第四章 二维核磁共振谱
二维核磁共振谱综述
3．二维谱的表达方式
（1）堆积图(stacked plot). • 堆积图的优点是直观,具有立体感.缺点是 难以确定吸收峰的频率。大峰后面可能隐 藏小峰，而且耗时较长。 • (2)等高线（Contour plot） 等高线图类似于等高线地图，这种图的优 点是容易获得频率定量数据，作图快。缺 点是低强度的峰可能漏画。目前化学位移 相关谱广泛采用等高线。
4．2 化学位移相关谱（Correlated Spectroscopy ,COSY）
• 二维化学位移相关谱包括 • 同核化学位移相关谱（Homonuclear correlation） • 1）通过化学键：COSY, TOCSY, 2DINADEQUATE。 • 2）通过空间：NOESY, ROESY。 • 异核化学位移相关谱（Heteronuclear correlation） • 强调大的偶合常数：1H-13C –COSY • 强调小的偶合常数，压制大的偶合常数： COLOC(远程1H-13C –COSY)
二维核磁共振谱(精简2)共64页文档
截面图 Section
投影图 Projection
12.08.2021
11
堆积图
把堆积图用平行于F1和F2域的平面进行平 切后所得。
等高线图
等高线图中最中心的圆圈表 示峰的位置，圆圈的数目表 示峰的强度。
12.08.2021
12
12.08.2021
等高线图
➢ 一般反应3J耦合关系，远程耦合较弱， 不产生交叉峰。当3J较小时（如两面角 接近90o）也可能无交叉峰。
12.08.2021
24
1
1
23 56
234
56 7
7 4
3H
1H 4
5
6
7
12.08.2021
2 H C=C-O-CH2-CH2-CH2-CH3
25
Problem 1. The schematic 1H
COSY spectrum of 2hexanone is given below.
31
45
6
Using the COSY spectrum,
assign the 1H NMR
resonances of 2-hexanone, i.e.
establish which resonance
belongs to which specific H
对角峰或 自相关峰
12.08.2021
对角峰或 自相关峰
交叉峰或 相关峰
23
同核位移相关谱
1. 1H-1H COSY 简化多重峰，直观地给出耦合关系。
➢ 最常用的位移相关谱。 1H-1H COSY实验相当于做一系列连
续选择性去耦实验去求得耦合关系，用 以确定质子之间的连接顺序。
二维核磁共振谱技术及其基本原理
二维核磁共振谱技术及其基本原理二维核磁共振谱技术是核磁共振成像技术的一种重要分支，它通过在两个磁场方向上分别对样品进行核磁共振测量，得到更为丰富的信息，包括化学位移、耦合常数、相互作用等。
二维核磁共振谱技术在化学、生物医学等领域有着广泛的应用，能够提供样品的结构信息，是一种非常有用的分析工具。
本文将对二维核磁共振谱技术的基本原理进行介绍。
核磁共振谱是利用核磁共振现象对样品进行分析的一种方法。
当样品置于外磁场中时，样品中的原子核会受到外磁场的影响，核自旋会在外磁场的作用下产生共振信号。
这些共振信号可以通过调节外磁场的频率来探测，并且能够提供关于样品成分和结构的信息。
一维核磁共振谱是最基本的核磁共振谱技术，它通过在一个磁场方向上进行核磁共振测量来获取样品的信息。
然而，一维核磁共振谱的信息有限，无法提供样品内部的分子间相互作用信息。
为了获取更为丰富的信息，科学家们开发了二维核磁共振谱技术。
二维核磁共振谱技术通过在两个磁场方向上进行核磁共振测量，能够获取关于样品内部原子核之间相互作用的信息。
二维核磁共振谱技术的基本原理可以用二维傅里叶变换来解释。
当样品置于两个垂直的外磁场中时，样品中的原子核会在这两个磁场的作用下产生多重共振信号。
通过调节两个外磁场的频率，可以得到关于样品内部核之间相互作用的二维核磁共振谱数据。
为了更好地理解二维核磁共振谱技术的原理，我们可以将其分为三个步骤：样品制备、谱图获取和数据分析。
在样品制备阶段，需要对待测样品进行溶解、稀释等处理，以便在核磁共振仪中进行测量。
在谱图获取阶段，需要在两个垂直的外磁场中对样品进行核磁共振测量，得到二维核磁共振谱数据。
在数据分析阶段，需要进行傅里叶变换等数学处理，将原始的谱数据转换为易于理解的谱图。
通过对得到的二维核磁共振谱数据进行分析，可以获取关于样品内部结构和相互作用的信息。
二维核磁共振谱技术有着广泛的应用。
在化学领域，二维核磁共振谱技术可以用来对化合物进行结构鉴定和结构澄清。
