5无菌及微生物检查方法验证
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋
白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7.活菌计数
活菌计数结果见表1。
10－4稀释
10－5稀释
10－7稀释
试验次数
1
2
1
21Βιβλιοθήκη 2金黄色葡萄球菌56
60
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
01
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验
02
操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果
*
菌 种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
计数(CFU)
22
26
36
39
62
66
58
54
45、 23
128、108
无菌检查方法验证方案
无菌检查方法验证验证项目编号R-YZ-501-01年月验证机构云南德华生物药业有限公司质控部化验室负责部门：质控部验证小组成员：验证方案批准对验证方案批准表示同意其测试内容、测试方法和本方案内的各种表格格式、内容。
目录1.概述2.验证目的3.验证范围4.验证人员及职责5.文件准备和培训6.验证条件及验证时间安排7.验证依据8.验证过程9.评价标准10.验证过程评价11.验证结论12.建议无菌检查方法验证1.概述无菌检查是用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其它品种是否无菌的一种方法。
无菌检查工作量大、操作不规范、人员的知识匮乏、检查方法应用不当等都会导致试验失败，因此在对一个产品进行无菌检查之前应先对无菌检查方法进行验证。
2.验证目的2.1确认所用的无菌检查方法适用于“医用即溶止血纱布”的无菌检查。
2.2确保检查结果的准确性、可靠性、准确性和重新性以及检查方法的完整性。
2.3通过对不同批次产品无菌检查的比较，对医用即溶止血纱布产品的生产全过程进行质量监控。
3.验证范围医用即溶止血纱布产品的无菌检查。
4.验证人员及职责验证委员会负责验证项目的确定；质控部负责该验证方案的起草及组织实施；验证小组负责验证方案的审批；质控部参与验证的实施及监督。
验证小组成员：5.文件准备和培训5.1检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。
5.2培训参加验证人员需进行本文件及下述内容的培训：微生物知识、无菌检查及微生物检验操作培训。
6.验证条件及验证时间安排6.1验证条件6.1.1检验公用系统验证及仪器安装完成；仪表量器经过校验合格，且在有效期内。
6.1.2供试品3批①②③6.1.3培养基及试剂：氯化钠：临用前配成0.9%浓度的溶液硫乙醇酸盐流体培养基批号：生产厂家：改良马丁培养基批号：生产厂家：营养肉汤培养基批号：生产厂家：改良马丁琼脂培养基批号：生产厂家：6.1.4验证用菌株：（来源：云南省药品检验所）金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】生孢梭菌【CMCC（B）64941】大肠埃希菌【CMCC（B）44102】白色念珠菌【CMCC（F）98001】6.1.5无菌检验仪器及相关设备压力蒸汽灭菌器型号：生产厂家：生化培养箱型号：生产厂家：霉菌培养箱型号：生产厂家：超净工作台型号：生产厂家：6.2验证时间验证小组提出完整的验证计划，经批准后实施，整个验证活动按下面时间安排完成。
微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题
微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题
钟长鸣;陈希;吴燕红
【期刊名称】《中国药品标准》
【年(卷),期】2011(12)1
【摘要】@@ 有些药品由于其自身杀菌和抑菌作用,在微生物限度和无菌检查时就有可能出现假阴性结果,为使检查结果真实可靠则必须消除其自身杀菌和抑菌作用.消除药品自身杀菌和抑菌作用的方法有:培养基稀释、离心沉淀集菌、薄膜过滤、中和等方法.寻找一种恰当的能消除药品其自身杀菌和抑菌作用的方法是其方法验证的内容.我所在开展方法验证工作中发现存在一些问题.
