大鼠肺动脉内皮细胞原代培养
大鼠肺微血管内皮细胞培养方法研究进展
生和发展都是以内皮细胞受损为基础，肺微血管内皮细胞在病理条件下，不仅是炎症反应的主要靶细胞，更是活跃的炎症细胞和效应细胞。
其功能和结构的完整性对于维持正常肺功能至关重要，这种特殊的细胞类型是研究肺功能不全及许多肺部疾病发生机制的理想细胞模型来源[4]。
近年，从生物化学、细胞生物学及分子生物学等方面探究内皮细胞生理功能的研究课题日益增多，有助于更全面认识PMVECs并了解其相关机制，进而可对相关疾病进行预防和治疗[5]。
近20年，国内外对PMVECs的研究取得众多成果，但其养困难、成本高、重复性差、易污染等问题，降低了培养成功率，因此建立完整高效的PMVECs培养方法意义重大。
本文总结了PMVECs培养的一般方法，具体流程，见图1。
图1 皮细胞培养一般流程1 肺微血管内皮细胞培养法1.1 原代培养肺微血管内皮细胞原代培养是指从活体生物中将肺组织取下进行培养，在完成首次传代培养之前的细胞都称为原代培养[6]。
国内外研究报道的肺微血管内皮细胞的方法主要有2种，一是组织块贴壁法[7-10]，二是酶消化法[11]。
2种方法各有利弊，组织块法操作简单、细胞成活率高、成本低、可减少因酶消化造成的细胞损伤，但是细胞迁出时间不好把握且组织块去除不彻底会造成其他杂细胞污染等。
酶消化法培养周期快、细胞生长速率快，但是消化时间和酶浓度不好控制，细胞成活率可能会因为消化时间过长受到影响。
1.1.1 组织块贴壁法组织块贴壁法是指将取自活体生物的组织，在无菌条件下剪成1×1×1 mm3小块，平铺在培养器皿中，加入含胎牛血清的培养基在37 ℃5%CO2条件下培养的方法。
组织块贴壁法的一般操作步骤：先去除组织胸膜，将去除胸膜的肺组织剪下1～3 mm左右的肺组织边缘，切成1×1×1 cm3组织块，用基础培养基DMEM清洗多次，至少3次，均匀地贴在25 cm2的培养瓶中，放入5% CO2 37 ℃的培养箱中培养1 h，等组织块贴壁后，加入完全培养基DMEM（20%FBS、ECGS、肝素钠、双抗等），放入培养箱中16 h以上，去除未贴壁的组织块，加入新的培养基，以后每2～3 d更换1次培养基。
大鼠肺动脉平滑肌细胞原代培养及低氧对缺氧诱导因子-1α的影响
Ｈ ｐｘ ｄ ｃ ｌＦ ｃ ｒ１（Ｉ－ ∞： ｅ ｎｉ ｎｅ ｒｇ ａ ｅｕ ｄｒ ｙｏｉ Ｍｅ ｈ ｄ Ｔ ｅｕｇ ｙｏｉＩ ｕｉｅ ａｔ － ａ Ｆ １ Ａ Ｎ ｗＡ ｔａｅｒ ｕ ｒ ｔ ｎ ｅｈｐｘ ． ｔ ｏ ｈ ａｎ ｂ ｏ Ｈ ｅ Ｄ Ｔ ｇ ａ ｌ ｎ
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ｏ Ｓ ｒｔ ｓ ｏ ｅ ｏ ｃ ｅ ｔ ｄ ｒａ ｅ ｔ ｏ ｄｔｏ ． ｌ ｎ ｒ ｒ ｒ ｓｉｏａｅ ｄｐ ｌ ｎ ｒ ｔ ｆ Ｄ ａｓＷａ ｇ ｔ ｎｆ ｍ ｈ ｓ ｅ ｐ ｃｃ ｎ ｉ ｎ Ｐｕｍｏ ａ ｙａｔ ｙｗａ ｓ ｌｔｄ ａ ｕｍｏ ａｙａ－ ｒ ｎ ｕ ｓ ｉ ｉ ｅ ｎ ｔｒ ｉ ｓ ｅＷａ ｐａ ｔｄｗｉ ｔ ｅａ ｈ ｒｎ ｍｅ ｏ ｆ ｔ ｓ ｅｅ ｌｎ ｓ ｒ ｅｃ ｌ ｌｒｍｏｐ ｏｏ ｙａ ｄｔ ｅｒｔｐ ｃ ｌ ｅｙｔ ｕ ｓ ｌｎｅ ｓ ｈ ｔ ｈ ｄ ｅ ｔ ｔ ｄｏ ｉ ｕ ｘ ａ ｔ． ｅｌ ａ ｅ ｈ ｓ ｐ ｎ１ ｕ ｒ ｈ ｌｇ ｎ ｈ ｉ ｙ ｉａ
大鼠肺血管内皮细胞原代培养技术的改进
大鼠肺血管内皮细胞原代培养技术的改进刘琦;赵明祥;吴珊;朱艳玲【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2006(31)4【摘要】血管内皮细胞是一群异质性很强的细胞，参与了血管再生、分泌血管活性物质、维持血管壁的完整、调节血管壁的通透性和促凝、抗凝功能等一系列生理及炎症反应过程。
肺血管内皮细胞培养常用的方法是组织贴块法和酶消化法，但这两种方法存在着一定缺陷，组织块贴块法引起组织内血凝块容易阻塞血管，妨碍内皮细胞的游出，还需要多次更换培养液去除血细胞；酶消化法又存在着价格昂贵，操作步骤复杂、胶原酶对细胞的毒性作用等。
2004年10月综合组织贴块法的优点和酶消化法灌流的思想，对原有的方法进行了改进，以求找到一种简单、有效获取大鼠肺血管内皮细胞的方法，为进一步实验打下基础。
【总页数】3页(P379-381)【作者】刘琦;赵明祥;吴珊;朱艳玲【作者单位】贵阳医学院,医学科学研究所,贵州,贵阳,550004;贵阳医学院,医学科学研究所,贵州,贵阳,550004;贵阳医学院,医学科学研究所,贵州,贵阳,550004;贵阳医学院,医学科学研究所,贵州,贵阳,550004【正文语种】中文【中图分类】Q813.11【相关文献】1.改良大鼠肺微血管内皮细胞原代培养技术及细胞鉴定 [J], 刘勇军;王萍萍;马婕;欧阳彬;陈娟;管向东2.原代大鼠脑微血管内皮细胞培养方法的改进 [J], 徐平湘;齐特;陆莉;薛明;肇玉明3.大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定 [J], 李颖川;江伟;周明;薛瑛;李亚春4.大鼠肺微血管内皮细胞原代细胞制备及纯化的方法改进 [J], 陈巧红;盛楠;孙静;冯波;胡格5.大鼠肺微血管内皮细胞原代细胞制备及纯化的方法改进 [J], 陈巧红[1];盛楠[1];孙静[2];冯波[1,3];胡格[1,2,3]因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠肺微血管内皮细胞使用说明
大鼠肺微血管内皮细胞编号名称规格北京派瑞金GK1001大鼠肺微血管内皮细胞5×105cells/瓶为能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的大鼠肺微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的大鼠肺微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
大鼠肺微血管内皮细胞简介：1、名称：大鼠肺微血管内皮细胞2、组织来源：大鼠肺血管组织3、规格：5×105cells/25cm2培养瓶4、细胞简介：大鼠肺微血管内皮细胞分离自正常大鼠肺血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。
细胞呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列。
肺微血管内皮细胞构成半选择性屏障，该屏障对于肺气体交换，调节液体和可溶物在血液与肺间质之间的流动具有重要意义。
本公司生产的大鼠肺微血管内皮细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度75%~85%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
5、培养基信息：1）培养基类型：1640培养基(GIBCO，添加NaHCO31.5g/L，Sodium Pyruvate0.11g/L) 2）添加因子：优质胎牛血清10%，细胞生长因子等大鼠肺微血管内皮细胞使用方法：收到细胞后，请按照以下方法进行操作。
1.取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。
2.待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。
大鼠肺动脉内皮细胞原代培养