2D核磁共振谱
SI
1024
MC2
TPPI
SF
500.1300144 MHz
WDW
SINE
SSB
2
LB
0.00 Hz
GB
0
精品课件
精品课件
2 NH
3 NH
NOESY用于多 肽序列 的归属
H1
1 12 3
H
CH2O
CH2O
CH2 O
H2N C C N C C N C C OH
H
HH
HH
H
精品课件
2
GPNAM1
sine.100
GPNAM2
sine.100
GPNAM3
sine.100
GPX1
0.00 %
GPX2
0.00 %
GPX3
0.00 %
GPY1
0.00 %
GPY2
0.00 %
GPY3
0.00 %
GPZ1
50.00 %
GPZ2
30.00 %
GPZ3
40.10 %
P16
1000.00 usec
vX
F2
精品课件
δ
vA
对角峰
F1
vA
vA
δ
交叉峰
谷氨酸的H, H-COSY 谱（500MHZ）
1
HO OC
C H (2 )
2
CH
NH 2
3
CH 2
4
4
CH 2
5
COO H
C H 2(4 )
C H 2(3 )
C H 2(3 ) C H 2(4 )
C H (2 )
ppm
2 .2 0
第4章二维核磁共振谱
4.2.1同核化学位移相关谱
一。COSY(Correlated spectroscopy)
所谓的COSY系指同一自旋体系里质子之 间的偶合相关。1H-1H-COSY可以1H-1H 之间通过成键作用的相关信息，类似于一 维谱同核去偶，可提供全部1H-1H之间的 关联。因此1H-1H-COSY是归属谱线，推 导结构及确定结构的有力工具。
A
M
X
与COSY有关的实验自旋回波 COSY(SECSY),双量子相干谱（DQCCOSY）,同核接力相干谱（RCT）.有兴趣 的同学，可以阅读有关的书籍。
二.天然丰度的双量子13C谱 (13C-13C-COSY)
INDEQUATE
这是二维碳骨架直接测定法，是确定碳原子连 接顺序的实验，一种双量子相干技术。是一种 13C-13C化学位移相关谱。在质子去偶的13C谱 中，除了13C信号外，还有比它弱200倍的13C13C偶合卫星峰，13C-13C偶合含有丰富的分子 结构和构型的信息。由于碳是组成分子骨架， 它更能直接反映化学键的特征与取代情况。
它只有一个双量子跃迁，其频率正比于两个偶合的 13C核的化学位移之和的平均值。所以如果两个碳 具有相同的双量子跃迁频率，即可以判断，它们是 相邻。 在INADEQUATE谱图中F1与F2分别代表双量 子跃迁频率和13C的卫线，依次代表双量子和单量 子跃迁频率。谱图中一个轴是13C的化学位移，一 个为双量子跃迁频率，其频率正比于两个偶合的 13C核的化学位移之和的平均值。因此谱图中 F1=2F2的斜线两侧对称分布着两个相连的13C原 子信号，表示碳偶合对的单量子平均频率与双量子 频率间的关系，水平连线表明一对偶合碳具有相同 的双量子跃迁频率，可以判断它们是直接相连的碳。 依此类推可以找出化合物中所有13C原子连接顺序。
核磁共振波谱-二维谱(研)归纳.ppt
演示课件
4.4.2 二维核磁共振谱的分类
15
（1）J分解谱 (J resolved spectroscopy)把化学位 移和自旋偶合的作用分辨开来，包括异 核和同核J谱。
（2）化学位移相关谱 (chemical shift correlation spectroscopy)是二维谱 的核心，通常所指的二维谱就是化学位移相关谱。
二维核磁共振谱
(2D-NMR)
化工与环境学院
2
目录
4.4.1 二维核磁共振谱基础知识 4.4.2 二维核磁共振谱的分类 4.4.3 常见二维核磁共振谱的原理及解析 4.4.4 核磁共振谱的综合解析
演示课件
NMR
射频脉 冲
一
预备期
维
实 验 过 程
检测期 （t2）
S (t2)
傅立叶 变换
S (2)
演示课件
发展期（演化期）(t1) Evolution period
混合期 Mixing period
在t1开始时由一个脉冲或几个脉冲使体系激发，此 时间系控制磁化强度运动，并根据各种不同的化 学环境的不同进动频率对它们的横向磁化矢量作 出标识。
通过相干或极化的传递，建立检测条件。
检测期(t2) Detection period
17
H（1）（δ5.85）有四个点，反 映了其分别与H（2）和H（3）耦 合，从图中可直接读出耦合常数 分别为J1,2=2Hz和J1,3=10Hz。同样 H（4）（δ4.20）与H（5） （δ1.70）耦合，有三个点， J4,5=6.5Hz；H（5）则分别与H(4) 和H（6）耦合，有9个点（其中有 两个部分重合），J4,5=6.5Hz， J5,6=8.0Hz。