【总页数】2页(P12-13)
【作者】钟长鸣;陈希;吴燕红
【作者单位】江西省食品药品检验所,南昌,330029;江西省食品药品检验所,南昌,330029;江西省食品药品检验所,南昌,330029
【正文语种】中文
【中图分类】R927
【相关文献】
1.对替硝唑注射液无菌检查方法验证中不同厂家集菌器使用问题的探讨 [J], 凌真;陈莹洁;丁莉
2.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析 [J], 国明;祝清芬;郑力真
3.加强药品无菌检查和微生物限度检查方法验证的对策 [J], 赵建英;寿文虹;李爱玲
4.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析 [J], 李红
5.微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题 [J], 郭焕君
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无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。
菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
无菌检查法及其验证
无菌检查法及其验证
第8页
培养基储存
• 制备好培养基应该保留在2-25℃、避光环 境，若保留于非密闭容器中，普通在3周内 使用；若保留于密闭容器中，普通可在1年 内使用。
※应结合实际情况进行验证，以确定培养基 使用期。
无菌检查法及其验证
第9页
培养基适用性检验
本检验可在供试品无菌检验前或与供试品 无菌检验同时进行。 • 无菌性检验
无菌检查法及其验证
第24页
阳性对照试验
• 目标：①验证供试品经灭活后或用其它方式（稀 释、冲洗等）处理后是否仍有抑菌或杀菌作用， 确保检验条件符合要求，预防出现假阴性。②培 养条件是否符合要求。
• 应依据供试品特征选择阳性对照菌。 ①无抑菌及抗革兰阳性-金黄色葡萄球菌 ②抗革兰阴性-大肠埃希菌
③抗厌氧菌-生孢梭菌 ④抗真菌-白色念珠菌
无菌检查法及其验证
第28页
• 对无菌检验试验所用设备及环境微生物监控结果不 符合无菌检验法要求；
• 回顾无菌试验过程，发觉有可能引发微生物污染原 因；
• 供试品管中生长微生物经判定后，确证有微生物生 长是因无菌试验中所使用物品和（或）无菌操作技 术不妥引发。
无菌检查法及其验证
第29页
试验若经确认无效，应重试。重试时，重 新取同量供试品，依法重试，若无菌生长， 判供试品符合要求，若有菌生长判供试品 不符合要求。
2支
1 ml 5天
※其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基都有 1支不接种作为空白 ※接种量 ＜100cfu（不能多）
无菌检查法及其验证
第14页
培养基适用性检验
⑤结果判断
• 空白对照应无菌生长，若加菌培养 基管均生长良好，判该培养基灵敏 度检验符合要求。
无菌检验技术—无菌检查方法验证
• 3.3无菌检查的范围 • 凡进入人体无菌部位(人体的血液循环பைடு நூலகம்统、肌肉、皮下组织)或接触创
伤、溃疡面等部位而发生作用的制品或要求无菌的材料、无菌器具均应 进行无菌检查。对于规定灭菌的药物，包括注射剂及用于体腔、严重烧 伤、溃疡及眼科用药等，必须严格无菌，即在规定检验量的供检品中不 得检出活微生物。
任务3 无菌检验方法验证 知识点3 无菌检查方法
• 3 无菌检查方法 • 3.1无菌检查法概念 • 无菌检查法是指检查《中国药典》要求应无菌的药品、医疗器具、原料、 辅料及其他要求无菌的品种是否染有活菌的一种方法（供试品符合无菌检查 法的规定，仅进表明了供试品在该检查条件下未发现被微生物污染）。 • 为了保证药品的卫生质量，保证药品在临床上的安全使用和保障人民的健 康，《中国药典》规定：注射用药、灭菌的外用制剂等均需做无菌检查。
• 的制剂。心脏瓣膜以及固定金属板和有机器材等。
• (3)冲洗剂，即用于冲洗开放性伤口或腔体的冲洗剂。
• (4)眼用制剂。
• (5)用于烧伤、创伤或溃疡的制剂。包括：用于烧伤或严重创伤的局部用 散剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂；用于烧伤、创伤或溃疡的气雾剂和喷 雾剂等。
• (6)用于手术、耳部伤口或耳膜穿孔的滴耳剂或洗耳剂。 • (7)用于手术或创伤的鼻用制剂。 • (8)用于止血并可被组织吸收的制剂。如明胶发泡剂、凝血酶等，用于止
• 3.2验证目的 • 确认所用的无菌检查方法适用于“所有无菌产品”的无菌检查。 • 确保检查结果的准确性、可靠性、准确性和重现性以及检查方法的完整 性。 • 通过对不同批次产品无菌检查的比较，对医用即无菌产品的生产全过程 进行质量监控。 • 3.3验证范围 • “所有无菌产品”的无菌检查。
• 3.4验证条件 • 3.4.1验证用菌株 • 金黄色葡萄球菌 • 菌种传代次数铜绿假单胞菌 • 枯草芽孢杆菌 • 生孢梭菌 • 白色念珠菌
无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室验证方案
无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室验证方案一早，阳光透过实验室的窗户洒在我的桌子上，我泡了一杯咖啡，打开电脑，准备着手写这个方案。
这个方案对我来说，早已驾轻就熟，十年的经验让我对这类项目有了深刻的理解。
就让我用最自然的语言，把这个方案呈现出来。
我们得明确这个方案的目的。
简单来说，就是为了验证无菌检验室和微生物限度检验室的阳性对照检验室是否符合规定，确保检验结果的准确性和可靠性。
一、方案背景随着生物制品行业的迅速发展，对无菌检验室和微生物限度检验室的要求越来越高。
阳性对照检验室作为这两个检验室的重要组成部分，其验证工作的开展显得尤为重要。
本方案旨在对阳性对照检验室进行全面的验证，以确保检验结果的准确性和可靠性。
二、验证项目1.无菌检验室阳性对照检验室（1）环境验证：包括空气质量、温湿度、压力等指标的检测。
（2）设备验证：包括培养箱、生物安全柜、高压蒸汽灭菌器等设备的性能检测。
（3）操作规程验证：包括操作流程、检验方法、数据处理等环节的验证。
2.微生物限度检验室阳性对照检验室（1）环境验证：包括空气质量、温湿度、压力等指标的检测。
（2）设备验证：包括培养箱、生物安全柜、高压蒸汽灭菌器等设备的性能检测。
（3）操作规程验证：包括操作流程、检验方法、数据处理等环节的验证。
