凋亡相关基因Survivin在非小细胞肺癌中的表达及意义

凋亡相关基因Survivin 在非小细胞肺癌中的表达及意义

张晓燕蒋军广翟展艺郑元元刘瑞芬张婧雯杨超孙曼

（郑州大学第一附属医院河南省呼吸疾病研究所河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南郑

州450052）

〔摘

要〕目的

研究Survivin 在非小细胞肺癌（NSCLC ）中的表达及临床生物学意义。方法

采用免疫组化S-

P 法检测Survivin 在NSCLC 及癌旁正常肺组织中的表达情况。采用TUNEL 法检测凋亡细胞，计算凋亡指数（AI ）。结果60例NSCLC 组织中Survivin 的阳性表达率为46.7%，20例正常肺组织的阳性表达率为10.0%，差异有统计学意义（P ＜0.01）。Survivin 的阳性表达与有无淋巴结转移、肿瘤的分化程度及TNM 分期有关（P ＜0.05），与NSCLC 患者的年龄、性别、肿瘤直径、病理分型、是否吸烟及有无胸膜转移无关（P ＞0.05）。结论Survivin 基因的异常表达可能在

NSCLC 的发生、发展中起到一定作用。检测Survivin 可能有助于临床TNM 分期和有无淋巴结转移的判断。

〔关键词〕Survivin ；非小细胞肺癌；细胞凋亡；免疫组织化学〔中图分类号〕R734

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202（2012）11-2227-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.11.004

基金项目：河南省科技攻关重点项目（No.102102310133）

通讯作者：蒋军广（1963-），男，教授，主任医师，主要从事老年呼吸疾病

研究。

第一作者：张晓燕（1985-），女，在读硕士，主要从事老年呼吸疾病研究。

肺癌是当前发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一，在老年人群中高发。多项研究表明肺癌的发生不仅与原癌基因的激活、抑癌基因的失活导致细胞增生过度和分化异常有关，还与细胞凋亡异常有关。生存蛋白（Survivin ）是凋亡抑制基因，在肺癌的发生、发展中可能发挥重要作用。本实验探讨Survivin 的临床生物学意义及在非小细胞性肺癌（NSCLC ）的发病机制中的作用，以期为NSCLC 的早期诊断、治疗和预后评估提供实验依据。1对象与方法

1.1

一般资料2008年1月至2009年11月在我院胸外科手

术切除且病理证实为NSCLC 的肺癌组织标本60例，男35例，女25例，年龄30 78〔平均（54ʃ22.5）〕岁。鳞癌22例，腺癌38例，按组织学分级：高分化10例、中分化30例、低分化20例；按照2002年美国联合癌症分类委员会和国际抗癌联盟制定的TNM 分期标准：Ⅰ期17例、Ⅱ期19例、Ⅲ期18例、Ⅳ期6例；伴淋巴结转移27例，不伴淋巴结转移33例；病理学或影像学检查有胸膜转移26例，无转移34例。所有入选的肺癌病人术前均未接受任何抗肿瘤治疗。取20例NSCLC 癌旁正常肺组织（距肿瘤边缘大于3cm 并经病理切片证实为正常的肺组织）作为对照。1.2方法1.2.1

主要试剂

末端转移酶标记技术（TUNEL ）凋亡试剂盒

购于美国Promega 公司，植物过氧化物酶（POD ）转换剂购自美国罗氏公司，兔抗人Survivin 单克隆抗体、生物素-链霉亲合素复合物（S-P ）免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺（DAB ）显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2.2

免疫组化染色

采用S-P 法，主要步骤：石蜡切片脱蜡

水化，于柠檬酸缓冲液中行微波抗原修复，双氧水阻断内源性过氧化物酶活性，非免疫性动物血清封闭山羊血清阻断非特异性反应，滴加一抗兔抗人Survivin 单克隆抗体，滴加生物素标记的二抗，滴加S-P 制剂，DAB 显色后自来水充分冲洗，苏木素复染，稀盐酸分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。1.2.3

细胞凋亡的检测

采用TUNEL 法，主要步骤：石蜡切

片脱蜡水化，

4%多聚甲醛固定，1ʒ500蛋白酶K 工作液通透组织切片，

4%多聚甲醛后固定，缓冲液平衡切片，加入孵育缓冲液标记DNA 断裂链，载玻片浸入2倍柠檬酸缓冲液（SSC ）终止反应，荧光显微镜下分析样品，加入POD 转换剂转换，DAB 显色后自来水充分冲洗，苏木素复染，稀盐酸分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。1.2.4

Survivin 阳性结果判定及凋亡指数（AI ）的计算

在

200倍视野下，随机选取5个有阳性细胞存在的视野进行计数，每个视野计数100个细胞，共500个细胞。Survivin 以胞质/胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。判定方法：（1）按阳性细胞所占百分数评分：0分：0%，

1分：＜10%，2分：10% 50%，3分：＞50%。（2）按细胞染色深浅评分：无棕黄色颗粒，与背景无区别为0分；有棕黄色颗粒，明显高于背景底色为1分；有染色较清晰的棕黄色颗粒，介于强弱之间为2分；有大量的深棕色颗粒，染色强为3分。综合染色强度和阳性细胞所占百分数

进行判定，即（1）+（2）：最后得分≥4分为阳性表达（+），＜4分为阴性表达（－）。在40ˑ10高倍视野下随机选取10个视野观察，计算凋亡细胞与所计数细胞总数的比值，即AI =凋亡细胞数/细胞总数ˑ100%。1.3

统计学方法

应用SPSS17.0统计软件进行分析，数据资

料以x ʃs 表示，采用χ2

检验的连续性校正及直线相关分析。2结

果

2.1

Survivin 在NSCLC 中的表达及与临床病理特征的关系

Survivin 主要定位于胞质或胞核。60例NSCLC 组织中Survivin 的阳性表达率为46.7%（28/60），

20例正常肺组织的阳性表达