肝组织蛋白提取

1肝组织蛋白的提取

准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作均在冰上）

1）取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状

2）加入组织裂解液约500μL（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20~30min

3）吸取组织液到已高压灭菌的Ep管中，4℃离心，12000rpm×15min 4）取出EP管放在冰盒内,仔细吸取上清，取2μl的上清用于蛋白浓度的测定

5）剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min 6）瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。

2. RNA抽提

1、取等量肝组织，液氮中磨碎；

2、加入TRIZOL Reagent lml，室温孵育5min；

3、 )b[I)k2001al氯仿剧烈振荡l 5sec，室温孵育2min；

4、 4℃，12，000rpm，离心15min；

5、吸取上层含有RNA的水相入新管，Dla入500rtl异丙醇沉淀RNA，室温孵育l 0min；

6、 4℃，12，000rpm，离心l 5min；

7、弃上清，加入lml 75％的乙醇洗涤RNA沉淀，4"C，75009，离一L,5min；

8、干燥RNA，用20tal DEPC水溶解RNA；

9、用紫外分光光度计测定RNA的含量，．20℃保存，准备做RT．PCR。

2蛋白浓度测定

1）蛋白标准液（用BSA配制）25mg/ml储存液，稀释为0.5mg/ml，稀释步骤：例：10μL 25mg/ml的蛋白标准液＋90μL PBS混合成2.5mg/ml蛋白标准液20μL 2.5mg/ml的蛋白标准液＋80μL PBS混合成0.5mg/ml蛋白标准液2）需设置八个标准孔以绘出标准曲线，采用BCA试剂盒测出蛋白浓度，标准孔设置及所加试剂量如下：

试剂添加量（μL）

蛋白标准液

3）配制BCA蛋白测定液，溶液A：溶液B=50：1先混合均匀，至完全互溶备用4）待测蛋白孔加：2μL蛋白液+18μL PBS，每孔的体积均为20μL

5）每孔加180μL配好的BCA蛋白测定液，使每孔总体积均为200μL；

6）室温避光放置两个小时或37℃放置30min；

7）用酶标仪测出每孔的吸光度，（570nm），测三次；

8）用excel工具根据标准孔的数据作散点图，并做出直线及公式。以标准孔的浓度为X轴（分别为0，0.0025，0.005，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05），以所测标准孔的吸光度为Y轴，绘制线性关系图，并取相关度（R2值）最高的公式代入计算出需测的蛋白浓度，进而计算出做Western的每孔加样量=（所需上样的蛋白量）/（蛋白浓度×100）μL。

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