三、验证方法1.环境验证（1）空气质量检测：采用尘埃粒子计数器、空气培养箱等设备，对实验室空气质量进行检测。
（2）温湿度检测：采用温湿度计对实验室温湿度进行检测。
（3）压力检测：采用压力计对实验室压力进行检测。
2.设备验证（1）培养箱验证：采用标准菌株对培养箱进行温度、湿度、培养效果等方面的验证。
（2）生物安全柜验证：采用生物安全柜测试仪对生物安全柜的性能进行检测。
（3）高压蒸汽灭菌器验证：采用生物指示剂对高压蒸汽灭菌器的灭菌效果进行验证。
3.操作规程验证（1）操作流程验证：通过实际操作，对操作流程进行验证，确保操作过程的合规性。
（2）检验方法验证：采用标准菌株对检验方法进行验证，确保检验结果的准确性。
无菌检验及方法验证
培养基
• 中国药典: 改良马丁和FTM • 美国药典: TSB 和FTM • 购买的RTU培养基/实验室配制的培养基 • 按照相应的SOP编制培养基的批号 • 培养基质量控制（pH，无菌性，灵敏度实验） • 制定有效期 • FTM培养结束后培养基氧化层（粉红色）不应超过培养基深度
1/2。供试品接种前，培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的 1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分 钟），迅速冷却，只限加热一次
培养基（续）
• 灵敏度检查 – 根据药典方法选择阳性菌种(G-,G+,酵母菌,真菌, 环境中分离 得到的菌株) – 购买的RTU培养基每批要进行灵敏度检查 – 将小于100 CFU的阳性菌加入培养基内,计数 – 细菌培养不超过3天,真菌培养不超过5天 – 空白对照无菌生长,加菌的培养基生长良好 – 加入添加剂的培养基须重新进行灵敏度检查 – 菌种制备,保存和培养的SOP – 对新开的菌种冻干管需要对菌种进行鉴定,菌种传代不超过5 代
培养基（续）
• 灵敏度检查 – 购买药典推荐的菌种 FTM：枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌，生 孢梭菌 TSB：白色念珠球菌，黑曲霉菌 --至少包含一种环境菌
• 培养基无菌性检查 培养基应在适当的温度下培养14天以检测其无菌性,每批随机抽取 5瓶
-培养基灵敏度检查可以和培养基无菌性检查、无菌检查同步进行
无菌实验
• 取样Sampling • 检测方法Test methodology • 培养基Media • 培养时间Incubation period • 阴性对照Negative test controls • 阳性对照Positive test controls
无菌、微生物限度检查做法精炼
微生物限度检测：（1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）一般有三种方法：平皿法、薄膜法、MPN法。
样品计数方法的验证：1 培养基适用性的检查TSA :培养的是需氧菌总数，包括真菌。
需要用的金黄色葡萄球菌，（革兰氏阳性菌）铜绿假单胞菌，（革兰氏阴性菌）枯草芽孢杆菌，（细菌中芽孢的代表）白色念珠菌，（酵母菌的代表）黑曲霉。
（霉菌的代表）SDA 霉菌和酵母的总数白色念珠菌，(酵母的代表)黑曲霉。
（霉菌的代表）怎么做呢？在TSA 验证时，每一株菌有4个平皿，试验组2个，对照组2个。
对照组用的是中检院的TSA对照组培养基。
每个皿中接不大于100CFU/ml 的菌。
然后：1摇匀 2 凝固 3 倒置（细菌是单细胞的生物正置会有水滴下来，菌落会蔓延）细菌培养 30-35度培养3d 需要做5种菌（金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉）真菌培养20-25度培养5d （培养的温度是由培养基的种类决定的，培养的时间是由微生物的种类决定的。
需要做2种菌。
结果：结论被检培养基上菌落的平均数与对照培养基上菌落的平均数的比值在0.5-2范围内合格。
2计数方法的适用性(有抑菌性，导致微生物数减少)微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
Ppc 原理A组供试液（试验组）（供试液加菌液100CFU）2种方法：供试液+（每ml不超过100CFU的菌）平皿法+（每张膜中加入100CFU的菌）薄膜法B 组供试液组对照组供试液（以稀释液代替菌液组操作）C组菌液组菌液每ml 不超过100CFU的菌取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌进行微生物的回收。
(A-B)/C的比值在0.5-2之间。
日常检测检验量：一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）一般为10g或10ml (随机抽取不少于2个最新包装，从两个包装中取)回收率；（修正系数）（用于医疗器械上的微生物的测量，或者是固体需要做的，因为洗脱不完全）第一种：薄膜过滤法（微生物较多的情况，产品直接洗脱法）无菌一、培养基适用性检查 (无菌性和灵敏度)目的:确认培养基的有效性。
微生物检验方法验证
3.防腐剂抑菌效力测定
三、验证概述
微生物学检验的影响因素：
1.药品本身的抑菌性 2.药品中防腐剂的抑菌性 3.培养基的促菌生长能力 4.培养条件（温度、湿度及需氧或厌氧） 5.过滤系统的材质
三、验证概述
消除抑菌性的方法: 一、化学中和法
用化学中和剂中和抑菌剂，消除抑菌作用。 二、稀释法
重点议题
一、法规要求 二、验证目的 三、检验概述 四、总菌落数检查方法验证 五、控制菌检查方法验证 六、无菌检查方法验证
一、法规要求
第二百二十六条 试剂、试液、培养基和当从可靠的供应商处采购，必要时应当对供应 商进行评估；
（二） 应当有接收试剂、试液、培养基的记录，必要时，应当在试剂、 试液、 培养基的容器上标注接收日期；
酵母菌计数
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基
四、总菌落数检查方法验证
培养基适用性检查 被检培养基
培养结果
试验菌 50~100cfu
50~100cfu
试验菌
.. .. ..
适
..
宜
.. ..
培
养
条
.. ..
件
..
.. .. ..
被检培养基上的菌落平均数不得小于对照培养基上的菌落平均数的70% 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致
降低抑菌剂的浓度以消除抑菌性。 三、薄膜过滤法
抑菌性产品通过滤膜时，微生物被截留在膜上，检品被过滤掉。 ——微生物检查法准确与否的核心是对抑菌性的有效消除
四、总菌落数检查方法验证
