PikoReal使用培训-致病菌检测教学文稿

5’
3’
5’
3’
3’
5’
Excitation Excitation
RR
Q
Q
3’
5’
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特异性荧光探针 – Taqman probes
常用的标记探针的染料： 第一通道：FAM 第二通道：HEX 第三通道：Rox 第四通道：CY5
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特异性荧光探针 – Taqman probes
致病微生物：
沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 单核细胞增生李斯特氏杆菌 肠毒素大肠杆菌 阪崎肠杆菌 弯曲杆菌（禽类） 肉毒梭菌 志贺氏菌 小肠结肠炎耶尔森菌、 霍乱弧菌 副溶血弧菌 创伤弧菌等
• DNA：从 animal, plant, bacteria, yeast, virus中抽提 • RNA：抽提后逆转录为cDNA(也在PCR仪上完成）
• 引物（一对或多对）
• 脱氧核糖核苷酸 (dNTP原料) • 热稳定的DNA聚合酶 • Buffer （缓冲液提供适合的酶作用环境）
PCR kit
食品检验
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PCR技术的优点与缺点
缺点：
•扩增与检测分开进行→ 繁琐 •使用荧光染料EB检测DNA → 有毒 •不同实验室之间结果没有可比性 •通量太低
扩增
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检测
PCR技术的优点与缺点
缺点：
很难准确得到样本内模板DNA或RNA的量 终点的产物量不一定能如实反应和起始模板量的对应关系
PCR反应进入平台期， 合成新链的原料开始不 足，酶的活力也下降， 导致新增DNA的量增长 缓慢，最后停止增长。
相同模板在同一台PCR仪上相同条件下 重复96次扩增的扩增曲线图
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荧光定量PCR —— 基本原理 —— 荧光染料和探针 —— 应用介绍
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荧光定量PCR —— 基本原理
光源
模板，引物,dNTP, 缓 冲液,DNA聚合酶和 荧光探针或荧光染料
热循环仪
加入荧光染料 的PCR体系
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探测器
可以实时检测出每轮循Hale Waihona Puke Baidu 的PCR产物量
• 反应体系：5 - 50ul （常用）
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PCR的基本原理
PCR实验流程图: A
模板，引物,dNTP, 缓 冲液,DNA聚合酶
上样
PCR反应
10
PCR的基本原理
PCR实验流程图: B
PCR产物电泳，EB染色
+
11
PCR的基本原理
PCR实验流程图: C 凝胶成像系统成像，定终产物浓度 – 半定量
一种DNA片段只有一个特定的Tm，所以通过溶解曲线分析，可以检 验扩增的产物是否是目的片段
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非特异性荧光染料 – SYBR- Green
应用列举：酵母菌检测
根据Tm值判断是否是酵母菌
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特异性荧光探针 – Taqman probes
Sequence Specific Probes: Taqman probes
PikoReal使用培训-致病菌检测
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PCR和定量PCR —— 基本知识介绍
生命的遗传物质DNA（少数物种为RNA），对于不同 的物种来说，其碱基排列顺序是独一无二的 检测不同生物中特异的DNA片段，就可以清楚的区分不 同的生物。
3
中心法则
4
碱基配对原则
Polymerase Chain Reaction（PCR） ——聚合酶链式反应
体外的DNA 复制
PCR 反应
体外RNA 逆转录为CDNA
RT- PCR 反应
通过PCR或RT-PCR反应，就可累计大量的 特异性目的片段，用于下游的检测和研究
5
PCR的基本原理
6
PrimExetMresneBsltionndg 759284C
PCR的基本原理
Polymerase Chain Reaction（PCR） ——聚合酶链式反应
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PikoREAL 的硬件系统:
光源: 5x LED
• 寿命长，终身无需更换，为qPCR实验提供持续，稳定的激发信号 • 无需使用ROX染料进行光强校正
探测器：CCD 相机
• 能同时快速收集整板多重荧光信号数据 • 高灵敏度
PCR模块：96孔半导体PCR
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功能：
绝对定量
相对定量
熔解曲线分析
基因型分析
Excitation
SG
SG
3’
Emission
SG
3’
5’
SG
SG
21
非特异性荧光染料 – SYBR- Green
SYBR-Green I
Excitation
22
SG
5’ 3’
SG
Emission
SG SG
3’ 5’
SG
非特异性荧光染料 – SYBR- Green
融解曲线分析（Tm）
Tm
Tm：50%的DNA产物解链时的温度
HRM法
双探针法
选配模块 32
五通道四色：
激发波长 (nm) 475–500 515–535 570–590 600–640 475–500
发射波长 (nm) 520–550 557–590 615–650 666–740 520–590
预校正的染料 FAM, SYBR Green HEX, Yakima Yellow ROX, Texas Red
7
PCR的基本原理
• 在PCR反应过程中，升温，降温交替进行，循环往复 —— 热循环 • 提供热循环环境的仪器 —— 热循环仪（PCR仪）
Melt
Melt
Temperature
Copy
Copy
Anneal Cycle 1
Time
Anneal Cycle 2
8
PCR的基本原理
PCR 反应体系
• 模板（DNA or RNA）
两种产物
多种产物
两对特定引物扩增的片段
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非特异性引物扩增出一系列片段
PCR应用
• PCR是当今应用最广泛的生物技术之一
• 几乎所有的分子生物学实验室，药物研发中心，临床诊断实验室都在 使用PCR技术，而且还有新的应用方向不断开发出来
几个重要的应用领域:
•
科学研究
•
•
医学研究及诊断
•
•
法医鉴定
•
•
区别： 普通PCR：可以粗略定出反应结束时终产物的量- 半定量 荧光定量PCR仪：可以精确测量出初始模板量
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荧光定量PCR —— 荧光染料和探针
• 非特异性的荧光染料 SYBR Green I
• 特异性的荧光探针 TaqMan
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非特异性荧光染料 – SYBR- Green
SYBR-Green I 5’
均能把3-5天的检测时间缩短到一天之内
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单重和多重荧光定量PCR
•单通道（单色）：一个PCR管里只做一个基因定量（多用SybrGreen） •双通道（两色）：一个PCR管里做两个基因的定量
常用
•多通道（多色）：一个PCR管里做三个以上基因定量
FAM HEX
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PikoReal 功能简介
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研发生产中心：位于芬兰Espoo