核磁二维谱图
4.5.1二维共振谱的形成
• 信号函数s(w1,w2)两个独立的变量都必须是频率。如果其中一个变量是时间， 温度，浓度等，则不属于二维核磁。
预备期
发展期
混合期
检出期
回复平 衡态
1个或 几个脉 冲使体 系激发
建立信 号检出 条件
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检出 FID信 号
二维核磁的分类
• 1）J分解谱 • －J谱：化学位移和自旋耦合作用分辨开，异核J谱和同核J谱 • 2）化学位移相关谱：－谱，同核偶合，异核偶合，NOE和交换偶合。 • 3）多量子谱 • 二维核磁的表现形式：堆积图，等高线图
7
6
3
4
OH
23
5
4
1
第6页/共19页
6 78 9
第7页/共19页
9
8 7
6O
6
8
5
7
9
1 2
3 4
OH
3
2
9 8
7 6
6
8
O
5
7
9
1 2
3 4
OH
3
2
第8页/共19页
2
3
6
78 9
9
8
7
6
8
O
5
7
9
6 3 12
1 2
3 4
OH
4
5 第9页/共19页
小蠹烯醇1H NMR
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小蠹烯醇13C NMR
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小蠹烯醇1H-1H COSY
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小蠹烯醇双量子滤波1H-1H COSY(DQF-COSY)
第13页/共19页
二维核磁共振谱
化学位移相关谱（ 化学位移相关谱（Correlated Spectroscopy ,COSY） ）
二维化学位移相关谱包括 同核化学位移相关谱（ 同核化学位移相关谱（Homonuclear correlation） ） 1）通过化学键：COSY, TOCSY, 2D）通过化学键： INADEQUATE。 。 2）通过空间：NOESY, ROESY。 ）通过空间： 。 异核化学位移相关谱(Heteronuclear correlation） 异核化学位移相关谱 ） 强调大的偶合常数： 强调大的偶合常数：1H-13C –COSY 强调小的偶合常数，压制大的偶合常数： 强调小的偶合常数，压制大的偶合常数：COLOC(远 远 程1H-13C –COSY)
3．二维谱的表达方式 ．
（1）堆积图 ）堆积图(stacked plot). 堆积图的优点是直观,具有立体感 缺点是难以 堆积图的优点是直观 具有立体感.缺点是难以 具有立体感 确定吸收峰的频率。大峰后面可能隐藏小峰， 确定吸收峰的频率。大峰后面可能隐藏小峰， 而且耗时较长。 而且耗时较长。 (2)等高线（Contour plot） 等高线（ 等高线 ） 等高线图类似于等高线地图， 等高线图类似于等高线地图，这种图的优点是 容易获得频率定量数据，作图快。 容易获得频率定量数据，作图快。缺点是低强 度的峰可能漏画。 度的峰可能漏画。目前化学位移相关谱广泛采 用等高线。 用等高线。
同核化学位移相关谱
一、COSY(Correlated spectroscopy)
所谓的COSY指同一自旋体系里质子之 指同一自旋体系里质子之 所谓的 间的偶合相关。 间的偶合相关。1H-1H-COSY可以1H-1H 可以 之间通过成键作用的相关信息， 之间通过成键作用的相关信息，类似于一维 谱同核去偶， 之间的关联。 谱同核去偶，可提供全部1H-1H之间的关联。 之间的关联 是归属谱线， 因此1H-1H-COSY是归属谱线，推导结构 是归属谱线 及确定结构的有力工具。 及确定结构的有力工具。
二维谱
• 但是由于13C天然丰度仅仅为1.1%，出现13C-13C偶合 的几率为0。01％，13C-13C偶合引起的卫线通常离13C 强峰只有20Hz左右，其强度又仅仅是13C强峰的 1/200，这种弱峰往往出现在强13C峰的腋部，加上 旋转边带，质子去偶不完全，微量杂质的影响等因 素，使1JC-C测试非常困难。
三。NOESY（Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)
NOESY的谱图特征类似于COSY谱，一维谱中出现出现NOE 的两个核在二维谱显示交叉峰。NOESY可以在一张谱图上 描绘出分子之间的空间关系。
COSY OF PBF