环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域
培养基种类：
细菌计数
营养琼脂培养基
霉菌和酵母菌计数
玫瑰红钠琼脂培养基
（三）应当按照相关规定或使用说明配制、贮存和使用试剂、试液和 培养基。 特殊情况下，在接收或使用前，还应当对试剂进行鉴别或其 他检验；
中国药典微生物限度检查方法验证方案
中国药典微生物限度检查方法验证方案一、引言药品的质量与安全性是保障患者用药安全的重要方面。
微生物限度检查是药品质量控制的重要环节，用于评价药品中微生物的污染情况。
为确保检测结果的准确性和可靠性，本文旨在制定中国药典微生物限度检查方法验证方案。
二、背景微生物限度检查方法验证是指确定某一方法在特定条件下的适用性，方法验证的结果直接影响到药品生产和品质控制。
为了保证方法验证的可靠性，必须按照一定的规范和要求进行操作。
三、验证目的验证中国药典中所规定的微生物限度检查方法在实际应用中的准确性和可靠性，以确保药品的微生物限度符合国家及相关法规的要求。
四、验证程序1. 确定验证方法：根据中国药典中规定的微生物限度检查方法，选择合适的验证样品和验证条件。
2. 准备验证样品：从实际生产过程中随机选取药品样品，确保样品的代表性。
3. 执行验证实验：按照中国药典中的方法操作，对验证样品进行微生物限度检查。
4. 数据分析和评估：根据验证实验的结果，进行数据分析和评估，评估方法的准确性和可靠性。
5. 结果判定：根据数据评估结果，对微生物限度检查方法进行判定，判断方法是否适用于实际生产中的微生物限度检查。
6. 验证报告编制：根据验证实验的结果和结论，编制验证报告。
五、验证内容本次验证主要包括如下内容：1. 对选择的验证样品进行微生物限度检查。
2. 对验证样品进行菌落计数。
3. 对验证样品进行培养方法的验证。
4. 对不同微生物种类的检查方法进行验证。
5. 对不同微生物菌株的适应性进行验证。
六、风险评估在验证过程中，存在一定的风险因素，需进行风险评估，确保验证结果的可靠性和准确性。
风险评估主要包括验证样品来源的可靠性、实验操作的准确性、验证条件的合理性等。
七、验证结果与讨论根据验证实验的结果和数据分析，可以得出下列结论：1. 所验证的微生物限度检查方法在实际应用中的准确性和可靠性较高。
2. 所验证的微生物限度检查方法适用于不同药品制剂类型的微生物限度检查。
无菌检查方法的验证
无菌检查方法的验证无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法，是作为无菌产品批放行的重要依据及药监部门对无菌产品质量监管的一个重要项目。
因此如何确保无菌检查方法的准确可靠至关重要，而检查方法的验证是保证检查结果的公正、科学和准确的基础，因此各个主要国家的gmp或药典都对无菌检查方法的验证提出了严格的要求，2021版中国药典对分析方法验证和检查的要求也有大幅度的提高，同时也是gmp检查中检查的重点和容易发现问题的区域。
验证要求与方法无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。
前检验，也表示进度表检验，所指在无菌分析方法正式宣布采用前，按照原订检验方案展开的检验。
如果没充份的理由，任何检查方法必须展开前检验。
再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。
通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的建议确认与否须要展开前处置;然后根据产品的特性与否存有杀菌性，确认与否须要减少除去产品杀菌性的方法;最后检验整个检查方法中使用的一切及试验过程中的每一个环节包含样品的预处理方式、检查过程、培育条件等均不影响样品中微生物的生长。
这里，检验的重点环节包含：前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。
供试品中杀菌活性的除去就是当前检验工作的重点，尤其特别强调应当充份检验供试品本身对微生物生长的影响。
具体内容的检验方法如下：菌种的挑选无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[cmcc(b)63501]代表药品中常见的污染菌――芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[cmcc(b)26003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌[cmcc(b)64941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[cmcc(b)44102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[cmcc(f)98001]代表酵母菌、黑曲霉菌[cmcc(f)98003]代表霉菌。
无菌检查方法学验证
2006年8月
无菌检查方法学验证
方法学验证资料试验结论
采用的方法：薄膜过滤法/直接接种法 关键实验点：如冲洗条件、中和、酶处
理等因素
2006年8月
无菌检查方法学验证
三、验证及资料中常见的问题
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
2006年8月
无菌检查方法学验证
菌株选择的原则:代表性,普遍性,易存活、低或非致病 性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。
国药典发[2005]98号
各药品检验所： 根据国食监注[2005]234号“关于颁布和执
行《中国药典》2005年版有关事宜的通知” 规定，《中国药典》7月1日起开始执行，各 药品检验所在执行“微生物限度检查法”和 “无菌检查法”过程中遇到了一些问题，为 保证《中国药典》2005年版的顺利实施，现 就有关问题说明如下：
2006年8月
无菌检查方法学验证
直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫 乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于 100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取 符合直接接种法培养基用量要求的改良 马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的 白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接 人规定量的供试品，另1管作为对照，按 规定的温度培养3～5天。