大鼠肺动脉内皮细胞的简易培养鉴定准备工作：玻璃平皿（过酸高压）一次性平皿（1%明胶铺底4℃过夜用前2h移入孵箱用前培养液冲洗）手术器械（高压或紫外照射+酒精浸泡）PBS（高压后4℃预冷）超净台内操作冰袋原代1. 200-300g健康雄性大鼠2. 腹腔麻醉（10%水合氯醛3.5-4ml/kg）颈动脉放血3. 整个大鼠浸泡于75%酒精2-3s4. 剪开胸腔将心、肺一并切除放入PBS或Hanks液中备用（含青霉素200u/ml，链霉素200ug/ml）5. PBS冲洗分离并剪下肺动脉主干冲净血管内血液纵行剪开肺动脉平展在塑料管上切成1.5mm * 1.5mm的小动脉片以内膜面贴于灭菌的35mm培养皿6. 置孵箱微干涸2h7. 加入培养基2ml8. 放入孵箱（37℃5%CO2湿度100%）9. 72h后细胞可达一定密度除去动脉片换液一次10. 以后每2d换液一次每次换1/2 继续培养6-10d 形成细胞单层（内皮纯度达95%）传代1. 0.08%胰蛋白酶消化每瓶1ml 常温5min2. 终止消化后加入3ml培养基3. 吹打混匀后吸出0.1ml 细胞计数将细胞数调整为（2.5-3.0）* 105个/ml4. 25cm2培养瓶每瓶接种3ml细胞悬液5. 继续培养依次传代鉴定1. 细胞消化后800r/min 5min 除去培养液PBS（温）重悬取少许悬液薄涂于玻片上吸水纸吸干甲醇固定5-10min 取出备用2. VIII 因子相关抗原间接荧光染色PBS（0.01mol/L pH7.2）洗3min *3次加一抗：VIII 因子相关抗原抗血清50ul （0.01 mol/L pH7.2 PBS稀释）37℃密封孵育30minPBS 洗3min *3次加二抗：50ul37℃密封孵育30minPBS 洗3min *3次吸干缓冲甘油封片荧光显微镜观察（对照片不加一抗用PBS代替）3. 异植物血凝素结合试验PBS冲洗吸干加荧光标记的异植物血凝素（25ug/ml）50ul室温密封孵育30minPBS冲洗3min *3次吸干缓冲甘油封片荧光显微镜检。
大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定
大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定*谢 崧 杨晓静 钱桂生 王关嵩(第三军医大学新桥医院, 重庆 630037)摘要 取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。
将肺组织切成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90L g/ ml、L-谷胺酰胺4mmol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/m l的R PM I-1640培养基培养。
血细胞立即从肺组织周围游出。
继而是肺微血管内皮细胞。
成纤维细胞及其他细胞72h才游出。
培养60h后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。
后者可通过传代除去。
获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。
关键词 大鼠 肺循环 微循环 内皮细胞 细胞培养 肺微血管在生理和病理情况下都起着重要作用,如与成人呼吸窘迫综合征、肺动脉高压[1]等的发生有关。
目前仅限于肺动脉内皮细胞的研究,而肺微血管和大血管之间据文献报道在表型和功能有着显著的不同[2]。
故有培养和研究肺微血管内皮细胞的必要。
虽然肺有大量的血管内皮细胞,但同时存在40多种类型的细胞尤其成纤维细胞和平滑肌等细胞的迅速生长,使内皮细胞生长受抑制。
分离和培养纯的肺微血管内皮细胞较为困难。
国内未见肺微血管内皮细胞培养的报道。
本文采用简单的方法成功地分离和培养出大鼠肺微血管内皮细胞。
1 材料和方法1.1 主要试剂 RPM I-1640培养基为美国Gibco 公司产品。
新生牛血清由华西医科大学公共卫生学院生产。
兔抗人八因子相关抗原抗血清为DAKO公司产品,华美分装。
荧光标记异植物血凝素为Sigm a 公司产品。
荧光标记羊抗兔1gG由卫生部上海生物制品研究所生产。
抗菌素为青霉素钠盐和硫酸链霉素。
L-谷氨酰胺为第二军医大学分装。
胰蛋白酶和肝素钠均为上海生化试剂商店提供。
大鼠肺动脉内皮细胞按本研究所建立的方法[3]培养。
1.2 取材 选重200-300g健康雄性Wistar大鼠,10%乌拉坦(10L l/mg)腹腔麻醉。
L-NAME对内毒素致大鼠肺动脉内皮细胞损伤的保护作用
Ｌ Ｓ组 Ｓ Ｄ（３ １ ± ． ） Ｐ Ｏ ３ ．６ ２ ９ 明显升高（ ００ ） Ｎ ％ （３７±１９ ％ ，８８ Ｐ＜ ．５ ，Ｔ ３ ． ．４ ２ ． ８±１７ ％） Ｌ Ｓ组（ ０２ ２ ３ ．３ 与 Ｐ ４ ．８± ． ％）相 比 显著下 降（ ０ ０ ） Ｅ 一 Ｐ＜ ． ５ ，Ｔ １为（ １ ．８± １４ ，６ ． ４ ７ ９ ２ ．４ ４７ ８±１ ．４ｐ ｌ５５ ８ ７ ９ ｍ ，０ ． ８±２ ＃ｍ ） Ｌ Ｓ组 Ｅ 一（ ９ ．７± ０ｐ １ 与 Ｐ Ｔ１ ３ １ ６ １ ．２ｐ ４ ６ ＃ｍ１相 比明显升高（ ） Ｐ＜００ ） ．５ 。结论 ＬＮ ＭＥ可能通过 抗氧化 作用来保护 大 鼠肺 动脉 内皮细胞。但 是 －Ａ
Ｎ ＭＥｆｒ ４ｈｕｓ Ａ ｏｒ．④ Ｆ ｒ ｈ ｄｘｄ ｔ ｔｎ Ｌ Ｈ， Ａ， Ｏ Ｅ 一 ａｄＮ ｓｕ ｎ ｅ ｅｔｇ（ Ｔ ）ｏ ｅ ｏ２ ｏ ｅｉ ｅ ｅ ｃ ｏ ， Ｄ ＭＤ Ｓ Ｄ， Ｔ １ ｎ Ｔｍａｃｌ ｅｐｒ ｎａｅ Ｎ ％ ｔ ｎ ｅｉ ｉ ｃ ｆ ｖｒ ｅ ｙ
ＡｂｔａｔＯ ｊ ｔ ｅ Ｔ ｘｌ ｅｔｅｐｏ ｃ ｏ ｆ — Ａ ｎｔｅＲ Ａ Ｃ ａ ａｅｉｄｃｄ ｂ Ｐ ． Ｍ ｔｏｓ ｓ ｃ ： ｂｅ ｉ ： ｏｅｐｏ ｒｔ ｔ ｎｏ Ｎ ＭＥ ｉ Ｐ Ｅ Ｓｄｍ ｇ ｕ ｅ ｙＬ Ｓ ｅｈｄ ：① ｒ ｃｖ ｒ ｈ ｅｉ Ｌ ｈ ｎ维普资讯 泰３３ ０山医学
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学
大鼠血管内皮细胞培养
大鼠血管内皮细胞培养
1、劲椎脱臼处死大鼠，75%酒精中浸泡1分钟，打开胸腔，分离主动脉，放在无菌的D-Hanks 液培养皿中。
2、用眼科剪和镊子出去血管外周的脂肪和纤维组织，用含抗生素的D-hanks冲洗血管内外凝血数次，再放入另一无菌培养皿中。
3、用眼科剪纵向剪开血管，用手术刀将其切成1立方毫米大小的动脉植块，然后种植到培养皿中（培养皿用1%明胶37℃下过夜，使用前2h移入二氧化碳培养箱中，用时可以先经含10%小牛血清的培养液冲洗）。
将动脉植块的内膜面与皿底接触，种植密度约1块/立方厘米。
4、培养皿中静置2h（干贴壁），然后加入0.5ml含25%胎牛血清的培养液，略微盖过动脉植块内膜面。
24h后，更换培养液，加入2-3ml培养液。
5、72h左右，当观察到内皮细胞充分长出，而成纤维细胞刚要长出的时候，将动脉植块除去，刮出成纤维细胞，换培养液1次，以后每两天换液1次，每次换1/2 —1/3的液量。
继续培养8-10d，细胞融合成单层即可传代。
354.大鼠肺微血管内皮细胞的培养
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No .30370561);河北省自然科学基金资助项目(No .C2004000639)作者单位:075029 河北张家口,河北北方学院病理生理教研室第一作者简介:陈瑞华(1966-),男,汉族,张家口人,副教授。