NOESY of PBF
Codeine的NOESY
O
COSY of 2－丁烯酸乙酯
A
O
B
二.天然丰度的双量子13C谱 INDEQUATE (13C-13CCOSY)
这是二维碳骨架直接测定法，是确定碳原子连 接顺序的实验，一种双量子相干技术。是一种 13C-13C化学位移相关谱。在质子去偶的13C谱 中，除了13C信号外，还有比它弱200倍的13C13C偶合卫星峰，13C-13C偶合含有丰富的分子 结构和构型的信息。由于碳是组成分子骨架， 它更能直接反映化学键的特征与取代情况。
H-11 to C-14 and/or C-15 H-18 to C-16, C-11 H-13 to C-17, C-14 and/or C-15, C-11 H-14 to C-13 and C-11 H-18' to C-11 H-17 to C14 and/or C-15, C-13
A
• • • •
7.7 8.15 7.4 7.5
111.6 120.6 122.6 127
清华波谱课件第四章-2
4.5 异核位移相关谱 （Heteronuclear Shift Correlation Spectroscopy） ） 4.5.2 COLOC谱 谱
长程耦合的（异核位移） 长程耦合的（异核位移）相关谱 (Heteronuclear shift correlation spectroscopy via long range coupling)
x’ (c) νH
νH νH+J/2
y’ νH-J/2 x’ (d)
νH νH-J/2
y’ νH+J/2
x’ (e) 2πνH t1 πν
νH
y’ νH+J/2 νH-J/2
νH+J/2 y’ y’ x’ (g)
νH-J/2
2πνH t1+2πνH /(2J)+π/2 πν πν π x’ (f) 2πνH t1+2πνH /(2J)-π/2 πν πν π
4.8.2 异核接力相关（ H-C RCOSY) 异核接力相关（
4.8.3 总相关谱 ( Total correlation spectroscopy, TOCSY)
TOCSY谱是从 谱是从COSY往RCOSY的进一步延伸。 的进一步延伸。 谱是从 往 的进一步延伸 从某一氢核的谱峰出发， 从某一氢核的谱峰出发，能找到与它处在同一耦 合体系的所有氢核谱峰的相关峰（ 合体系的所有氢核谱峰的相关峰（尽管所讨论的 氢核和若干氢核之间的耦合常数可能为零）。 氢核和若干氢核之间的耦合常数可能为零）。
相当于一整套选择性去耦谱。 相当于一整套选择性去耦谱。
90°x’ t1 ° 2 t1 2 ° 1 90°x’ τ 2J 去耦 on
1H
a b
c
波谱分析课件：第4章 二维核磁共振谱1
同核二维J分解氢谱
异核二维J分解碳谱
4.2.1 同核二维J分解氢谱
脉冲序列为
同核AX体系的自旋回波示意图
紫草素的部分1H-NMR谱和二维J分解氢谱
Hax
7
Heq O H
5 1 4 10 11
a b
Hax
3
H3eq 3.69ddd
H
9
H O
H H 1
Heq
Hz 20 10 F1 10 20
二维核磁共振的关键是引入了第二个时间变量：演化期t1
。当样品中核自旋被激发后，它以确定频率进动，并且这 种进动行为将延续一段时间。表征这一特性的是横向弛豫 时间T2。对液体来说，T2一般为几秒。
通过检测期可以记录演化期 t1内核自旋的行为：在演化期 内从t1 = 0 开始，用某个固定的时间增量t1逐步延迟时 间t1进行一系列实验，每一个t1产生一个单独的FID，得 到Ni个FID。这样获得的信号表示成两个时间变量t1和t2 的函数S（t1， t2），再经两次Fourier变换，一次对t1， 一次对t2，得到以两个频率为函数的二维核磁共振谱S（ F1, F2）。
• 断 面 图
20 0 20 Hz H3ax 4.08 dd (a) 4.2 4.1 4.0 3.9
(b)
4.2 H7ax 3.72 ddd
4.0
3.8
F2
3.6
3.4
3.2 ppm
H3eq
H7eq 3.42 ddd
3.8 3.7 360MHz
1
3.6 H NMR
3.5
3.4
3.3 ppm
化合物2的同核二维J分解氢谱 (a)部分1H-NMR谱 (b) 堆积图 (c) 投影图 (d) 断面图
二维核磁共振谱
20世纪80年代：2D－NMR加速发展 用途： 解析复杂有机分子最有力的工具；溶液中分
子的三维空间结构的测定；分子动态过程的研究： 多维NMR技术：研究生物大分子（蛋白质、核酸等）
最有效的方法
二维核磁共振谱的特点