2006年8月
5-无菌及微生物检查方法验证
细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其 特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式 繁殖。
细菌的形态
⒈细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观 察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百 倍至上千倍才能观察。
⒉一般以微米（µ m）作为测量单位。 ⒊在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌
薄膜过滤法
过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般 薄膜过滤器。 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性。பைடு நூலகம்
⒈可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂 供试品。
⒉水溶性供试品直接过滤。
⒊可溶性固体制剂供试品。
⒋装有药物的注射器供试品和具有导管的医 疗器具的供试品。
直接接种法
供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养 基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养 基量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体 积的10%。同时硫乙 醇酸盐培养基不得少于 15ml、改良马丁培养基不得少于10ml，培养基 用量和高度应经方法验证。
⑷ 重新验证
药品的生产工艺、制剂组分、检验方法或检验 条件发生改变时，应重新进行验证，以确认所 发生的变化不影响该药品中的微生物检查。
验证试验用菌株的要求
⑴验证试验用菌株应有代表性。 ⑵试验菌株应选择非致病性菌株。 ⑶试验菌宜选择比较稳定、重现性强的菌株。 ⑷菌株传代次数不得超过第五代。
试验用菌株的储藏
药品无菌检查和微生物检查方法验证
方法验证的必要性 ⒈为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确
的检验方法是至关重要的。因此试验前必须对 选择的方法进行验证。 ⒉证明所采用的方法是适宜的，确认所采用的方 法适宜于被检供试品的微生物污染的检验。
检验结果的影响因素
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阴性对照
供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释 液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴 性对照不得有菌生长。
无菌检查法
包括薄膜过滤法和直接接种法。 只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。
⑴ 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控 结果不符合无菌检查法的要求。
⑵ 回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染 的因素；
⑶ 阴性对照管有菌生长。
⑷ 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物 生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌 操作技术不当引起的。
作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的 可靠性，实现一次检出的要求。 ⒉是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来 的污染。 隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境 的洁净度须符合无菌检查的要求。 日常检验还需对试验环境进行监控。
培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 0.5%葡萄糖肉汤培养基
制备好的培养基应在2-25℃、避光保存； 保存在非密容器中，应在3周内使用；保 存在密闭容器中，可在1年内使用。
培养基的适用性检查
无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支，培养14天应无菌 生长。试验可与无菌试验同时进行。
灵敏度检查
菌种 菌液制备 黑曲霉菌液的制备 培养基接种 参照中国药典2010版
制备培养基的要求
⒈培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结 束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度 1/2。 ⒉培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5， 否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超 过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。 ⒊配制好的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
培养基的贮存
结果判断
空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长 良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 试验同时应做空白对照
稀释液、冲洗液
0.1%蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜 的溶液作为稀释液、冲洗液。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭 菌后加入表面活性剂或中和剂等。
霉菌菌落形态
