第五章 工业微生物育种诱变剂

于平皿——适温培养——挑取单菌落，进行筛选。
2.与辐射线复合处理 据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理， 使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变 效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一 种辐射诱变的增敏剂。
二、化学修饰碱基的诱变剂

改变碱基结构的化学修饰剂：脱氨剂、羟化剂 常见的碱基修饰剂
第五章 工业微生物育种诱变剂 本章内容：
化学诱变剂
物理诱变剂
生物诱变剂
•诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微 生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。

诱发突变(induced mutation)的发现

1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。

在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变
沸点53℃/5mmHg
84
117
亚硝基甲基脲(NMU)
硫酸二乙酯(DES) 亚硝基胍(NTG)
黄色固体
无色油状 物 黄色固体 不易溶 熔点118℃ 3.34
35
1 0.5
103
• 几种常用的烷化剂：
1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（简称亚硝基胍，NTG或NG或 MNNG） 为黄色结晶状物质，性质不稳定，遇光易分解，放出NO， 颜色由黄色变为绿色，诱变效应降低。须保存在棕色瓶中， 并在避光、干燥、低温条件下贮存。 NTG不溶于水，须加助溶剂，使用时现配现用。 NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效 果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。其中处理细菌、放线 菌等微生物时，不经淘汰，就可以直接得到10%以上的营养缺陷 型突变株。而用一般诱变剂处理只能达百分之几至千分之几。
反应，引起鸟嘌呤从DNA分子上脱落下来，使DNA链上碱基空 缺，在以后的复制过程中其它游离碱基有可能错误掺入。
GC就可能变为任何碱基对
G:C——A:T转换及G:C——C: G或G:C——T: A 颠换而导致 突变。
由于烷基化后的鸟嘌呤，易离子化，由原来的酮式变为 不稳定的烯醇式，不能和胞嘧啶配对，而是与胸腺嘧啶错误
套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在
通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、
单独处理，例如用自来水大量冲洗或用1—
2mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡过夜，洗净。

甲基磺酸乙脂（EMS）
使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结果产生的
G C
O-6-E-G T
A T
T A
O-4-E-T G
33
• 烷化剂的性质
——烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发 生水解。 ——它们大部分半衰期很短，其长度与温度、溶液pH关系 很大。因此，化学诱变剂要现用现配。 ——不少烷化剂见光后，容易发生光化学反应，和水解作用 一样，有的分解产物会失去诱变作用或具毒性。因此，保藏 时要注意避光，臵棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。 ——另外，配制烷化剂溶液时，要采用合适的pH缓冲液。
5-BU掺入后的复制错误
A:T
G ≡ BUe G≡ C
G≡ C
A: BUk
A:T
A:T
G ≡ BUe
A=BUk
A=T
G ≡ BUe
G ≡C A: T → G ≡ C
G ≡ BUe
G ≡ C→A=T
10
•由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因
此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。
•细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子，
配对，结果发生G:C——A:T转换而导致突变。
烷 化 鸟 嘌 呤 的 碱 基 配 对
烷化剂除了以上诱变作用之外，还有可能使两个鸟嘌呤 N7位点形成共价键，一般双功能烷化剂容易引起DNA双链间的 交联，造成变异或死亡。
鸟嘌呤通过N7位点的共价结合而发生交联
•总结鸟嘌呤N7位点的 烷化作用
烷化剂作用： 通过对鸟嘌呤N7位点的烷化而导致突变有三 烷化嘌呤引起碱基配对错误， 脱嘌呤作用， 鸟嘌呤的交联作用
烷化剂的某些性质
理化特性
烷化剂名称 状态 水溶性 溶点或沸点 20℃ 30℃ 37℃
pH7水中半衰期/h
分子 量
甲基磺酸乙酯(EMS)
无色液体
约8%
沸点 85~86℃/10mmHg
93
26
10.4
124
乙烯亚胺(EI)
无色液体
易溶于水
沸点56℃/760mmHg
43
亚硝基乙基脲(NEU)
粉红色液
约5%
多功能烷化剂
部分烷化剂 和 烷化碱基 部分烷化剂
甲基磺酸甲酯 烷化碱基
亚硝基乙基脲
7-甲基鸟嘌呤
3-甲基腺嘌呤
O6-甲基鸟嘌呤
26
• 烷化剂的诱变机制
——烷化剂主要使通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸 部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。
碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤N7是最易 起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；甲基TG不溶于水，配制需加助溶剂甲
酰胺或丙酮少许，然后加缓冲溶液，其比例为9：1（缓
冲溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml），一般NTG母液浓度配成 1mg/ml。使用时取母液0.2ml，加菌悬液1.8ml，NTG最后
处理浓度为100μg/ml。一般处理浓度随菌种不同而异，
通常细菌为100—1000μg/ml，而放线菌、真菌孢子为 1000—3000 μg/ml 。 3.将以上菌悬液和NTG溶液混合于一试管内，臵该菌生长 适宜的温度下保温处理若干时间。
• 取孢子悬液1ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及0.1mol/L亚硝酸钠溶 液1ml，最后处理浓度为0.025mol/L。于25—26℃保温10— 20min，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠溶液20ml，使 pH下降至6.8左右，以终止反应。稀释分离于平板。
• 如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05mol/L为例：将
G:C转换，进行逆向突变。 A:T的专一性诱变剂，因 G:C还是G:C
A:T