主要从事危重病的病理生理学研究。
△通信作者:ncylxf@s ohu .com文章编号:100728568(2007)0120016204・实验研究・大鼠肺微血管内皮细胞的培养陈瑞华,赵自刚,牛春雨△,张 静,张玉平【摘要】 目的 建立简单有效地获取大鼠肺微血管内皮细胞(P MVEC )的培养方法。
方法 从实验动物、培养基、植块方法、胎牛血清浓度等方面对植块培养法进行改进,应用W istar 雄性大鼠的肺组织,进行P MVEC 的原代培养并传代培养;通过倒置显微镜、扫描、透射电镜观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定。
结果 体外培养的大鼠P MVEC 呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列,获得的血管内皮细胞纯度较高,抗Ⅷ因子阳性反应,成功建立了P MVEC 的原代培养方法。
结论 改进的植块培养法简便、可靠,获得的P MVEC 纯度高,生长状态良好,保持了内皮细胞的结构和功能,可用于其功能特性的进一步研究。
【关键词】 肺微血管;内皮细胞;细胞培养中图分类号:Q25 文献标识码:BCulture of Pul m onary M i crova scul ar Endotheli a l Cells i n Ra ts CHEN R u i 2hua,ZHAO Z i 2gang,N I U Chun 2yu,ZHAN J ing,ZHAN G Yu 2ping .D epa rt m en t ofPa thophysiololgy,Hebei N orth U n iversity,Z hang jiakou 075029,China【Abstract 】 O bjecti ve T o devel op a si m p le and rep r oductable method for the is olati on and p ri m aryculture of pul m onary m icr ovascular endothelial cells (P MVECs )of rats .M ethods The tissue bl ock pasted culture method was i m p r oved in experi m ent ani m al,culture -mediu m,tissue bl ock method,fetal bovine ser 2u m (F BS )and s p reading slide method .Rats P MVECs were p ri m ary cultured with lung tissue bl ock pasted methods using lung tissue of male W istar rats,and the cell mor phol ogy was observed using inverted m icr oscope and electr on m icr oscope,and identified using i m munohist oche m ical methods .Results The cultured P MVECs of rats in vitr o showed fusif or m shape or polygon,and the monolayer cultures dis p layed a typ ical cobblest one or pavingst one mor phol ogy and were inhibited when contacted each other,the P MVECs exp ressed fact or Ⅷass o 2ciated antigen.And the p ri m ary culture of P MVEC was established successfully .Conclusi on The pure pul 2monaryMVECs of rats can be attained rap idly and easily by the described method .The method is si m p le,eco 2nom ic and reliable,availability of these cells will facilitate further functi onal character studies .【Key words 】 Pul m onary m icr ovessel;Endothelial cell;Cell cultivati on 微血管内皮细胞衬附于血管内壁,定位于进行血液-组织交换的微血管,它不仅是构成血管组织间屏障的重要成分,而且在调节机体内环境的稳定、维持正常生理和免疫功能,以及介导疾病的发生、发展和转归等方面都发挥主要的作用。
肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程
肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程1、健康雄性SD大鼠一只，4周大，重约200g。
2、 75％消毒用酒精2瓶，无菌0.01MPBS溶液500ml，DMEM培养基100ml（含20%胎牛血清、20万IU/L青霉素、20万IU/L链霉素）。
3、解剖板1个（含4条固定用绳子），1L烧杯1个，培养皿2个，培养瓶1个，1ml吸管3根，弯头吹打管3根，眼科剪3把，眼科镊3把，解剖镊3把，止血钳4把，手术刀1把，刀片若干，吸头若干、棉签纱布若干，口罩帽子及无菌手套若干。
二、操作步骤1、洗手，戴口罩帽子及手套。
2、酒精喷洒并擦拭生物安全柜1，放入培养皿1个（倒入PBS并盖好）、手术刀1把、组织剪1把、止血钳4把及纱布若干（均经蒸汽灭菌消毒）。
3、处死大鼠（断颈法），完全浸泡于盛有75%的1L烧杯中3min，换手套，取出大鼠，固定于解剖板上，放入生物安全柜1，打开紫灯消毒30min。
4、酒精喷洒并擦拭生物安全柜2，于左侧放培养瓶、吸管及弯头吸管，眼科剪3把，眼科镊3把，中间放培养皿4个（打开，共8个，其中5个倒入PBS），以上物品均经蒸汽消毒灭菌，除培养皿外均应装入消毒饭盒内防止污染。
左侧放解剖镊1把（泡入酒精中，取吸管时用）。
打开紫灯消毒30min。
5、打开生物安全柜1，开吹风机10min，再一次消毒老鼠。
6、换手套，用手术刀、止血钳、解剖镊、组织剪等开胸，取出完整的心肺组织放入培养皿内，盖好。
7、打开生物安全柜2，开吹风机10min，放入装有心肺培养皿。
8、换手套，用眼科剪眼科镊仔细分离出肺动脉。
9、将取出的肺动脉（长约0.5cm）放入无PBS的培养基中，去除纤维外膜，用眼科剪将其剖开，用PBS冲洗3次至无血迹，（原则上还应刮除肺动脉内皮细胞，但因组织太小不好操作，且内皮细胞在M199培养基中不易生长，故此操作可省略）。
10、在无PBS的培养皿中将肺动脉剪成1mm3大小的组织块（剪碎的组织块常粘在一起，故应用十分锋利的眼科剪才好操作）。
大鼠肺成纤维细胞的原代培养和鉴定
气管镜肺活检（TBLB）和局部肺泡灌洗，肺活检报告示慢性肉芽肿性病变伴凝固性坏死，灌洗液和痰均找到抗酸杆菌，最终诊断为两肺肺结核。
经过HRZE四联抗结核治疗，辅以激素控制结核中毒症状，患者病情迅速好转出院。
成人继发性肺结核影像常常呈现为多形态表现（即同时出现渗出、增殖、纤维和干酪性病变，还可伴有钙化），容易形成空洞。
