不同组织的蛋白提取方法99

不同组织的蛋白提取方法

2017-07-18

不同组织的蛋白提取方法

一、植物组织蛋白质提取方法

1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。

3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

4、提取上清夜，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml

1、1Mtris-HCl（PH8）45ml

2、甘油（Glycerol）75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone6g

这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

或者用三氯醋酸―丙酮沉淀法，离子浓度小的1、在液氮中研磨叶片

2、加入样品体积3-204℃8000rpm以上1

3、的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1

4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000r pm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

药品：

提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮

裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的'DTT65ul/ml。

二、组织：肠黏膜

应用TRIPURE提取蛋白质步骤：

含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）

倒转混匀，置室温10min

离心：12000g，10min，4度，弃上清

加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）

振荡，置室温20min

离心：7500g，5min，4度，弃上清

重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次

沉淀中加入100％乙醇2ml

充分振荡混匀，置室温20min

离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀

1％SDS溶解沉淀

离心：10000g，10min，4度

取上清-20度保存（或可直接用于BLOT存在的问题：加入1％SDS4度离心后又多了白色沉定，SDS左右。

2XBUFFER，然后煮5－10三、材料：细菌蛋白

2%的SDS，20mmol的2-巯基乙醇

四、肿瘤组织

0-4°C生理盐水冲洗组织表面血迹，以1：9（即100ug重量加入900ul体积）的比例加入蛋白匀浆提取液，0-4°C冰水混合物中用1ml匀浆器制成10%的蛋白匀浆。匀浆在10000G离心10-15分钟，取上清备用。

注：蛋白匀浆提取液(PH7.6)：Nacl50mMTris10mMEDTA1mM，PMSF1mM，

Na3VO4.12H2O0.5mMNaF50mMBenzamidine1mM

五、脑组织

将切取的组织用4℃预冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的PBS，将组织称重，将0.1G组织放入1ml的玻璃匀浆器，加入800l裂解液在冰

上充分匀浆，将得到的匀浆液用液氮反复冻融3次，室温静置30mins，

4℃15000r/min离心1h，小心避开脂层，吸取上清，分装，-80℃保存。

裂解液配方如下：

尿素7mol/l

硫脲2mol/l

CHAPS4%(m/v)

DTT65Mmol/L(上样前临加)

IPGBuffer0.5%(V/V)(上样前临加)

PMSF2ug/l(m/V)(上样前临加)

DNA酶12ug/l(m/V)(上样前临加)

RNA酶A2ug/l(m/V)(上样前临加)

六、细胞系蛋白提取

1.用枪吸弃培养板中的培养基，PBS避免细胞脱壁）

2.加1ml预冷的PBS

3.4℃

上清得细胞沉淀

4.6孔板60ul/孔，培养瓶100ul/孔）重悬细30min（不定时轻弹EP管，使细胞混悬于裂解液中，从而使裂解充分，也可不弹）

5.4℃12000rpm20min离心，取上清于新EP管中4000rpm3min离心，弃

CellLysisBuffer

组分浓度：20mMTris-HClPH7.5

150mMNacl

1mMEDTA

0.5%NonidetP-40

1mM钒酸钠

1mMPMSF

PIS（蛋白酶抑制剂）

配制方法

20mMTris-HClPH7.5

150mMNacl

1mMEDTA

调完PH后加0.5%NonidetP-40

裂解细胞时下列溶剂（全部溶解）以1:100比例加入裂解液中

100mM钒酸钠（粉剂配成100mM后分装于1.5mlEP管中-20度储存）

100mMPMSF（粉剂配成100mM后分装于1.5mlEP管中-20度储存，避光）PIS （蛋白酶抑制剂）（-20度储存）

七、酵母蛋白的提取方法

1准备SD/-Leu或是YPD培养基20ml，酵母过夜培养，30℃，230rpm。2测OD600约1.0。

3100ml过夜培养物，1000g，离心，，44弃上清，重悬于80ul抽提

buffer0.1MTris-Cl（PH7.5），0.2M，20％甘油，5mMEDTA，1mMPMSF。

(100×)：PMSF，RT保存。

533ul（425-600um）。冰上操作，涡流10min6回收玻璃珠，并尽可能取上清到另一预冷的玻璃管中。

740ul的抽提buffer，同上涡流。

8离心后分离上清（回收玻璃珠）。

9液氮快速冷冻，-70℃储存。