大鼠肺动脉内皮细胞原代培养

大鼠肺动脉内皮细胞的简易培养鉴定

准备工作：玻璃平皿（过酸高压）一次性平皿（1%明胶铺底4℃过夜用前2h移入孵箱用前培养液冲洗）手术器械（高压或紫外照射+酒精浸泡）PBS（高压后4℃预冷）超净台内操作冰袋原代

1. 200-300g健康雄性大鼠

2. 腹腔麻醉（10%水合氯醛

3.5-4ml/kg）颈动脉放血

3. 整个大鼠浸泡于75%酒精2-3s

4. 剪开胸腔将心、肺一并切除放入PBS或Hanks液中备用（含青霉素200u/ml，链霉素

200ug/ml）

5. PBS冲洗分离并剪下肺动脉主干冲净血管内血液纵行剪开肺动脉

平展在塑料管上切成1.5mm * 1.5mm的小动脉片以内膜面贴于灭菌的35mm培养皿

6. 置孵箱微干涸2h

7. 加入培养基2ml

8. 放入孵箱（37℃5%CO2湿度100%）

9. 72h后细胞可达一定密度除去动脉片换液一次

10. 以后每2d换液一次每次换1/2 继续培养6-10d 形成细胞单层（内皮纯度达95%）

传代

1. 0.08%胰蛋白酶消化每瓶1ml 常温5min

2. 终止消化后加入3ml培养基

3. 吹打混匀后吸出0.1ml 细胞计数将细胞数调整为（2.5-3.0）* 105个/ml

4. 25cm2培养瓶每瓶接种3ml细胞悬液

5. 继续培养依次传代

鉴定

1. 细胞消化后800r/min 5min 除去培养液

PBS（温）重悬

取少许悬液薄涂于玻片上吸水纸吸干甲醇固定5-10min 取出备用

2. VIII 因子相关抗原间接荧光染色

PBS（0.01mol/L pH7.2）洗3min *3次

加一抗：VIII 因子相关抗原抗血清50ul （0.01 mol/L pH7.2 PBS稀释）

37℃密封孵育30min

PBS 洗3min *3次

加二抗：50ul

37℃密封孵育30min

PBS 洗3min *3次

吸干

缓冲甘油封片

荧光显微镜观察

（对照片不加一抗用PBS代替）

3. 异植物血凝素结合试验

PBS冲洗吸干

加荧光标记的异植物血凝素（25ug/ml）50ul

室温密封孵育30min

PBS冲洗3min *3次吸干缓冲甘油封片荧光显微镜检