而本例患者起病较急，影像表现为两肺弥漫性肺间质病变、左肺大片实变、两肺斑片状阴影等多种病变，显然与典型继发性肺结核的表现有许多不同。
与一般的成人继发性肺结核相比，有免疫损害及老年肺结核患者表现常常不典型。
有资料认为成人继发性肺结核的不常见的X线表现有：①下肺结核；②粟粒性肺结核伴两肺间质性病变；③类似肺癌的纤维干酪块；④胸片正常。
回顾本例的诊治过程，我们的体会是：目前肺结核的临床表现多种多样，为了尽可能的减少肺结核的漏诊和误诊，提高对类似下呼吸道感染表现的肺结核的认识，了解和熟悉肺结核少见的X线表现，注意结核的高危因素和高危人群及胸部影像学的追踪观察，重视痰找抗酸杆菌、纤维支气管镜、组织活检病理等检查是十分必要的。
成年大鼠肺成纤维细胞的原代培养和鉴定徐卫华沈华浩浙江大学医学院附属二院呼吸科，浙江大学呼吸疾病研究所（310009）体外培养肺成纤维细胞是研究肺部疾病如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等的重要手段和工具。
目前对于成年大鼠肺成纤维细胞的原代培养，国内尚未见报道。
我们利用组织块培养法对成年SD大鼠肺成纤维细胞进行了原代培养，并用免疫细胞化学的方法进行了鉴定。
一、材料和方法1．试剂和器材0.25%胰蛋白酶（杭州吉诺公司），DMEM细胞培养液（杭州吉诺公司），胎牛血清（杭州四季清公司），兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体及鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），免疫组化染色SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司），小鼠抗波形蛋白单克隆抗体及免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。
大鼠血管内皮细胞培养研究
大鼠血管内皮细胞培养研究血管内皮细胞是血管中重要的细胞类型，其在维护血管生理特性以及参与血管病理反应中都具有重要的作用。
大鼠作为实验动物，其血管内皮细胞的研究也是非常重要的。
在这篇文章中，我们将重点介绍大鼠血管内皮细胞的培养技术及其在血管生物学研究中的应用。
一、大鼠血管内皮细胞培养技术1.1 资源准备大鼠动脉、静脉组织、FBS、DMEM/F12、胰酶、胰酶抗性味粉、细胞凝集素、槲皮素、PBS、二氧化碳培养箱、显微镜、离心机、相位对比显微镜、细胞均质器等。
1.2 组织消化将新鲜的大鼠动脉或静脉取出，去除外膜及脂肪组织，用PBS缓冲液清洗数次。
接着，用胰酶液消化组织，割碎后转移到消化液中，37℃孵育1-2小时，直到组织消化完全。
1.3 筛选基质消化完全的组织过筛，筛子孔径为80目。
去掉筛子上的淋渣后，产出的细胞可以用显微镜观察并鉴定是否为血管内皮细胞。
1.4 细胞培养将产出细胞悬浮在完全培养基（DMEM/F12，10% FBS，100ug/mL嘌呤鸟嘌呤，100ug/mL青霉素和50ug/mL链霉素）中，在培养室内孵育。
按细胞密度不同，可选用不同的培养方法，比如单细胞悬浮培养、半贴壁培养和全贴壁培养等。
1.5 纯化细胞如果需要纯化大鼠血管内皮细胞，还需要使用血管壁内形成的凝集素贴壁分离技术，配合药物槲皮素进行消除非内皮细胞。
二、大鼠血管内皮细胞在血管生物学研究中的应用2.1 血管内皮损伤与修复在血管损伤修复研究中，常常会使用拉环法、加热法、切割法、放置血栓等手段产生不同程度的血管内皮损伤模型，进而观察、探究血管内皮细胞的响应和修复机制。
例如研究大鼠颈动脉内皮细胞在内膜损伤后的DNA修复机制是一个非常热门的研究课题。
2.2 血管疾病如高血压、动脉硬化、心血管疾病等，都与血管内皮细胞的损伤和功能异常有关。
通过培养大鼠血管内皮细胞，可以模拟这些血管疾病模型，如在培养基中将NO剂加入，从而模拟高血压或将脂质压入细胞内，模拟动脉硬化等，可以帮助我们更好的探究血管疾病的病理生理机制。
简便有效分离培育大鼠主动脉内皮细胞的一种新方式
简便有效分离培育大鼠主动脉内皮细胞的一种新方式肖琼房云海徐蕴田铧张立平田兴松【摘要】目的：探讨分离、培育鼠主动脉内皮细胞的有效方式。
方式：将鼠主动脉内膜翻向外，结扎两头，置于50 mL培育瓶中培育、传代，Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色。
结果：培育6～8 d 时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长；12～14 d 时贴壁细胞覆盖大部份培育瓶面，约80%的细胞汇合成单层；传代细胞生长旺盛；细胞汇合后呈现典型的“鹅卵石”样内皮细胞特点，内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性；未见杂细胞。
结论：此方式无损伤、不需要酶消化，能比较容易的取得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞，适用于细小血管内皮细胞的分离与培育。
【关键词】主动脉·体外培育·内皮细胞·大鼠A new method for isolation and culture of the endothelial cells of the rat aorta【ABSTRACT】Objective:To investigate a modified method of isolating and culturing the endothelial cells from the rat aortafor endothelial bioresearch. Methods:Turned inside out, the aorta of the rat, of which the intima tunica was exposed, was ligated at both ends and cultured in a 50 mL culture bottle. Results:A small amount of cells migrated out from the aorta 6 to 8 days after cultured; the migrating cells spread over most of the culture surface of the bottle 12 to 14 days after cultured, 80% of them in a confluent monolayer. The confluent cells were identified as endothelial cells with the typical cobblestone appearance and the positive reaction for factor Ⅷ relative antigen, no other types of cells was observed. Conclusion:This is a woundless, nonenzymatic method of obtaining highly purified primary endothelial cells of the rat aorta, especially practical for isolation and culture of small vascular endothelial cells.内皮细胞是研究心血管、炎症、肿瘤等疾病最经常使用的工具。
原代细胞的培养与鉴定方法