由于羟胺是诱发G:C
此，可以用来鉴别突变体是A:T
A:T转换。

羟胺的处理方法：常用浓度为0.1—5%，可直接
在溶液中处理，时间1—2h，然后分离培养。但一般 都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或 细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度
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亚硝酸诱发的突变
HNO2 A T H C G C G C HNO2 A U A T
A:T
G┆C
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亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液
（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液 （3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
通常在pH6.0的条件下进行诱变处理。由于酸碱条件影响NTG 的诱变效果，因此，无论是配制NTG溶液，还是制备均悬液都 要用适宜的缓冲溶液。常用的由磷酸缓冲液和Tris缓冲液.
NTG的诱变处理方法：
1.取新鲜的斜面，用一定pH值的缓冲液或Tris缓冲液洗 下细菌制成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子 （真菌或放线菌）须进行前培养，可用有关培养基代替 以上缓冲液，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动 阶段，经离心、洗涤，用缓冲液制成悬液，浓度约在 106-107ml-1；
（a）亚硝酸（b）羟胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍
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1．脱氨剂

亚硝酸（nitrous acid）是典型的脱氨剂
亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子
G C A 黄嘌呤X（xanthine ） U 次黄嘌呤H
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亚 硝 酸 的 脱 氨 基 作 用 及 其 诱 发 的 突 变
4.终止反应。用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温 下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作
成一定稀释度分离于平皿。 处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸
泡处理。
除以上直接以溶液处理外，也可以进行如下方法诱变处理： 1.摇瓶振荡处理
2.在平皿上生长过程处理
•NTG是一种强烈的致癌物质，操作时要带橡皮手

化学诱变剂种类：碱基类似物、碱基修饰剂、移码突变
4
一、碱基类似物 base
analogue
碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似

主要诱变剂：5-溴尿嘧啶（5-BU） /T
2-氨基嘌呤（2-AP） /A

诱发的突变：AT
GC的转换。
1.
2.
5
碱基类似物是如何提高突变频率的?
在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进 DNA分子 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配 的概率也高
比直接处理时低些。
3．烷化剂
——烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂， 这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，它们易取代DNA 分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反 应，从而改变DNA分子结构，引起突变。 烷根 基据 的烷 数化 目剂 中 活 性 单功能烷化剂 亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、 重氮烷类、乙烯亚胺类化合物 双功能烷化剂 硫芥子、氮芥子类等
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（一）碱基类似物的诱变机制
——现以5-BU为例来分析碱基类似物的诱变机制。当胸 腺嘧啶分子结构中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取 代，就构成了5-BU的结构式。
5-溴尿嘧啶（5-BU）的结构
5 溴 尿 嘧 啶 （ 5 ） 的 碱 基 配 对
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-BU

诱发的突变