将化学位移、偶合常数等核磁共振参数展开 在二维平面上，这样在一维谱中重叠在一个 频率坐标轴上的信号分别在两个独立的频率 坐标轴上展开，减少了谱线的拥挤和重叠， 提供了自旋核之间相互作用的新信息,获得 更多的信息
杂峰与杂峰的消除
轴峰：沿F1维出现在参考频率为零处，与演化期间因纵向弛 豫而产生的纵向磁化强度有关。因为演化期的纵向弛豫不可 避免，因此轴峰必然存在
t1噪声峰：沿F1维出现的杂峰，可由许多复杂因素引起，例 如宏观退磁场效应和饱和效应等
镜像峰：关于中心频率对称的峰，二维镜像峰是复数Fourier 变换所固有的
演化期（t1） 在预备期末，施加一个或多个90脉冲，使系统建立共振非平衡状 态。演化时间t1是以某固定增量t1为单位，逐步延迟t1。每增加一个t1，其对应 的核磁信号的相位和幅值不同。因此，由t1逐步延迟增量t1可得到二维实验中的 另一维信号，即F1域的时间函数。
混合期（m） 由一组固定长度的脉冲和延迟组成。在混合期自旋核间通过相干 转移，使t1期间存在的信息直接影响检测期信号的相位和幅值。根据二维实验所 提供的信息不同，也可以不设混合期。
第4章二维核磁共振波谱(3)
对角峰或 自相关峰
对角峰或 自相关峰
2014-3-5
交叉峰或 它相关峰
2.交叉峰 交叉峰也称为相关峰，它们不在对角线上，即坐 标F1≠F2。交叉峰显示了具有相同偶合常数的不同 核之间的偶合。
交叉峰有两组（个），分 别出现在对角线两侧，并 以对角线对称。这两组对 角峰和交叉峰可以组成一 个正方形，并且由此来推 测这两组核A和X有偶合关 系。
2014-3-5
第二节 二维J分解谱
二维J分解谱是把重叠在一起的一维谱的化学位移 δ和偶合常数J分解在具有两个坐标的平面上，提供 了精确的偶合裂分关系，便于解析。 二维J分解谱分为同核和异核J分解谱。 一、氢、氢同核二维J分解谱 F2方向反映化学位移，在F2方向的投影为全去耦 氢谱，化学位移等价的一种核显示一条峰； F1方向反映了峰的裂分情况，耦合常数值(3JHH 或2JHH)及峰数（三重峰、四重峰）。
2014-3-5
10 7 9 8 1 6 5 4
2
3
O
CH3 ---四重峰（5-Me，1,1’ –Me, 10); CH2---三重峰(2,3,4); CH ---双重峰(7,8) 。
2014-3-5
第三节
同核化学位移相关谱
3 bond H–H coupling
一、氢、氢化学位移相关谱
1H-1H
常用的二维谱图测定方法是：通过两个独立的时
间变量进行一系列实验，得到S(t1,t2), 经过两次傅立
叶变换得到二维谱S(ω1,ω2),这种实验方法称为时域实
验。
2014-3-5
获得二个独立时间变量的方法是把“时间”这 个一维连续变量，采用“分割时间轴”方法来实现。 因此二维实验中通常把时间轴分成四个区间：
二维核磁共振谱概述 ppt课件
ppt课件
2
二维谱的表现方式
等高线图中最中心的圆圈 表示峰的位置，圆圈的数 目表示峰的强度。
等高线图
ppt课件
3
化学位移相关谱
同核位移相关谱
异核位移相关谱 NOE
ppt课件
4
同核位移相关谱
1H-1H
COSY ，COSY是correlated spectroscopy的缩写。
交叉峰或 相关峰 对角峰或 自相关峰
ppt课件 7
3
1
4
5
6
ppt课件 2-己酮 H-HCOSY
8
1
1 234 56 7
23
56
7
4
3 2
H H
H 4 5 6 7 C=C-O-CH2-CH2-CH2-CH3
1
ppt课件
9
ppt课件
10
ppt课件
11
异核位移相关谱
C-H COSY 是13C 和1H 核之间的位移相关谱。 它反映了13C和1H 核之间的关系。
二维核磁共振谱概述
什么是二维核磁共振谱？
二维核磁共振谱：
是有两个时间变量，经两次傅利叶变换得到 的两个独立的频率变量的谱图。一般用第二个时 间变量 t2 表示采样时间，第一个时间变量 t1 则是 与 t2 无关的独立变量，是脉冲序列中的某一个变 化的时间间隔。
ppt课件
1
二维谱的分类
J分解谱 J Resolved Spectroscopy, d-J 谱 同核 (homonuclear), 异核(heteronuclear) 化学位移相关谱 Chemical Shift Correlation Spectroscopy, d- d 谱 同核耦合, 异核耦合, NOE 和化学交换 多量子谱 Multiple Quantum Spectroscopy
二维核磁共振谱-20150930-1014讲述
由于13C天然丰度仅仅为1.1%，出现13C-13C偶合的几率 为0.01％.