1、大鼠骨髓来源肥大细胞原代培养并鉴定：脱颈法处死SD大鼠（体重约200g），75%酒精浸泡消毒3min。
转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，尽可能将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨。
剪去股骨两端的股骨头，使用5ml注射器吸取RPMI 1640基础培养基后将骨髓吹打出来，吹打过程中尽可能将骨髓冲洗干净。
使用巴氏吸管将骨髓吹打成单细胞悬液，1000rmp/min离心5min收集细胞如发现收集的细胞中有大量红细胞时需使用红细胞裂解液处理。
使用肥大细胞专用培养基重悬细胞，接种至T25瓶内培养。
培养过程中每2-3天换液一次，当发现有细胞变圆脱落时，收集脱落细胞至新的T25瓶内诱导培养，培养四周时肥大细胞诱导成熟，取成熟的肥大细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定；取脱落细胞培养一周、二周、三周、四周的细胞培养上清进行组胺含量检测。
2、小鼠骨髓来源肥大细胞原代培养与鉴定：小鼠经脱颈椎处死，75%酒精消毒后，取完整股骨，用1mL注射器吸取无菌PBS从股骨一端刺入，将骨髓细胞洗出，直到骨髓腔变白。
离心收集细胞，加入3mL红细胞裂解液，室温裂解3min之后，用PBS漂洗2次。
采用现配的原代细胞培养工作液（含青、链霉素各1000U/mL，10% FBS，IL-3 10 ng/mL，SCF 10ng/mL的RPMI-1640培养基培养液）将细胞重悬，按照106个/mL接种于六孔板中，每孔加3mL培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养，每7d 将悬浮细胞按照106个/mL转移到新的培养板中，继续培养，4-6周细胞分化成熟。
四周后收集悬浮细胞，部分细胞用于流式检测纯度，部分用含10% FBS的RPMI-1640培养基重新接板。
纯度检测：向诱导分化细胞中按1：200加入肥大细胞表面标志物APC-CD117 ，FITC- FcεRIα，4℃孵育60min ，无菌PBS 漂洗3次，流式检测肥大细胞纯度。
（SCF：Stem cell factor，干细胞因子；又称肥大细胞生长因子MGF）3、大鼠腹腔肥大细胞的分离与培养：选用体重220-250g的SD大鼠。
大鼠主动脉血管内皮细胞原代培养方法改良及氧化损伤模型构建
网络出版时间：２０２３－１０－３０１７：５０：１０ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３１０２７．１５３５．０６０◇实验方法学◇大鼠主动脉血管内皮细胞原代培养方法改良及氧化损伤模型构建马 露，杨 雷，晏凡晨，刘晓丹，丁 煌，谭 维，李菀榆，唐映红，张 伟，邓常清（湖南中医药大学中西医结合学院，湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，湖南长沙 ４１０２０８）收稿日期：２０２３－０４－１０，修回日期：２０２３－０７－２５基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８２１７４２１８，８１７７４０３２）；湖南省研究生科研创新项目（ＮｏＣＸ２０２２０７８６）作者简介：马 露（１９９３－）女，博士生，研究方向：中医药防治心血管疾病，Ｅ ｍａｉｌ：１００２４４５２０４＠１ｑｑ．ｃｏｍ；邓常清（１９６３－），男，教授，博士生导师，研究方向：中医药防治心血管疾病，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｄｃｈａｎｇｑ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ；张 伟（１９７９－），男，教授，博士生导师，研究方向：中医药防治心血管疾病，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｗｅｉ１９７９＠ｈｎｕｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０３０５０文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）１１－２１９２－０７中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２２ １２１；Ｒ３２９ ２４；Ｒ３４０ ５；Ｒ９１６ ３摘要：目的 改良大鼠原代主动脉血管内皮细胞（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ＶＥＣｓ）的提取和培养方法，并构建稳定的ＡＶＥＣｓ氧化损伤模型。
方法 采用六孔板植块联合胶原酶消化改良法建立大鼠原代ＡＶＥＣｓ提取和培养方法，倒置显微镜下观察细胞形态，免疫荧光染色法检测ｖＷ因子（ｖＷＦ）进行细胞鉴定。
选用２～４代的ＡＶＥＣｓ，用不同浓度的ＰＯＶ ＰＣ干预２４ｈ，检测细胞增殖、细胞骨架、成管能力、细胞内活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ），构建ＰＯＶＰＣ诱导的ＡＶＥＣｓ氧化损伤模型。
大鼠肺微血管内皮细胞的培养
Ｃ Ｅ ｕ－ｕ ．Ｚ Ａ ｉ ８ ．Ｎ Ｕ ｈ ｎｙ ．Ｚ Ａ ｉｇ Ｚ Ａ Ｙ －ｉ ． Ｄ ｐ ｒ ｅ ｔห้องสมุดไป่ตู้ｆ Ｈ Ｎ Ｒ ｉ ａ Ｈ Ｏ Ｚ— ｈ ｇ Ｉ Ｃ ｕ —ｕ Ｈ Ｎ Ｊ ．Ｈ ＮＧ ｕｐｎ ｎ ｇ ｅａｔ ｎ ｍ ｏ
Ｐ ｔｏｈｓ ｌｌｙ Ｈ ｂｉ ｏｔ 渤 ｅ ａｈｐ ｙｉ ｏ 。 ｅｅ Ｎ ｒ ｏ ｇ ｈ 。 ｈ ｎｊ ｋ ｕ ７ ０９。 ｈｎ Ｚ ａ ｇｉ ｏ ５２ Ｃ ｉａ ａ ０
ｃ ｔｒ ｔ ｏ ａ ｍｐ ｏ ｅ ｘ ｅ ｍｅ ｔａ ｉ ｌ ｃ ｔ ｒ ｌ ｕ ｕ ｅｍｅｈ ｗ ｓ ｉ ｒ ｖ ｄ ｉ ｅ ｐ ｒ ｎ ｎｍａ， ｕ ｕ ｅ—ｍｅ ｉ ，ｔ ｓ ｅ ｂｏ ｋ ｍｅｈ ，ｆ ｔ ｏ ｉ ｅ ｓ ｒ ｄ ｎ ｉ ｌ ｄｍｎ ｉ ｕ ｌｃ ｔ ｏ ｓ ｄ ｅａ ｂ ｖｎ ｅ － ｌ
陈瑞华， 自 牛春 雨 张 静 ， 赵 刚， ， 张玉平
【 摘要】 目的 建立简单有效地获取大鼠肺微血管内皮细胞（ Ｍ Ｅ ） Ｐ Ｖ Ｃ 的培养方法。方法 从实
验动物 、 培养基 、 植块方法 、 牛血清浓度等 方面对植块 培养法进行 改进 ， 用 Ｗｉａ 雄性 大 鼠的肺组 胎 应 ｓｒ ｔ 织， 进行 Ｐ Ｅ ＭＶ Ｃ的原代培养并传代培养 ； 通过倒置 显微镜 、 扫描 、 透射 电镜 观察其形 态 ， 进行免疫组 并 织化学鉴定 。结果 结论 体外 培养 的大 鼠 Ｐ Ｅ ＭＶ Ｃ呈梭形或 多角形 ， 形成单层 后呈典 型的鹅 卵石样或铺 路 石样排列 ， 获得的血管 内皮细胞纯度 较高 ， Ⅷ因子 阳性反应 ， 抗 成功 建立 了 Ｐ Ｅ ＭＶ Ｃ的 原代培养 方法 。 改进的植块培养法 简便 、 可靠 ， 获得的 Ｐ Ｅ ＭＶ Ｃ纯度高 ， 生长状态 良好 ， 保持 了内皮细胞 的结 构和 功能 ， 可用于其功 能特性的进一步研究。
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。
3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。
二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。
