食品中致病性弧菌的检测和计数NMKL No 156

食品中致病性弧菌的检测和计数

该NMKL法尚未经协同研究证实

1.适用范围

本法可用于检测和计数食品中的副溶血性弧菌，霍乱弧菌，刨伤弧菌和溶藻弧菌。

这些对人类有致病性的弧菌可能由粪便污染或水源受到污染而在食品中出现。在食品，尤其是贝类、蜊蛄和鱼的微生物学控制和与疾病爆发有关的微生物学调查中可能需要对该菌进行检测。

2.定义

弧菌是兼性厌氧，有动力，革兰氏阴性，常呈逗号形的杆菌。钠离子是大多数菌株（霍乱弧菌除外)所必需的一种生长因子。大多数菌种为氧化酶阳性，过氧化氢酶阳性，发酵葡萄糖不产气。它们一般出现于盐浓度范围较宽的水域环境及海洋动物的表面和肠道中。一些菌株也可在淡水中发现(霍乱弧菌)。

副溶血性弧菌呈现下列的生物化学反应模式：氧化酶阳性，在42℃生长，精氨酸脱氢酶阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，不发酵蔗糖但可将硝酸盐还原为亚硝酸盐。可发酵糖类但不产气。在盐(氯化钠)浓度为6％时不能生长。

霍乱弧菌有如下的生物化学反应特性：氧化酶阳性，在42℃生长，缺少精氨酸脱氢酶，发酵蔗糖，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐。在无钠离子时可以生长。在盐浓度为3％时可以生长，而盐浓度为8％时不能生长。

创伤弧菌呈现如下的生物化学反应模式：氧化酶阳性，在42℃生长，缺少精氨酸双水解酶，赖氨酸脱羧酶阳性，不能发酵蔗糖但可将硝酸盐还原为亚硝酸盐。在无盐或盐浓度为8％的培养基中不能生长。

溶藻弧菌见表1。

所有弧菌在不同程度上都会受到0／129弧菌抑制剂(0／129 Vibrostaticum)的抑制。

3.参考文献

NMKL Method No.91，2nd ed.1988：Pretreatment of foods for microbiological examination.

NMKL Report No.5，2nd edition，1994：Quality Assurance Guidelines for Microbiological Laboratories.

4.原理

将欲检测该菌的已知量的食品接种于一种液体选择性培养基中，培养后涂布样品于一种固体选择性培养基上。

可疑菌落经进一步生物化学检验。

此外，可将已知量的可疑食品直接接种于一种选择性固体培养基上进行定量测定。

5. 培养基和试剂

5.1稀释剂

将8.5g氯化钠和1.0 g蛋白胨溶于1000mL蒸馏水中并煮沸，调节PH使之灭菌后25℃为7.0±0.2。分装稀释剂于试管或广口瓶中以使12l℃高压灭菌20min 后分别含9.0±0.2ml和90±2ml。

5.2液体选择性培养基

5.2.1含2％盐的碱性蛋白胨水

酵母浸膏3g

蛋白胨10g

氯化钠20g

蒸馏水至1000ml

高压灭菌后25℃时PH为8.6±0.2。

倾入250ml的锥形瓶中，每瓶200ml，121℃高压灭菌15min。

5.2.2. 盐多粘菌素肉汤

酵母浸膏3g

胰蛋白胨10g

氯化钠20g

蒸馏水至1000ml

将各成分加热溶解，调节PH以使灭菌后25℃时最终PH为8.6±0.2。121℃高压灭菌15min。使用前加入多粘菌素B，250IU／ml。当检查含菌量较低的食品时，仅加25IU／ml。倾入250ml的锥形瓶中，定性测定时每瓶200ml，5℃以下保存。

5.3.固体选择性培养基

5.3.1.硫代硫酸盐柠檬酸盐蔗糖琼脂(TCBS)

蛋白胨l0g

酵母浸膏5g

柠檬酸钠l0g

硫代硫酸钠l0g

牛胆汁，干的5g

脱氢胆酸钠3g

蔗糖20g

Nacl l0g

柠檬酸铁1g

麝香草酚兰0.04g

溴麝香草酚兰0.04g

琼脂14g

蒸馏水至1000ml

加热溶解各成分，25℃时调节PH至8.6±0.2。煮沸灭菌（不是高压灭菌）15min。

5.4.用于对纯培养的可疑细菌进行诊断的培养基，抗生素试验和试剂

5.4.1.Hugh-Leifson, 盐葡萄糖培养基(O／F培养基)

蛋白胨2g

氯化钠20g

磷酸氢二钾0.3g

溴麝香草酚兰0.08g

琼脂 2.5g

蒸馏水至1000ml

25℃时调节PH至7.1+0.2, 121℃高压灭菌15min。加入l0ml含l0g葡萄糖的水溶液（过滤除菌）。

5.4.2.胰蛋白胨肉汤

胰蛋白胨10g

氯化钠20g

蒸馏水至1000ml

将各成分溶于水中121℃灭菌15min。

5.4.3.弧菌抑制剂（Vibrostaticum）

将菌株越过血琼脂(5.4.4)直径划一条线接种(8.5.3)后，在该划线上放一含150 μg二氨基二异丙基碟啶的0／129弧菌抑制剂园纸片。

5.4.4.血琼脂

蛋白胨10g

肉浸膏5g

氯化钠7g

琼脂15g

蒸馏水至1000ml

在25℃调节PH至7.4±0.2，121℃高压灭菌15分钟，然后于45±1℃水浴中冷却，加入加热至同一温度的5％脱纤维蛋白的小牛血。倾注陪替氏皿前小心地将血与熔化的培养基混合。该血必须来自小牛或幼牛。

5.4.5.氧化酶试剂

盐酸对氨基二甲基苯胺(TMPD) 1.0g

抗坏血酸100mg

蒸馏水100ml

将抗坏血酸溶于冷水中并加入1gTMPD，加约5～8m1该试剂于试管中，然后将其冷冻。用前将试剂融化并用银纸包裹避光，在这些条件下氧化酶试剂可在冰箱中保存约l周。也可使用商售的氧化酶试纸条。

也可使用相当于5.4提供的各成分的脱水培养基，如使用这种培养基，必须