霉菌在孟加拉红培养基上的形态
酵母菌显微镜下形态
无菌检查法
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医 疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一 种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表 明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
试验环境 检验依据
无菌保障
隔离系统的应用
应用隔离系统重要的目的 ⒈是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操
根霉属（RhizopusEhrenberg）
根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食 品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。
曲霉属（Aspergillus）
曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚 有色物质，为有隔的多细胞。本属的 常见产毒霉菌有8个种，具有强烈的 致癌性。
青霉属
菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出， 无足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一 级分枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。 本属的常见产毒霉菌有9个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种 神经毒素，并具有致畸、致突变和致癌性；
和螺杆菌。 ⒋经革兰染色法（Gram stain）可将细菌分成两大
类：即革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）。
真菌（fungus；eumycetes）
是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道 的种超过10万个。大多是由纤细管状菌丝构成的 菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在 基质上生长的形态称为菌落。
真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼
可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至 千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单 细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（yeast）。多 细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。
药品污染常见的真菌
毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属 一、毛霉属（Mucor Micheli ex Fries） 毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并 引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。
细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其 特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式 繁殖。
细菌的形态
⒈细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观 察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百 倍至上千倍才能观察。
⒉一般以微米（µ m）作为测量单位。 ⒊在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌
薄膜过滤法
过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般 薄膜过滤器。 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性。
⒈可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂 供试品。
⒉水溶性供试品直接过滤。
⒊可溶性固体制剂供试品。
⒋装有药物的注射器供试品和具有导管的医 疗器具的供试品。
直接接种法
供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养 基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养 基量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体 积的10%。同时硫乙 醇酸盐培养基不得少于 15ml、改良马丁培养基不得少于10ml，培养基 用量和高度应经方法验证。
无菌检查及微生物检查方法
介绍内容
一、微生物的基础知识 二、无菌检查方法
微生物基础知识
微生物（microorganism, microbe）是一些 肉眼看不见的微小生物的总称。 微生物（microorganism）包括细菌、支原 体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌 （霉菌、酵母菌和放线菌）等。
培养及观察
培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外 观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至 同种培养基或斜面上，培养细菌2天、真菌3天， 观察有无菌生长或镜检进行判断。 阴性对照不得有菌生长。
结果判断
⒈若供试品管均澄清，或虽显浑浊无菌生长，判 供试品符合规定。 ⒉若供试品中任何1管显混浊并确证有生长供试品 不符合规定。 ⒊除非能充分证明，检出的微生物非供试品所含。 ⒋当符合下列至少一个条件时，方可判复试。