3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。
4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。
5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。
用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。
组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。
大鼠血管内皮细胞的分离、鉴定及传代培养
关键词 血 管 内皮细胞
分 离培养
大 鼠主动脉
文献标识码 ：Ａ 文章编号：１ ０ ０ ７ — １ ７ ３ ３ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ － ０ ０ ０ ８ － ０ ３
主 动 脉 。 取 出胸 主 动 脉 ， 用 Ｐ Ｂ Ｓ 冲洗３ － ４次 后 ， 放 入 另一‘
中图分 类号：￥ ８ ５ ２ ． １ ６ ３
１ ． ３ ． １ 细胞形 态 倒 置显 微镜 下观察 不 同代 次的细 胞形 态 ，是否呈现 内皮 细胞典型 的折光性强 、“ 铀路石” 样等特
点ｔ ， 。
和磷 酸二氢钾 ，天津 科密 欧化 学试剂 有 限公司 ：多聚 甲 醛 、甲醇 、硫酸铜 、碳酸氢Ｃ ｔ ￣ Ｊ Ｓ ｎ Ｎａ ２ Ｈ Ｐ Ｏ ４ ・ １ ２ Ｈ２ Ｏ，国药集
含２ ０ ％Ｆ ＢＳ 、４ ｎ ｇ ／ ｍｌ Ｖ ＥＧ Ｆ １ ６ ５ ￣ ｌ ｆ ｌ Ｏ ０ ￣ ｇ ／ ｍｌ 肝素的Ｄ ＭＥ Ｍ培 养液培养［ １ ，液体 仅遮盖 主动脉 即可 。培 养４ ｄ 后 ，弃去 主动脉植块 ，２ ～ ３ ｄ 换液 １ 次。
细胞 的体 外培养方 法对 于研 究 内皮 细胞特 性 、对作用 于 血管 的药 物及抗 肿瘤药 物 的研 究 具有重 要意 义 。本试 验
采用植块 法分 离大 鼠血管 内皮细 胞 ，通 过条 件培养 以及
Ｃ Ｄ ３ ｌ 免疫 组 化 和 管 形 成 鉴 定 ， 建 立 了 大 鼠主 动 脉 血 管 内
１ ． ２ ． ２ 传代培 养 原代细 胞培 养约 １ ２ － １ ４ ｄ ，迁 出生长 的
细 胞覆盖培养 瓶 面积 的２ ／ ３ 以上 时即 可传代 【 ３ 】 。弃去培养 液 ，用Ｐ Ｂ Ｓ冲 洗 培 养 瓶 后 ， 加 ０ ． ２ ５ ％胰 蛋 白酶 消 化 ３ ￣ ５ ｍｉ ｎ ，见 内皮细 胞收缩 变 圆 ，立 即加入 等体积 的含胎 牛 血 清 的ＤＭＥ Ｍ培 养 液 终 止 消 化 ， 吸 管轻 轻 吹打 并 混 匀 ，移 入 １ ０ ｍｌ 离心 管中 ，１ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ 离心 ｌ Ｏ ｍｉ ｎ ，弃上清 ，
改良大鼠肺微血管内皮细胞原代培养技术及鉴定_
㊃论 著㊃D O I :10.3760/c m a .j.i s s n .1673-436X.2018.05.008作者单位:050000石家庄,河北医科大学第三医院呼吸二科(张鑫红㊁田凤军㊁陈海利㊁徐迎春),重症医学科(王智勇);050000石家庄,河北医科大学病理生理教研室(黄新莉)通信作者:田凤军,E m a i l :185********@163.c o m改良大鼠肺微血管内皮细胞原代培养技术及鉴定张鑫红 田凤军 陈海利 徐迎春 王智勇 黄新莉ʌ摘要ɔ 目的 改良大鼠肺微血管内皮细胞(P MV E C s)原代培养方法,并对所培养的P MV E C s 进行鉴定㊂方法 组织贴块法培养P MV E C s ,从动物的选取㊁肺灌注㊁细胞漂洗次数及试剂温度等方面进行了改良㊂免疫组织化学鉴定P MV E C s ㊂结果 原代培养的P MV E C s 呈典型的铺路石样生长㊂免疫组织化学显示Ⅷ因子及血管性血友病因子表达阳性㊂结论 经改良后培养P MV E C s ,细胞培养的重复性高且生长状态好㊂ʌ关键词ɔ 肺微血管内皮细胞;原代培养;细胞培养I m p r o v e m e n t o fm e t h o d p r i m a r y c u l t u r e a n d i d e n t i f i c a t i o n o f r a t p u l m o n a r y mi c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s Z h a n g X i n h o n g *,T i a nF e n g j u n ,C h e n H a i l i ,X uY i n g c h u n ,W a n g Z h i y o n g ,H u a n g Xi n l i .*T h e S e c o n d D e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e ,t h eT h i r d H o s p i t a l o f H e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,S h i j i a z h u a n g 050000,C h i n aC o r r e s p o n d i n g a u t h o r :T i a nF e n g ju n ,E m a i l :185********@163.c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o i m p r o v e t h e m e t h o d of p r i m a r y c u l t i v a t i o n o f r a t p u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s (P MV E C s ),a n di d e n t i f y t h e p r i m a r y cu l t i v a t e d P MV E C s .M e t h o d s T i s s u eb l o c ka d h e r i n g w a l l m e t h o d w a su s e dt oc u l t i v a t e P MV E C s .P r i m a r y cu l t i v a t i o n m e t h o d w a s i m p r o v e d f r o mt h e p r o c e d u r e so fa n i m a l s e l e c t i o n ,p u l m o n a r yp e r f u s i o n ,t h en u m b e ro fc e l l sr i n s e sa n d t e m p e r a t u r e o f r e a g e n t sa n ds oo n .I mm u n o h i s t o c h e m i c a l o b s e r b a t i o nP MV E C s .R e s u l t s T h eP MV E C s w e r ee x h i b i t e d a s p o l y g o n .I mm u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g r e v e a l e d t h a t e x pr e s s i o n o f Ⅷa n d v o n w i l l e b r a n d f a c t o rw a s p o s i t i v e .C o n c l u s i o n s A f t e r t h e i m p r o v e d m e t h o do fP MV E C s ,t h e r e p r o d u c i b i l i t yo f c e l l c u l t u r e i sh i gha n d t h e g r o w t hs t a t u s i s g o o d .