SDS-PAGE蛋白电泳方法

SDS-PAGE

一. 实验原理

SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。

二. 试剂器材

30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；

注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。

分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；

电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；

2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中

0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL

10%SDS溶液 4.0mL

甘油 2.0mL

巯基乙醇 2.0mL

溴酚蓝 0.02g，

混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；

10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；

TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；

水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。上层相即水饱和正丁醇，室温下可长期保存。

染色液(100mL)：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入双蒸水40.0mL、甲醇50.0mL 和乙酸10.0mL，搅拌溶解后滤纸过滤除去不溶颗粒；

脱色液(1L)：分别取甲醇50mL和乙酸75mL，加双蒸水875mL稀释。

其他器材：

容量瓶(1L、100ml、10ml)、烧杯、离心管(15ml、1.5ml)、移液器、移液器吸头、干燥器、涡旋振荡器和废液缸等。

分离胶配方(100mL，4块胶)

贮液分离胶中丙烯酰胺的终浓度(%)

8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 凝胶贮液(mL) 26.67 30.00 33.33 36.67 40.00 43.33 46.67 50.00 53.33 56.67 60.00 分离胶缓冲液(mL) 25

双蒸水 (mL) 46.53 43.20 39.87 36.53 33.20 29.87 26.53 23.20 19.87 16.53 13.20 10%SDS (mL) 1.0

10%AP (mL) 0.75

TEMED (mL) 0.05 (抽气后添加)

堆积胶配方(40mL，4块胶)

堆积胶中丙烯酰胺的终浓度(%)

贮液

3.0

4.0

5.0

凝胶贮液(mL) 4.00 5.36 6.66

分离胶缓冲液(mL) 10.0

双蒸水(mL) 25.36 24.00 22.70

10%SDS(mL) 0.4

10%AP(mL) 0.2

TEMED(mL) 0.04 (抽气后添加)

三. 操作步骤

样品处理：

在密封的螺盖微量离心管中，用2×加样缓冲液按1:1稀释蛋白质样品溶液，于100℃煮沸3-5min，分子质量标准品也经上述处理。

凝胶制备：

将玻璃板用蒸馏水清洗干净，再用75%的酒精去脂，干燥后固定在灌胶支架上；

配制12%的分离胶，加入TEMED前抽真空10min以除去丙烯酰胺溶液中的空气；加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入安装好的玻璃板的间隙中，

给堆积胶留出约1cm的空间。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的正丁醇，以防止空气扩散到凝胶中抑制聚合作用，并保证凝胶表面水平；在室温条件下，凝胶应在30min-50min内聚合完成。凝胶聚合后凝胶和上层液相之间可见折射率的变化；

倒掉覆盖层并用蒸馏水清洗凝胶顶部数次，并用滤纸条吸净残留的蒸馏水，注意勿破坏凝胶表面；制备堆积胶并迅速注入分离胶上，立即插入干净的梳子，不要混入气泡，以一定的角度将梳子插入堆积胶能减少气泡的产生。堆积胶聚合后小心移去梳子，避免破坏加样孔，用蒸馏水小心清洗加样孔，以除去未聚合的丙烯酰胺。

加样：

将凝胶固定在电泳装置上，电泳上槽内加入电泳缓冲液没过加样孔，并检查有无渗漏。倾斜整个装置以赶走凝胶下面可能留有的气泡；按预定顺序加样，每孔加入20μL，在对照孔中加入分子质量标准品6-7 μL，如有空置的加样孔，加入等体积的1×加样缓冲液。

电泳：

将电泳装置与电源相连，正极接下槽、负极接上槽进行电泳，样品在堆积胶阶段电压为80V，而在分离胶阶段电压调整为120V。直到溴酚蓝到达分离胶的底部后，关闭电源，断开电极。从电泳装置上卸下玻璃板，用小铲子剥下凝胶后切除一角以标注凝胶方位。

染色：

将凝胶浸泡在染色液中，置于摇床上染色4hr，染色液可回收重复利用。脱色：

染色结束后，将凝胶浸泡在脱色液中，置于摇床上脱色过夜，其间更换脱色液3次.

记录：

将显示蛋白条带的凝胶用凝胶成像仪拍照，记录试验结果，并根据分子质量标准品计算目标蛋白的分子量。