L-色氨酸

L-色氨酸的生产及其代谢控制育种

摘要本文综述了利用微生物生产L-色氨酸的各种方法和L-色氨酸的生物合成

途径及其代谢调控机制，并介绍了利用重组DNA技术选育L-色氨酸高产菌的研究现状。

L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，为白色或略带黄色叶片状结晶或粉末，水中溶解度1.l4g(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解。微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。它是人体和动物生命活动中必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。在生物体内，从-色氨酸出发可合成5-羟基色胺等激素以及色素、生物碱、辅酶、植物激素等生理活性物质，可预防和治疗糙皮病，同时具有消除精神紧张、改善睡眠效果等功效。色氨酸代谢失凋会引起糖尿病和神经错乱，因此在医学上被用作氨基酸注射液和复合氨基酸制剂。另外，由于色氨酸是一些植物蛋白中比较缺乏的氨基酸，用它强化食品和做饲料添加剂对提高植物蛋白质的利用率具有重要的作用，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。

1.色氨酸的生产方法

色氨酸的生产最早主要依*化学合成法和蛋白质水解法，但是随着对微生物法生产色氨酸研究的不断深入，这种方法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。近年来还出现了将直接发酵法与化学合成法相结合、直接发酵法与转化法相结合生产色氨酸的研究。另外，重组DNA技术在微生物育种和酶工业上的应用极大地推动了直接发酵法和酶法生产色氨酸的工业化进程。

1.1微生物转化法

亦称前体发酵法。这种方法使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成色氨酸所需的前体物如邻氨基苯甲酸、吲哚等，利用微生物的色氨酸合成酶系来合成色氨酸。这种方法同直接发酵法一样，需要解除生物合成途径中大部分酶所受到的反馈调节，以使色氨酸能够高浓度蓄积。另外，所添加的前体物大都是抑制微生物生长的，因此添加量不可过高，一般采取分批少量添加的方法。同时可以筛选前体物的抗性突变株来提高前体物的添加量。例如采用枯草杆菌的5-FT抗性突变株SD-9在15L含6%葡萄糖的培养基中培养，在培养过程中每次添加少量6%的邻氨基苯甲酸溶液共2L，经120h后可生产色氨酸9.6g/L。微生物转化法的不足在于当转化液中前体物浓度较高时，转化率有所下降。另外，前体物的价格比较昂贵，不利于降低成本。

1.2酶法

酶法是利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸。这些酶包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。根据提供这些酶的微生物种类数，可以分为双酶菌法和单酶菌法两种类型。该法既可以直接加入细胞壁溶解酶使细胞破壁后再使用，也可以将所需的酶固定化后再使用，一般由酶源菌体的培养、菌体的分离洗涤、固定化和反应几个阶段组成。例如利用大肠杆菌的色氨酸合成酶和恶臭假单孢菌的丝氨酸消旋酶，以吲哚和DL-丝氨酸为底物，在200L反应罐中反应24h，色氨酸产量可达到28.5g/L。利用黄杆菌AF39l2的酶系，以DL-5-吲哚甲基乙丙酚脲为底物，同时在反应液中加入适量的苯肼或野芝麻花碱以抑制色氨酸氧化酶的活性而阻止色氨酸的降解，L-色氨酸的产量可达8.8g/L。酶法能够利用化工合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易的优点，是一种成本较低的生产色氨酸的工业化生产方法。

1.3直接发酵法

该法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生产菌种来生产色氨酸。对这种方法的研究进行的比较早，但在相当长的一段时间内达不到工业化生产的要求。主要原因是从葡萄糖到色氨酸的生物合成途径比较漫长，其代谢流也比较弱，而且色氨酸的合成需要多种前体物(如PRPP等)，若想进一步提高色氨酸的积累量就必需设法增强合成这些前体物的代谢流。另一方面，色氨酸生物合成途径中的调控机制比较复杂，除了反馈调节这一粗调系统之外，还存在着细调系统－弱化子系统。随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，为优良的色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可*的技术保障，使微生物直接发酵法生产色氨酸成为一种廉价的工业化生产方法。例如从大肠杆菌

EMS4-C25中分离得到抗反馈调节的色氨酸操纵子，并将其克隆到质粒pUCI9和pHSG576中分别得到重组质粒pTC7O1和pTC576。将pTC576转化到大肠杆菌中，该菌经过17h的分批发酵积累色氨酸l6g/L。Ikeda等将带有DAHP合成酶(DS)