13C-13C偶合引起的卫线通常离13C强峰只有20Hz左右， 其强度又仅仅是13C强峰的1/200，这种弱峰往往出现在 强13C峰的腋部，加上旋转边带，质子去偶不完全，微 量杂质的影响等因素，1JC-C测试非常困难。
交叉峰或 相关峰
对角峰或 自相关峰
对角峰或 自相关峰
交叉峰或 相关峰
5．二维谱的分类
分为三类： 1）J 分辨谱（ J resolved spectroscopy ）
δ－J 谱, 包括异核和同核J谱。 2）化学位移相关谱(chemical shift correlation
spectroscopy) δ－δ谱，包括同核化学位移相关谱，异核化学位移相 关谱，NOESY和化学交换。 3）多量子谱（multiple quantum spectroscopy）用脉 冲序列可以检测出多量子跃迁，得到多量子二维谱 。
（2）发展期：在t1开始时由一个脉冲或几个脉冲使体系 激发，使体系处于非平衡状态, 发展期时间t1是变化的。
（3）混合期：在此时期, 建立检测条件。
4）检测期：在此期间检测作为t2函数的各种横向矢量的 FID的变化以及它的初始相及幅度受到t1函数的调制。
与t2轴对应的ω2（ν轴），通常是频率轴，与t1轴对应的 ω1是什么，取决于在发展是何种过程。
二维核磁共振谱
Two dimension nuclear magnetic resonance, 2D－NMR
2D－NMR
1971年Jeener 首先提出 2D－NMR 思想: 具有两个时间变量的nmr
1976年 Ernst小组成功实现了2D－NMR实验后，确 定了二维核磁共振的理论基础
二维核磁谱的定量研究
二维核磁谱的定量研究
二维核磁共振谱（2D NMR）是一种常用的表征化合物结构的方法，它可以通过对样品在不同化学位移范围内的吸收进行分析，获得化合物中不同类型的氢原子的化学环境信息。
在进行2D NMR谱图的定量研究时，可以采用以下几种方法：
1. 归一化法：将谱图中各个峰的强度除以一个标准物质的峰强度，使得不同样品的强度可以进行比较。
这种方法简单易行，但对于样品中含有多种不同类型的氢原子的情况，需要对每种类型的氢原子都进行归一化处理。
2. 内标法：将一种已知结构的内标物质加入样品中，并对样品和内标进行2D NMR谱图分析，可以通过比较样品和内标的谱图，计算出样品中各类型氢原子的含量。
3. 外标法：将多个已知结构的外标物质加入样品中，并对样品和外标进行2D NMR谱图分析，可以通过比较样品和外标的谱图，计算出样品中各类型氢原子的含量。
4. 多元线性回归法：将多个已知类型氢原子的含量作为自变量，样品中各类型氢原子的含量作为因变量，建立多元线性回归模型，可以通过模型预测样品中各类型氢原子的含量。
需要注意的是，在进行2D NMR谱图的定量研究时，需
要对样品进行适当的处理，以消除不同样品之间的差异。
此外，对于复杂的样品，可能需要采用多种方法进行分析，以提高定量分析的准确性和精度。
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第四章二维核磁共振谱4．1二维核磁共振的概述1．什么是二维谱二维核磁共振(2D NMR)方法是有Jeener 于1971年首先提出的,是一维谱衍生出来的新实验方法.引入二维后,减少了谱线的拥挤和重叠,提高了核之间相互关系的新信息.因而增加了结构信息,有利于复杂谱图的解析.特别是应用于复杂的天然产物和生物大分子的结构鉴定,2DNMR是目前适用于研究溶液中生物大分子构象的唯一技术.一维谱的信号是一个频率的函数,记为S(ω),共振峰分别在一条频率轴上.而二维谱是两个独立频率变量的信号函数,记为S(ω1,ω2),共振峰分布在由两个频率轴组成的平面上.2D-NMR的最大特点是将化学位移,偶合常数等参数字二维平面上展开,于是在一般一维谱中重叠在一个频率轴上的信号,被分散到两个独立的频率轴构成的二维平面上.,同时检测出共振核之间的相互作用.原则上二维谱可以用概念上不同的三种实验获得,(如图 4.1),(1).频率域实验(frequency- frequency) (2).混合时域(frequency-time)实验(3). 时域(time-time)实验.它是获得二维谱的主要方法,以两个独立的时间变量进行一系列实验,得到S(t1,t2),经过两次傅立叶变换得到二维谱S(ω1,ω2).通常所指的2D-NMR均是时间域二维实验.图4.1 2D-NMR 三种获得方式2．二维谱实验二维谱实验中，为确定所需的两个独立的时间变量，要用特种技术－时间分割。
