5无菌及微生物检查方法验证

培养及观察
培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外 观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至 同种培养基或斜面上，培养细菌2天、真菌3天， 观察有无菌生长或镜检进行判断。 阴性对照不得有菌生长。
结果判断
⒈若供试品管均澄清，或虽显浑浊无菌生长，判 供试品符合规定。 ⒉若供试品中任何1管显混浊并确证有生长供试品 不符合规定。 ⒊除非能充分证明，检出的微生物非供试品所含。 ⒋当符合下列至少一个条件时，方可判复试。
阳性对照 根据供试品特性选择阳性对照菌： 无抑菌作用及抗革兰阳性菌 抗革兰阴性菌 抗厌氧菌 抗真菌 加菌量 结果判断
阴性对照
供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释 液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴 性对照不得有菌生长。
无菌检查法
包括薄膜过滤法和直接接种法。 只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。
作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的 可靠性，实现一次检出的要求。 ⒉是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来 的污染。 隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境 的洁净度须符合无菌检查的要求。 日常检验还需对试验环境进行监控。
培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 0.5%葡萄糖肉汤培养基
制备培养基的要求
⒈培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结 束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度 1/2。 ⒉培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5， 否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超 过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。 ⒊配制好的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
培养基的贮存
根霉属（RhizopusEhrenberg）
根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食 品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。
曲霉属（Aspergillus）
曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚 有色物质，为有隔的多细胞。本属的 常见产毒霉菌有8个种，具有强烈的 致癌性。
青霉属
菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出， 无足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一 级分枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。 本属的常见产毒霉菌有9个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种 神经毒素，并具有致畸、致突变和致癌性；
薄膜过滤法
过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般 薄膜过滤器。 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性。
⒈可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂 供试品。
⒉水溶性供试品直接过滤。
⒊可溶性固体制剂供试品。
⒋装有药物的注射器供试品和具有导管的医 疗器具的供试品。
直接接种法
供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养 基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养 基量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体 积的10%。同时硫乙 醇酸盐培养基不得少于 15ml、改良马丁培养基不得少于10ml，培养基 用量和高度应经方法验证。
细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其 特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式 繁殖。
细菌的形态
⒈细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观 察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百 倍至上千倍才能观察。
⒉一般以微米（µ m）作为测量单位。 ⒊在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌
真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼
可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至 千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单 细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（yeast）。多 细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。
药品污染常见的真菌
毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属 一、毛霉属（Mucor Micheli ex Fries） 毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并 引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。
结果判断
空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长 良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 试验同时应做空白对照
稀释液、冲洗液
0.1%蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜 的溶液作为稀释液、冲洗液。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭 菌后加入表面活性剂或中和剂等。
⑴ 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控 结果不符合无菌检查法的要求。
⑵ 回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染 的因素；
⑶ 阴性对照管有菌生长。
⑷ 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物 生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌 操作技术不当引起的。
和螺杆菌。 ⒋经革兰染色法（Gram stain）可将细菌分成两大
类：即革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）。
真菌（fungus；eumycetes）
是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道 的种超过10万个。大多是由纤细管状菌丝构成的 菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在 基质上生长的形态称为菌落。
霉菌菌落形态
霉菌在孟加拉红培养基上的形态
酵母菌显微镜下形态
无菌检查法
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医 疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一 种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表 明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
试验环境 检验依据
无菌保障
隔离系统的应用
应用隔离系统重要的目的 ⒈是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操
制备好的培养基应在2-25℃、避光保存； 保存在非密容器中，应在3周内使用；保 存在密闭容器中，可在1年内使用。
培养基的适用性检查
无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支，培养14天应无菌 生长。试验可与无菌试验同时进行。
灵敏度检查
菌种 菌液制备 黑曲霉菌液的制备 培养基接种 参照中国药典2010版
无菌检查及微生物检查方法
介绍内容
一、微生物的基础知识 二、无菌检查方法
微生物基源自文库知识
微生物（microorganism, microbe）是一些 肉眼看不见的微小生物的总称。 微生物（microorganism）包括细菌、支原 体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌 （霉菌、酵母菌和放线菌）等。