01 肺癌基因检测

ARMS引物与突变DNA模板链进行匹 配，并使Taq DNA聚合酶启动PCR反 应。
突变的ARMS引物与野生型DNA 模板不匹配。
组织EGFR检测推荐使用ARMS方法
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ddPCR（微滴数字PCR）
微滴化实现靶标DNA 的富集
高灵敏度，更适用 于待测序列与背景核 酸高度相似（如肿瘤 突变检测）的样本
Clinical Report
Sequence data analysis
3
Application Specific Analysis
2
Secondary Data
Analysis
1
Primary Data
Analysis
• Read counting • Variant calling
• Guided assembly
ARMS
dPCR
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直接测序法
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ARMS PCR
ARMS PCR（amplification refractory mutation system，扩增阻碍突变系 统），根据已知点突变设计引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱 基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。
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Data from PQCC and EMQN (2015)
目录
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01 肺癌精准医学背景 02 EGFR检测在NSCLC的应用 03 检测路径的优化 04 检测质量控制
不同的临床治疗需求选择合适的检测方法
4.0
19
43.2
20
7.6
21
45.0
Other
0.3
According to COSMIC (v54)2
19号外显子缺失突变、21号外显 子L858R点突变及20号外显子突
变占EGFR突变约 90%
EGFR检测方法
各种检测技术百 花争鸣
NGS
Sanger Seq
FISH
dPCR
IHC
ARMS CTC
NGS技术原理示意图
Sample Preparation
DNA
Extraction
FFPE FFZN Whole Blood
rtPCR
RNA
“Library” Preparation
Multiplexing “sample DNA
labeling”
Fragmentation Target enrichment Attach barcode adaptors
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S.L. Wood et al. Cancer Treatment Reviews 41 (2015) 361–375
肺癌精准治疗
同病同治
同病异治
核心点：精准诊断
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肿瘤精准诊疗的典范-肺癌为例
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1. Langer CJ. J Clin Oncol. 2013;20;31(27):3303-3306. 2. Yu HA, et al. Clin Cancer Res. 2013;19(8):2240-2247.
从单一的定点检测发展到如今的动态监测
I. 位点鉴定-ARMS
II. 丰度定量-ddPCR，NGS
目录
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01 肺癌精准治疗 02 EGFR检测在NSCLC的应用 03 检测路径的优化 04 检测质量控制
耐药相关突变
敏感相关突变
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EGFR
Exon Distribution (%)
18
HER2 +T790M突变
4%
MET 扩增
HER2突变8% 3%
未知18%
获 小细胞+MET
得
扩增1%
性 小细胞1%
耐
药 小细胞+T790M
1
突变 2%
T790M突变 60%2
MET扩增+T790M
-1
4
9
14
突变 3%
PFS（月） 一线EGFR-TKI治疗8至14个月后进展，约 2/3 EGFR-TKI耐药患者发生T790M突变
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Hamburg, M.A. and F.S. Collins, New England Journal of Medicine, 2010. 363(4): 301-304.
肺癌精准诊断———从组织分型到分子分型
Genotyping and genomic profiling of non-small-cell lung cancer implications for current and future therapies . J Clin Oncol. 2013 Mar 10;31(8):1039-49.
方法学
19
dels （n=2 60）
L858R （n=2 53）
T790
M （n=2 46）
ddPC R
48%
28% 57%
血浆 Leabharlann BaiduIAG EGFR EN 突变 ARMS
37%
20% 15%
P值
P<0.0 P<0.0 P<0.0
01
01
01
IV. 实时监测，早期诊断，预后参考
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Ashley J. Vargars, Nature Review Cancer 2016;16: 525–537
靶点选择越精确，患者治疗越获益
ECOG1594
含铂两药化疗 (N=1207)1
JMDB
顺铂/培美曲塞 (N=618)2
IPASS
卡铂/紫杉醇 (N=608)3
8.0
未经选择人群
11.8 非鳞癌患者 17.4 腺癌、不吸烟患者
1. Qiong Z, et al.. Lung Cancer. 2015;87(2):117-121. 2.朱雄增. 临床与实验病理学杂志.2012;28(3):241-243. 3.中国非小细胞肺癌血液EGFR基因突变中国专家共识.中华医学杂志.2015;95(45):3721-3725. 4. Kohno T, et al.. Transl Lung Cancer Res. 2015;4(2):156-164.