ʌK e y wo r d s ɔ P u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s ;P r i m a r y c u l t u r e ;C e l l s c u l t u r e 肺微血管内皮细胞(p u l m o n a r y mi c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s ,P MV E C s )在A R D S 等多种肺部疾病中是最早激活的效应细胞[1]㊂因此,体外培养P MV E C s 构建实验模型,对深入研究肺部不同疾病的发病机制具有重要意义㊂虽然国内外已有许多研究报道P MV E C s 原代培养和鉴定方法[2-3],但P MV E C s 的原代培养成功率仍然低,重复性差㊂本研究尝试对P MV E C s 培养过程中技术细节部分的改良,探索简单易行的实验方法,改善P MV E C s 原代培养的重复性及细胞的稳定性㊂1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物 S D 幼年大鼠,雌雄均可,体质量40~50g ,购自河北医科大学动物实验中心㊂实验过程中对动物的处理符合‘关于善待实验动物的指导意见“等相关要求㊂1.1.2 主要试剂 D M E M /F -12培养液㊁双抗液㊁牛血清白蛋白㊁P B S 缓冲液及2.5g /L 胰蛋白酶-E D T A 均购自美国G i b c o 公司,胎牛血清购自P A N 公司,4%多聚甲醛及聚乙二醇辛基苯基醚(T r i t o n X -100)购自索莱宝公司,兔抗大鼠Ⅷ因子相关多克隆抗体及兔抗大鼠血管性血友病因子(v o nw i l l e b r a n d f a c t o r,VW F )相关多克隆抗体购自武汉博士德公司,免疫组织化学二抗试剂盒购自北京中杉金桥公司,底面积25c m 2细胞培养瓶㊁35mm 细胞培养皿购自美国C o r n i n g 公司㊂1.1.3 主要设备 倒置荧光显微镜㊁含体积分数5%C O2细胞培养箱㊁超净台㊁低温离心机均购自美国T h e r m o公司㊂1.2细胞培养1.2.1原代培养大鼠2只,肝素钠㊁水合氯醛腹腔注射给药㊂麻醉成功后大鼠消毒3次,固定于超净台内㊂暴露心㊁肺,灌洗肺叶至发白㊂剪取肺组织,置于4ħP B S中漂洗㊂4ħ培养基中剪取边缘肺组织,约为(1mmˑ1mmˑ1mm)大小㊂将组织块均匀接种到细胞培养瓶中,吸去瓶中的全部培养基,并置于细胞培养箱中㊂组织块贴壁后,加37ħ完全培养基继续培养㊂约48h后组织块开始迁出P MV E C s,60h左右将组织块取出㊂之后隔天换液1次㊂1.2.2传代培养培养7~10d后,待细胞约为瓶底80%~90%,即可进行传代㊂弃去原培养液,漂洗后消化,待细胞收缩变圆㊁脱落,终止消化并离心㊂将离心后的细胞悬液,按1ʒ1比例传代㊂根据生长情况每1~2d换液1次㊂1.3细胞鉴定1.3.1细胞形态学观察显微镜下观察原代及传代细胞形态㊂1.3.2 Ⅷ因子鉴定取传代细胞,至六孔板内的盖玻片上㊂待细胞爬满玻片后,漂洗后加入4%多聚甲醛固定,0.3%T r i t o n X-100室温破膜,牛血清白蛋白温箱封闭㊂Ⅷ因子4ħ过夜后,加荧光二抗温箱避光孵育,漂洗后观察并记录㊂P B S替代一抗作为阴性对照㊂1.3.3 VW F鉴定按上述方法固定细胞后,依据免疫组织化学二抗试剂盒步骤鉴定VW F㊂P B S 替代一抗作为阴性对照㊂2结果2.1形态学结果显微镜下观察,原代细胞以铺路石样排列生长㊂而传代细胞呈长梭状㊂见图1㊁2㊂2.2 Ⅷ因子鉴定结果免疫荧光显示,细胞胞浆呈现绿色荧光,Ⅷ相关抗原表达阳性㊂见图3㊂2.3VW F鉴定结果免疫组织化学显示, P MV E C s内呈棕褐色,VW F相关抗原表达阳性㊂见图4㊂3讨论研究表明[4-5],肺脏组织大血管与微血管的内皮细胞之间存在着结构与功能的差异㊂在血管生成㊁血管通透性及其他相关研究中,P MV E C s更适合建立研究模型㊂这是因为P MV E C s较大血管有更强的适应环境的特性㊂注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图1组织块植入48h后P MV E C s开始从组织块中迁出ˑ2注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图2原代培养P MV E C s至72h,细胞约为瓶底80%~ 90% ˑ20目前用于原代培养P MV E C s方法主要有组织贴块法㊁免疫磁珠分离法㊁酶消化法等[6-9]㊂后两种方法步骤复杂,对技术及实验环境要求高,存在消化酶浓度把握不准的困难㊂而组织贴块法方法简单,易于操作,原代细胞培养成功率高㊂为提高组织贴块法原代培养P MV E C s的成功率,本实验尝试从以下几个方面进行了改良:①合适的动物选取是原代培养成功的第1步㊂在前期动物选取时,部分学者选择体质量150~250g的成年大鼠[2,10-11]㊂而在本研究的预实验中发现,成年大鼠的肺组织P MV E C s爬出困难,后期细胞生长缓慢㊂经过多次重复选择,最终选用体质量40~50g的幼年大鼠,其新陈代谢快,后期细胞状态好,传代能力强㊂②在灌洗肺循环环节,有的研究为了减少操作时间,摒弃此环节[6]㊂但在刘勇军等[2]的研究中得出,未灌洗的肺组织中存留大量红细胞及红细胞裂解物,影响迁出的P MV E C s的生长活力㊂因此,灌洗肺组织仍是必要的㊂与此同时,我们还发现,选择合适的灌注速度,尽量避免损伤肺微血管,对提高细胞培养的成功率有着至关重要的作用㊂本研究采用1m l注射器针头配10m l 针管从右心室进针缓慢灌洗肺组织至发白,不但可以控制灌注速度,又可清除大量红细胞,降低了裂解物对P MV E C s的毒性作用㊂③如何保证肺组织的活性是实验成功与否的关键㊂在本实验开始阶段,取材时选用未预冷的P B S及完全培养基, P MV E C s迁出率低㊂而将P B S及完全培养基改良为4ħ预冷,后期P MV E C s迁出率增高,生长状态好㊂④组织块是否贴壁是P MV E C s迁出的关键㊂根据以往的研究[12],组织块置于培养瓶后,仍有少量的培养基㊂然而我们经过多次尝试发现,即使少量的培养基,仍可引起组织块漂浮以至于无法贴壁㊂故采用无菌吸管吸去培养瓶中的全部培养基,湿润的瓶底可助于组织块牢固的贴壁,大大提高了P MV E C s迁出率㊂⑤以往的研究发现,即使增大灌注量也无法将肺组织中的红细胞完全清除[2]㊂因此,肺组织块植入后,应隔天换液至组织块取出㊂在本研究中,前期更换细胞培养基时,采用未经预热的P B S及完全培养基,结果发现大片细胞损伤甚至凋亡㊂对于更换培养基引起的凋亡,可能与温度骤然下降有关㊂故我们改良此步骤为,P B S及完全培养基经37ħ预热后再更换细胞培养基㊂而后发现P MV E C