即把整个时间按其物理意义分割成四个区间。
（如图所示）图4.2 一般二维谱实验（1）预备期：预备期在时间轴上通常是一个较长的时期，使核自旋体系回复对平衡状态，在预备期末加一个或多个射频脉冲，以产生所需要的单量子或多量子相干。
（2）在t1开始时由一个脉冲或几个脉冲使体系激发，此时间系控制磁化强度运动，并根据各种不同的化学环境的不同进动频率对它们的横向磁化矢量作出标识。
（3）在此期间通过相干或极化的传递，建立检测条件。
在此期间检测作为t2函数的各种横向矢量的FID的变化。
它的初始相及幅度受到t1函数的调制。
与t2轴对应的ω2（ν轴），通常是频率轴，与t1轴对应的ω1是什么，取决于在发展是何种过程。
3．二维谱的表达方式(1)堆积图(stacked plot).堆积图的优点是直观,具有立体感.缺点是难以确定吸收峰的频率。
大峰后面可能隐藏小峰，而且耗时较长。
图4.3 堆积图等高线(2)等高线（Contour plot）等高线图类似于等高线地图，这种图的优点是容易获得频率定量数据，作图快。
缺点是低强度的峰可能漏画。
目前化学位移相关谱广泛采用等高线。
4．二维谱峰的命名（1）交叉峰（cross peak）:出现在ω1≠ω2处，（即非对角线上）。
从峰的位置关系可以判断哪些峰之间有偶合关系，从而得到哪些核之间有偶合关系，交叉峰是二维谱中最有用的部分。
（2）对角峰（Auto peak）:位于对角线（ω1＝ω2）上的峰，称为对角峰。
对角峰在F1和F2轴的投影。
图4.4 典型二维谱示意图5．二维谱的分类二维谱可分为三类：1）J 分辨谱（J resolved spectroscopy ）J 分辨谱亦称J谱或者δ－J谱。
它把化学位移和自旋偶合的作用分辨开来，包括异核和同核J谱。
2）化学位移相关谱(chemical shift correlation spectroscopy)化学位移相关谱也称δ－δ谱，是二维谱的核心，通常所指的二维谱就是化学位移相关谱。
包括同核化学位移相关谱，异核化学位移相关谱，NOESY和化学交换。
3）多量子谱（multiple quantum spectroscopy）用脉冲序列可以检测出多量子跃迁，得到多量子二维谱。
4．2 化学位移相关谱（Correlated Spectroscopy ,COSY）二维化学位移相关谱包括：同核化学位移相关谱（Homonuclear correlation）1）通过化学键：COSY, TOCSY, 2D-INADEQUATE。
2）通过空间：NOESY, ROESY。
异核化学位移相关谱（Heteronuclear correlation）强调大的偶合常数：1H-13C –COSY强调小的偶合常数，压制大的偶合常数：COLOC(远程1H-13C –COSY)。
4.2.1同核化学位移相关谱1．1H-1H-COSY所谓的1H-1H-COSY系指同一自旋体系里质子之间的偶合相关。
1H-1H-COSY可以1H-1H之间通过成键作用的相关信息，类似于一维谱同核去偶，可提供全部1H-1H之间的关联。
因此1H-1H-COSY是归属谱线，推导结构及确定结构的有力工具。
COSY－90。
的基本脉冲序列包括两个基本脉冲图4.5COSY－90。
的基本脉冲序列在此脉冲作用下，根据发展期t1的不同，自旋体系的各个不同的跃迁之间产生磁化传递，通过同核偶合建立同种核共振频率间连接图。
此图的二个轴都是1H的δ在ω1＝ω2的对角线上可以找出一维1H谱相对应谱峰信号。
通过交叉峰分别作垂线及水平线与对角线相交，即可以找到相应偶合的氢核。
因此从一张同核位移相关谱可找出所有偶合体系，即等于一整套双照射实验的谱图。
例如(COSY –相关谱（Co rrelation S pectroscop y）o both axes correspond to the proton nmr spectra.o the COSY spectra indicates which H atoms are coupling with each other.图4.7 典型2－丁烯酸乙酯COSY谱图图4。
