美国药典29微生物限度检查

它山之石------ USP29“微生物限度检查法”供大家学习参考，我认为USP29

内确实有许多值得我们学习的东西，但在编辑《中国药典》时也要考虑到我国实际情况，本着真正能提高药品质量的目的，如一味地照抄照搬别人的东西，就会出现看看药品标准确实是上去了，体面、拿的出去，但在实际应用时不适宜操作，反而降低了对药品质量的控制。

我认为2005年版、2010年版的《中国药典》微生物限度检查法就是如此，2005版药典执行后就开始需要进行药品的验证工作，相同的药品不同的厂家之间要验证；既是同一厂家由于生产原料厂家的改变也要验证，因此各厂家之间出现了五花八门的都称已经验证的检验方法，有的说该方法可行，有的又说该方法不行，天知道这些验证方法的可信度？同时又出台了执行药典通知：以后未经验证的检品不能下“微生物限度检查符合规定”的结论。我国有这么多的药品生产厂家，作为我国药品的监督检验单位，对药品检验来说怎样去验证，每做一个检品都去验证，这样的工作量现实吗？到今天药典还没有一个对具体样品经验证后较科学的检验方法或指导性方法。

我认为现行的“微生物限度检查”法参照USP的方法对具体的样品验证，并按经验证后的方法进行检验，这确实有利于微生物的检出率，提升药品检验标准。但应分步进行：可先放在“药典附录指导性原则”内，然后再要求药品生产企业对自己生产的品种进行验证并报地市级以上药品检验所对该方法再次进行检验审核后，再报药典会汇总、审核，在《中国药典》具体品种项下写入检验方法后再开始实施。

目前这一步到位的做法，已从2005年版药典实施开始到2010年版的《中国药典》实施，效果到底怎样？我想：从有关专业杂志的相关文章内也可知一、二。

<61> 微生物限度检查

本章所提供的检测程序用于测定包括原料药及制剂在内的各种药品中需氧菌数量以及不含有指定的微生物。如果已有充分的证据证明某种自动化的方法可以给出与本章所提供的方法等效的或更好的实验结果，可以用该方法替代本章所提供的方法。在实验准备以及实施的过程中，应遵守无菌操作。除另有规定外，本检查法中“孵育”是指将容器置于温度控制在30-35˚C的空气中24-48小时。术语“生长”在此处是专用于表示存活的微生物的增殖。

预试验（验证试验）

应有充分的证据证明在实验条件下检品本身对可能存在微生物的增殖无抑制作用，这在很大程度上决定了下述所规定的检查方法的结果有效性。因此，应进行预试验，测定金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌分别接种到稀释的检品中共同培养后的存活情况，以使检查标准化并作为随后试验的具体要求。方法如下：接种1ml金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌的24小时肉汤培养物（稀释度大于等于10-3）至最低稀释级样品供试液中（样品用pH 7.2磷酸盐缓冲液, 大豆-酪蛋白水解物琼脂培养基或乳糖液体培养基稀释），若微生物在相应的培养基中不能生长，则该部分试验

无效，有必要按下述步骤对实验进行调整：通过（1），增加稀释剂的体积，供试品量保持不变，或（2）在稀释剂中加入足够量的灭活剂；或（3）适当地将（1）和（2）结合使接种物可以生长。

可在培养基中加入0.5%的大豆卵磷脂和4.0%的聚山梨酸酯-20以中和供试品中的所存在的抑菌成分。或者用酪蛋白水解物-大豆卵磷脂-聚山梨酸酯-20-培养基按前述方法重复试验以确认对供试品中的保护剂或其他抗菌剂的中和作用。若产品中含有抑菌成分，而该产品又是可溶的，可采用无菌检查项下产品的无菌检查法中的薄膜过滤法。

如果在加入灭活剂或大大增加稀释剂的体积后仍不能使上述培养物恢复存活，而且该产品不适合采用薄膜过滤法，可以作如下推断：所接种微生物的分离培养失败是由于该产品的抑菌活性。此信息表明该产品未被指定（上述给定）的微生物所污染（此信息表明该产品大概不会被上述给定的微生物所污染）。应继续进行监测以建立该产品的抑菌谱和杀菌活性范围。

缓冲液和培养基

培养基既可以按以下处方配制，也可以使用生产者或销售商推荐的，与该配方相类似的脱水培养基。

按以下程序配制培养基：将可溶性固体溶解在水中，必要时可加热促使其完全溶解，用HCl或NaOH溶液调节培养基的pH使其在使用时达到规定值。在25 ±2℃时测定pH 值。

如果配方中有琼脂，则琼脂的含水量不应超过15%，配方中的水均应为纯水。

PH 7.2磷酸盐缓冲液

储备液—在1000ml容量瓶中将磷酸二氢钾KH2PO434g（monobasic potassium phosphate）溶于约500ml水中，用NaOH TS（约175ml）调节pH至7.2±0.1。加水至刻度，混匀。分装，灭菌。冷藏保存备用。

培养基

除非另有规定，培养基均应采用高压蒸汽灭菌方式（见灭菌项<1211>下，蒸汽灭菌），灭菌时间取决于待灭菌的培养基的体积。

将酪蛋白胨、大豆卵磷脂溶解在960ml水中，在温度为48-50°C水浴中加热约30分钟使其完全溶解。加40ml聚山梨醇酯20混合，按所需量分装。

II.大豆-酪蛋白水解物琼脂培养基

灭菌后pH7.3 ± 0.2。

III. 大豆-酪蛋白水解物培养基

按无菌检查项<71>下大豆-酪蛋白水解物培养基的配制方法进行。

IV.甘露醇-盐琼脂培养基

将上述成分混合后，加热并不停不断地搅动，煮沸1分钟使之完全溶解。灭菌后pH7.4 ± 0.2.

V. Baird–Parker琼脂培养基

边加热边搅拌，煮沸一分钟。灭菌，冷却至45C- 50C, 加入10ml灭菌的1%亚碲酸钾溶液、50ml蛋黄乳化液，轻轻混合均匀，倾注平皿。（卵黄乳化液制备：将蛋壳表面消毒，无菌条件下打开蛋壳，将完整的蛋黄分离至无菌量筒中。加入无菌盐水TS，使蛋黄与盐水比为3 :7。转移至一无菌搅拌杯中高速搅拌5秒钟。）灭菌后pH6.8 ± 0.2.

VI. Vogel–Johnson琼脂培养基

将固溶体(固体溶液)煮沸1分钟，灭菌，冷却至45C—50C，加入灭菌的1%亚碲酸钾溶液。灭菌后pH7.2 ± 0.2。

VII. Cetrimide琼脂培养基