s的损伤减轻,改善了细胞生长状态㊂⑥理论上,每次换液时应将血细胞及其裂解产物漂洗干净㊂但在本实验的预实验阶段发现,过度漂洗并不能将裂解产物全部漂洗干净,还可能使组织块漂浮㊂在二者中经过多次权衡,最终采用每次换液前P B S漂洗2次,既可清除大部分裂解产物又可避免组织块漂浮㊂⑦在细胞传代阶段,以往研究多采用0.25%胰蛋白酶[12]㊂然而,0.25%胰酶消化后细胞不易脱落,需反复吹打下来,机械损伤严重㊂而我们将0.25%胰酶提前37ħ预热,胰酶的活性增高,传代后只需轻轻敲打瓶底数下即可,细胞损伤较机械损伤轻㊂⑧在本研究中,细胞固定前P B S漂洗需经37ħ预热,否则后期鉴定细胞时,易出现细胞脱落的现象,影响后期鉴定结果㊂经上述原代培养技术细节的改进,培养成功率大幅提高,且操作可重复性好㊂注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图3 P MV E C s中Ⅷ因子的表达结果免疫荧光 ˑ2注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞;VW F为血管性血友病因子图4 P MV E C s中VW F的表达结果免疫组织化学ˑ10本研究显示,原代P MV E C s大多数以团簇状生长,呈典型的铺路石样㊂传代P MV E C s细胞形态与原代细胞形态略不同,呈长梭状,这与贾建桃等[6]的研究是一致的㊂总之,本研究采用了组织贴块法的方法培养P MV E C s,重点是对动物的选取㊁肺灌注的速度㊁漂洗次数及试剂温度等方面的优化㊂改良后的细胞培养重复性高且生长状态好,可在以后的相关研究工作中推广应用㊂参考文献[1]S a k a oS,T a r a s e v i c i e n e-S t e w a r t L,W o o dK,e t a l.A p o p t o s i s o fp u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a 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n.2095-140X.2013.01.003.(收稿日期:2017-11-07﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏)㊃简讯㊃‘肺脏介入医学“已出版由科学出版社最新出版的中文版‘肺脏介入医学“,是由北京协和医院组织相关专家翻译㊂该书系统的介绍了介入技术在治疗肺部良性与恶性疾病方面的最新内容和方法㊂三位主编:J o h nF.B e a m i s,J rP r a v e e nN.M a t h u rA t u l C.M e h t a均是肺脏介入医学领域的专家;美国支气管病学会的创始人㊂作为当今介入领域知名专家的智慧结晶,这一综合性专著为呼吸科医生及其他专科医师提供了全面的有关介入技术在诊断和治疗领域的应用技术包括硬质支气管术㊁激光治疗㊁冷冻治疗㊁电手术治疗㊁荧光支气管镜术㊁内科胸腔镜以及经支气管壁和经胸壁针吸术等㊂对于异物取出㊁肺胸膜病变以及早期肺癌等处理过程中的困境及具体情况,本书详细阐述了其操作流程㊂该书是呼吸科医生的必备参考书之一㊂定价149.00元㊂邮购电话:010-********传真:010-********地址:100717北京市东黄城根北街16号科学出版社温晓萍(请在汇款附言注明您购书的书名㊁册数㊁联系电话㊁是否要发票等)。
原代培养的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的功能研究
摘要 ： 目的 探 索原 代培 养 的大 鼠远端 肺动 脉平 滑 肌细 胞 （ Ａ ＭＣ 是否具有血 管平滑 肌 的功 能， ＰＳ ） 为缺 氧性肺 动脉 高 压等肺血管疾病发病机制 及药 物干预研 究打下 基础 。方法
采用 显 微 操 作 和 胶 原 酶 消 化 法 分 离 、 养 大 鼠远 端 培
收稿 日期 ：０ ２— ５—１ ， 回 日期 ：０ ２— ７—１ ２１ ０ １修 ２１ ０ ５
导致的肺动脉收缩反应和血管结构重建在远端肺动 脉表现的比近端肺动脉更显著 Ｊ提示肺 动脉高 ，
压 发生 的主要 部位 在远端 肺 动脉 。尽管 原代 培养 大
鼠Ｐ Ｓ Ａ ＭＣ的方 法 已 有 文 献 报 道 ， 关 于 原 代 培 养 但 的大 鼠远 端 Ｐ Ｓ 的血 管 功 能 研 究 尚鲜 有 报 道 。 Ａ ＭＣ
・
１７ ・ ５０
中国 药理 学通 报
Ｃ ｉｅ ｈ ｒ ｃｌ ｉ ｌ ｕｌｉ ２ １ ｏ ；８ １ ） １７ ３ ｈｎｓ Ｐ ａｍａｏｏ ｃ ｌ ｔ ｅ ｇ ａ Ｂ ｅ ｎ ０ ２Ｎ ｖ２ （ １ ：５ ０～
网络 出版 时 间 ：０ ２—１ ２１ ０—２ ６：８ 网络 出版 地 址 ：ｔ ／ ｗ ９１ ５ ｈｔ ／ ｗｗ． ｎ ｉｎ ｔｋ ｍｓ ｄ ｔｉ ３ ． ０ ６ Ｒ．０１ ０ ９ １ ５ ． ２ ． ｔ ｐ： ｃ ｋ． ｅ／ ｃ ／ ｅａｌ ４ １ ８ ． ２ ２１２ ． ６ ８ ０ １ ｈｍｌ ／
光染色鉴 定 ， 用荧 光 显 微镜 法 观 测 高钾 （ ０ ｍ ｏ Ｌ 并 ６ ｍ ｌ・
肺 动 脉 平 滑 肌 细 胞 （ ｕｍ ｎ ｒ ａ ｅｉｌｓ ｏｈ ｐ ｌ ｏ ａｙ ｒ ｒ ｍｏｔ ｔ ａ
Ｋ １溶液对 大鼠远端 Ｐ Ｓ Ｃ） Ａ ＭＣ的细胞 内 Ｃ ２ 浓 度（ ｃ “ ］） ａ ［ａ ｉ
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大鼠肺动脉内皮细胞的简易培养鉴定
准备工作：玻璃平皿（过酸高压）一次性平皿（1%明胶铺底4℃过夜用前2h移入孵箱用前培养液冲洗）手术器械（高压或紫外照射+酒精浸泡）PBS（高压后4℃预冷）超净台内操作冰袋原代
1. 200-300g健康雄性大鼠
2. 腹腔麻醉（10%水合氯醛
3.5-4ml/kg）颈动脉放血
3. 整个大鼠浸泡于75%酒精2-3s
4. 剪开胸腔将心、肺一并切除放入PBS或Hanks液中备用（含青霉素200u/ml，链霉素
200ug/ml）
5. PBS冲洗分离并剪下肺动脉主干冲净血管内血液纵行剪开肺动脉
平展在塑料管上切成1.5mm * 1.5mm的小动脉片以内膜面贴于灭菌的35mm培养皿
6. 置孵箱微干涸2h
7. 加入培养基2ml
8. 放入孵箱（37℃5%CO2湿度100%）
9. 72h后细胞可达一定密度除去动脉片换液一次
10. 以后每2d换液一次每次换1/2 继续培养6-10d 形成细胞单层（内皮纯度达95%）
传代
1. 0.08%胰蛋白酶消化每瓶1ml 常温5min
2. 终止消化后加入3ml培养基
3. 吹打混匀后吸出0.1ml 细胞计数将细胞数调整为（2.5-3.0）* 105个/ml
4. 25cm2培养瓶每瓶接种3ml细胞悬液
5. 继续培养依次传代
鉴定
1. 细胞消化后800r/min 5min 除去培养液
PBS（温）重悬
取少许悬液薄涂于玻片上吸水纸吸干甲醇固定5-10min 取出备用
2. VIII 因子相关抗原间接荧光染色
PBS（0.01mol/L pH7.2）洗3min *3次
加一抗：VIII 因子相关抗原抗血清50ul （0.01 mol/L pH7.2 PBS稀释）
37℃密封孵育30min
PBS 洗3min *3次
加二抗：50ul
37℃密封孵育30min
PBS 洗3min *3次
吸干
缓冲甘油封片
荧光显微镜观察
（对照片不加一抗用PBS代替）
3. 异植物血凝素结合试验
PBS冲洗吸干
加荧光标记的异植物血凝素（25ug/ml）50ul
室温密封孵育30min
PBS冲洗3min *3次吸干缓冲甘油封片荧光显微镜检。