和色氨酸合成酶(F)的质粒引入产色氨酸的谷氨酸棒杆菌KYl0-894中，使色氨酸的产量提高了54%，达到了66g/L。

l.4 其他生产方法的研究

这些方法主要是将上述几种方法有机地结合起来进行色氨酸的生产。主要有直接发酵法与化学合成法、酶法相结合，其特点是利用发酵法廉价提供一种前体物，再结合其它方法的优势进行生产。例如，利用黄色短杆菌P390直接发酵积累L-谷氨酸-y-半醛(GSA)达13.2g/L，然后将发酵液适当稀释后加入含苯肼的

1mol/L H2SO4中加热回流1h之后，48%的CSA可转化为 L-色氨酸。利用落叶松草AHU9382以5%葡萄糖为碳源发酵3d可积累丙酮酸22-26.5g/L，然后加入吲哚、氯化铵和具有高色氨酸酶活性的产气肠杆菌培养，12h之后可积累L-色氨酸

l5g/L。

2.色氨酸发酵的代谢控制育种

近年来，色氨酸作为必需氨基酸在输液、健康食品、饲料添加剂上的应用日益广泛，随着蛋氨酸、赖氨酸的大量饲料化应用，价格一直较高的色氨酸更希望有廉价制造的工业化生产方法，以便推进色氨酸的应用饲料化的实施。在我国对

直接发酵法生产色氨酸虽作了一些研究工作，但发酵产酸水平较低，还没有得到可应用于工业化生产的稳定的高产菌株，因此，研究色氨酸的生物合成途径及代谢调节机制，用代谢控制育种和基因工程的方法构建色氨酸高产菌株就十分必要。

2.1出发菌株的选择

色氨酸发酵的生产菌种有谷氨酸棒杆菌(C·glutamicum)、黄色短杆菌(B·flavum)、枯草芽孢杆菌(B·subtilis)、大肠杆菌(E·c oli)、产朊假丝酵母(Candida utilis)等。

2.2色氨酸的生物合成途径和代谢调节机制

迄今被研究的所有菌株的色氨酸生物合成途径都是一样的，但是其调控方式及trp基因的表达等却有很大的不同。这些不同点主要有：

（1）DS酶所受的调节方式不同。在大肠杆菌、粗糙脉孢菌等微生物中有3种DS 酶，这些同功酶分别受3种芳香族氨基酸的反馈调节。在谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌中只有一种DS酶，它受L-Phe和L-Tyr的协同反馈抑制。枯草芽孢杆菌中的DS酶受顺序反馈抑制。

（2）和色氨酸生物合成有关的基因的顺序和结构不同。在肠杆菌中对色氨酸的合成进行调控的基因组成一个单一的操纵子，而且它们排列的顺序也都是一样。在乳糖发酵短杆菌中也是单一的操纵子结构，但在非肠杆菌和真核生物中这种结构却并不多见。

（3）对结构基因表达的调控方式不同。在大肠杆菌等肠杆菌中，依*阴遏系统和转录的弱化机制来对和色氨酸生物合成有关的结构基因的表达进行调控，在枯草芽孢杆菌中需要RegA和mtrB基因来参与对转录弱化的调控和RNA结合蛋白的调节。在铜绿假单孢菌中，trpI基因编码的转录激活因子在吲哚甘油磷酸存在时诱导rtpB、trpA基因的表达。在有些微生物中，只有转录的弱化机制对基因的表达进行调控。

色氨酸的生物合成途径和代谢调节机制（以黄色短杆菌为例），邻氨基苯甲酸合成酶（AS）被色氨酸反馈抑制1.5umol/L的Trp使其活性丧失50％，抑制常数Ki为0.44umol/L，10umol/L的Try 几乎完全抑制其活性，这种抑制作用大大强于大肠杆菌和枯草芽胞杆菌中的AS酶所受的抑制作用。对于AS酶的底物分支酸来说，抑制是竞争性的，而对于另一种底物谷氨酰胺，抑制是反竞争性的。邻氨基苯甲酸磷酸核糖移换酶（PRT）不与AS形成复合体，主与大肠杆菌有所不同。它也受Trp的反馈抑制，其抑制常数Ki为0.26mmol/L。对于该酶的两个底物邻氨基苯甲酸核糖焦磷酸来说，抑制都是非竞争性的。TS酶乳受Trp的反馈抑制，其抑制常数为2.0mmol/L，约比PRT的Ki高一个数量级，对于其底物丝氨酸来说，抑制是竞争性的。此外色氨酸专一合成途径中的所有酶均受到Try

的反馈阻遏，但它们的活性系数各不相同，显示出不同程度的阻遏效应。