检测限下限 1%
0.01%
数据能否量化 半定量（需有标准基线校正） 可量化
实验操作难度 *
**
数据解读难度 *
*
出报告时间
3-4天
3-4天
价格
**
**
CFDA认证
V
-
动态检测
V（需有标准基线校正）
V
新靶点探寻 -
-
耐药机制探寻 -
-
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NGS
已知和未知突变 SNV、InDel、CNV、gene fusion 多个基因或全外显子测序 0.3% 可量化 *** ***（专业实力差距大） 7-15天 *** V V V
基因检测在肺癌诊治中的应用
江苏省肿瘤医院 冯继锋
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目录
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01 肺癌精准治疗 02 EGFR检测在NSCLC的应用 03 检测路径的优化 04 检测质量控制
精准医学
精准医学（precision medicine），又称为个体化医疗（personalized medicine），是 指基于每个个体的基因差异而制定的个性化治疗方案。 它的实质包括精准诊断和精准治疗两个方面。
适合复杂样品的检 测，终点PCR检测不 依赖Ct值，不依赖扩 增效率，无需内参
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Digital PCR技术优势
I. 灵敏度高，适合低丰度ctDNA
0.03%
III. 绝对定量，线形范围广
II. 一致率高，血浆检出率接近组织
Impre ss
Study
国内EGFR突变检测技术的应用现状
2015年PQCC（中国）质控项目
2015年EMQN（全球）质控项目
1% 1%
19%
1% 1%
77%
ARMS pcr-荧光探针法 液相芯片 一代测序 pcr-熔解曲线法 荧光pcr-HRM 法
2% 1%
15%
82%
ARMS pcr-荧光探针法 一代测序 液相芯片
PQCC质评/CNAS：肿瘤EGFR/KRAS/BRAF基因突变（153家医院） ARMS法：是目前临床应用最为广泛认可的方法
EGFR突变是亚洲人群中最主要的NSCLC驱动基因
KRAS 突变
(7%)
其他
EGFR 突变 (10%)1
野生型 (69%)
小细胞肺 癌15%
大细胞肺癌 10%
鳞癌 25%5
腺癌 50%2,3
其他突 变35%
KRAS 突变 10%
EGFR突 变55%4
腺癌 鳞癌 大细胞肺癌 小细胞肺癌
非小细胞肺癌约占肺癌的85%，EGFR在非小细胞肺癌的突变率约为40%。
选择性人群
NEJ002
易瑞沙 EGFR基因敏感突变患者 (N=114)4
WJTOG3405
易瑞沙 EGFR基因敏感突变患者 (N=86)5
27.7
突变人群
35.5
0
5
10
15
20
25
30
35
中位生存期 (月)
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1. Schiller JH, et al. N Engl J Med 2002; 346:92-98. 2. Scagliotti GV, et al. J Clin Oncol 2008; 26:3543-3551. 3. Yang CH, et al. Presented at 2010 ESMO. 4. Inoue A, et al. 2011 ASCO Abstract 7519. 5. Mitsudomi T, et al. Lancet Oncol 2009; DOI:10.1016/s1470-2045(09)70364-X.
Ying Jin, etal. Oncotarget, 2016(7), 38. JSCH-BDD All rights Reserved.
EGFR检测方法比较
ARMS PCR
ddPCR
突变类型覆盖 已知突变
已知突变
变异类型
SNV、InDel
SNV、InDel
测序范围
单一基因或数个基因
单一基因或数个基因
“全程化分子检测”将成为NSCLC精准诊疗的发展趋势
肺腺癌人群
经驱动基因 筛选分类
检测结果 指导用药
动态监测用药 变化
初治分子诊断 耐药分子诊断
组织检测 组织检测
血液检测 血液检测
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Mitsudomi T, et al. Nav Clin Oncol. 2013 10(4):235-244.
• Quality Control
• Image processing
• Signal processing
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Sequencing
NGS用于多基因的检测
1. NGS检测到36.1%患者含有T790M突变(深度 影响检测率)，且这些患者都检测到EGFR敏感突 变。 2. 在无T790M突变的患者中，检测到许多旁路 基因发生突变。
单一位点的定点检测
突变正向引物 A
突变正向引物 G
突变DNA模板 野生DNA模板
ctDNA动态跟踪肿瘤的变化
ctDNA
Tumor volume
ctDNA丰度的变化和影像学肿瘤大小的变化相对应, 甚至能更精确反映真实情况
ctDNA 中检测出T790M突变的 中位时间早于临床PD2.2 个月
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5.吴东平,等.实用肿瘤杂志.2014;29(5):408-412.
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第一、二代EGFR TKI耐药机制
IPASS：吉非替尼 First-SIGNAL：吉非替尼 WJTOG 3405 ：吉非替尼 NEJGSG002：吉非替尼
OPTIMAL：厄洛替尼 EURTAC：厄洛替尼 LUX-Lung 3：阿法替尼 LUX-Lung 6：阿法替尼
Newman AM et al. Nat Med. 2014 May;20(5):548-54.
单基因到多基因，同一基因单次检测到多次检测
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NSCLC推荐检测基因：EGFR、ALK、ROS1以及PD-L1 对于EGFR突变患者出现疾病进展后要先进行T790M基因检测