6 COSY of First look at the peak marked A in the top left corner. This peak indicates a coupling interaction between the H at 6.9 ppm and the H at 1.8 ppm. This corresponds to the coupling of the CH3 group and the adjacent H on the alkene.∙Similarly, the peak marked B indicates a coupling interaction between the H at 4.15 ppm and the H at 1.25 ppm. This corresponds to the coupling of the CH2 and the CH3 in the ethyl group.∙Notice that there are a second set of equivalent peaks, also marked A and B on the other side of the diagonal.2．COSY 45COSY 45 的基本脉冲序列：π/2-t1-π/4-ACQ.即将COSY 90的第二脉冲变成45。
许多天然产物的直接连接跃迁谱线落在对角线附近，导致谱线相互重叠，不易解析。
COSY 45比COSY 90减少了平行跃迁磁化转移强度，即消除了对角线附近的交叉峰，使对角线附近较为清晰。
图4.8 蔗糖的COSY 90图4.9 蔗糖的COSY 45 3．LR COSY(long range COSY)常规的COSY 90 脉冲序列测得的COSY谱，观察不到较小的远程偶合交叉峰。
LR COSY 是在COSY 90的序列基础上引入较长的延迟D2用于小J磁化转移的发展，能大大增加来自远程偶合的交叉峰的强度。
其基本脉冲序列是：π/2-t1-D2-α-ACQ(t2)图4.10 蔗糖的COSY 90和LRCOSY在COSY 90中邻位大的偶合G1和G2可以清楚看出。
在LRCOSY中除了可以看出G1和G2的偶合，还可以找到G1和G3，G4的小J的偶合交叉峰。
因此在LRCOSY 谱中除了可以发现大J的邻位偶合交叉峰，还存在着小J的远程偶合（3J H-H,4J H-H）,解析谱图时，应该对照COSY加以区别。
4．相敏COSY谱COSY谱，由于谱线信号色散分量作用，相邻的峰容易相互部分重叠，交叉峰的精细结构看不清楚，不便读出偶合常数。
相敏COSY谱的相位很复杂，相位调节的质量直接影响偶合常数的检测即信号灵敏度。
在COSY谱中对角线与交叉峰相位总是相差90。
相敏COSY谱中，磁化转移地结果产生一对交叉峰相位相差180。
以AX体系为例。
其交叉峰为纯吸收线形，对角线为色散型。
谱图黑色圆圈为正峰，红色为负峰。
图4.12 AX体系相敏COSY谱图4.13 AMX相敏COSY谱与COSY有关的实验还有,自旋回波COSY(SECSY),双量子相干谱（DQC-COSY）,同核接力相干谱（RCT）.有兴趣的同学，可以阅读有关的书籍。
3．天然丰度的双量子13C谱（INADEQUA TE(13C-13C-COSY)）这是二维碳骨架直接测定法，是确定碳原子连接顺序的实验，一种双量子相干技术。
是一种13C-13C化学位移相关谱。
在质子去偶的13C谱中，除了13C信号外，还有比它弱200倍的13C-13C偶合卫星峰，13C-13C偶合含有丰富的分子结构和构型的信息。
由于碳是组成分子骨架，它更能直接反映化学键的特征与取代情况。
但是由于13C天然丰度仅仅为1.1%，出现13C-13C偶合的几率为0。
01％，13C-13C偶合引起的卫线通常离13C强峰只有20Hz左右，其强度又仅仅是13C强峰的1/200，这种弱峰往往出现在强13C峰的腋部，加上旋转边带，质子去偶不完全，微量杂质的影响等因素，使1JC-C测试非常困难。
利用双量子跃迁的相位特性可以压住强线，突出卫线求出JC-C,并根据Jc-c确定其相邻的碳。
一个碳原子最多可以有四个碳与之相连，利用双量子跃迁二维技术测量偶合碳的双量子跃迁的频率。
13C-13C同核偶合构成二核体系（AX,AB）两个偶合的13C核能产生双量子跃迁，孤立的碳则不能。
它只有一个双量子跃迁，其频率正比于两个偶合的13C核的化学位移之和的平均值。
所以如果两个碳具有相同的双量子跃迁频率，即可以判断，它们是相邻。
在INADEQUATE谱图中F1与F2分别代表双量子跃迁频率和13C的卫线，依次代表双量子和单量子跃迁频率。
谱图中一个轴是13C的化学位移，一个为双量子跃迁频率，其频率正比于两个偶合的13C核的化学位移之和的平均值。
因此谱图中F1=2F21的斜线两侧对称分布着两个相连的13C原子信号，表示碳偶合对的单量子平均频率与双量子频率间的关系，水平连线表明一对偶合碳具有相同的双量子跃迁频率，可以判断它们是直接相连的碳。