征
一．
培养特征
二．
三． 四．
生化反应
抵抗力 增殖能力
与其他常见肠杆菌相似
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一、培养特征
阪崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、血平板、麦康凯(MacConkey， MAC)琼脂、伊红美蓝琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。
ES在VRBGA平板上首次划线分离时，37℃培养24h可生成2种不同的 形态学特征：
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2.
3.
二、生化反应
8
DNASE-脱氧核糖核酸酶
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
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三、抵抗力
耐热性
渗透压
干燥
不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消 毒过程能有效的灭活ES。 ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株， 增加PIF（婴儿配方奶）加工后污染的危险性，使其在PIF （婴儿配方奶） 中长期存活。