肝组织蛋白提取
Westernblot法检测大鼠肝组织清蛋白的表达实验
蛋白质的分离与电泳
蛋白质的分离与电泳是Westernblot法的关键步骤之一。通过电泳，将复杂的蛋白质混合物根据分子量大小进行分离，以便 后续的转膜和检测。
常用的电泳方法包括SDS-PAGE和Native-PAGE，前者利用SDS将蛋白质变性并带负电荷，根据分子量大小分离；后者则在不改变 蛋白质天然电荷和形状的情况下进行分离。
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详细描述
实验结果表明，清蛋白在正常大鼠肝组织中高表达， 而在肝损伤大鼠肝组织中表达量明显降低。这可能是 因为清蛋白合成减少或降解增加导致其在肝损伤大鼠 肝组织中的表达量降低。此外，我们还发现清蛋白表 达量与肝组织病变程度呈负相关，这提示清蛋白可能 对肝组织的保护作用。因此，我们推测清蛋白可能通 过某种机制参与了肝组织的保护作用，具体机制需要 进一步研究。
处理肝组织样本
将肝组织样本进行匀浆处理，以充分破碎细胞，释放出细胞内的清蛋白。
蛋白质的提取与定量
蛋白质提取
利用细胞裂解液将处理后的肝组 织样本中的蛋白质提取出来。
蛋白质定量
利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对 提取出的蛋白质进行定量，以确 保后续实验的准确性。
电泳与转膜
电泳
将提取出的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分 离，以便将不同大小的蛋白质分开。
荧光染料等）。
通过免疫杂交，目标蛋白质与特异性抗体结合，形成 复合物。
显色反应是利用标记物催化底物生成有色产物，从而 在膜上显示出目标蛋白质的位置和量。常见的显色反
应包括酶促反应和化学发光反应。
03
实验步骤
肝组织样本的收集与处理
收集大鼠肝组织样本
在实验动物大鼠处死后，迅速取出肝组织，并立即放入液氮中冷冻保存。
膜蛋白提取
1分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。
3、100000g，4℃离心1hr。
弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
4、收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
2取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。
样品蛋白含量测定采用酚试剂法。
3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。
将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。
2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。
m6A甲基化修饰识别蛋白YTHDF2在肝癌组织中的表达及临床意义
现代生物医学进展 Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO.9 MAY.2021•1601 •doi: 10.1324 l/j.c n k i.p m b.2021.09.001•基础研究•m6A甲基化修饰识别蛋白YTHDF2在肝癌组织中的表达及临床意义*王月帆1葛春梅1尹昊瓒1戴智慧1董峻鹏1季曼1李雯2杨富1△(1海军军医大学医学遗传学教研室上海200433 ;2东方肝胆外科医院肝外-科上海200438)摘要目的：探讨m6A 甲基化修饰结合蛋白YTHDF2(YTH domain-containing family protein 2)在肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC)组织中的表达及临床意义。
方法：1)采用Western b lo t和实时焚光定量PCR(Quantitative Real Time PCR，qRT-PCR)检测20对肝癌和癌旁组织中Y TH DF2在蛋白和m R N A水平的表达情况。
2)通过免疫组织化学（Immunochemistry，IHC)检测40对肝癌和癌旁组织芯片Y TH D F2的表达情况，并以H-score评分法进行半定量分析。
3)通过基因表达谱数据动态分析数据库GEPIA (/)分析YTH DF2在肝癌组织中的表达及对患者生存预后的影响；通过胖瘤免疫评估资源数据库TIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析YTHDF2与肝癌免疫微环境的相关性：结果：相比于癌旁肝组织，YTHDF2在肝癌组织中蛋白和m R N A水平均显著高表达(/><0.05);G E P IA数据库分析验证:YTHDF2肝癌组织表达水平高于正常肝组织，且YTHDF2在肝癌不同分期中表达水平均高于正常肝组织(P=0.0206),Stage III期最为明显;Y TH D F2高表达患者的总体生存率(Overall Survival, OS) 和无复发生存率(Disease Free Survival, DFS) 均较差(卢0.00027 和 P=0.013);TIMER 数据库分析表明：YTHDF2 在肝癌免疫微环境中与各类免疫细胞呈正相关(P C0.05),但肝癌患者的累积存活率不受免疫细胞的影响（P>0.05),Y T H D F2高表达对患者的生存预后具有不良影响(P=0.007)。
肝纯化实验报告
实验目的：本实验旨在从新鲜动物肝脏中分离、提取并纯化某种酶，并通过一系列纯化步骤得到高纯度的酶蛋白，以进行后续的鉴定和分析。
实验材料：1. 新鲜动物肝脏2. 丙酮3. 三氯甲烷4. 氨水溶液5. 乙酸溶液6. 硫酸铵7. 磷酸盐缓冲液8. 阴、阳离子交换层析柱9. 凝胶层析柱10. 微孔滤膜11. 超滤装置12. 冻干机13. pH计14. 离心机15. 研磨器16. 过筛器17. 实验记录本实验步骤：1. 脱脂肝粉制备：- 将新鲜动物肝脏切成碎块，搅碎后充分匀浆。
- 向匀浆中加入丙酮，充分搅拌后离心，收集沉淀。
- 将沉淀干燥，研磨、过筛后收集细粉。
- 将肝粉颗粒加入三氯甲烷，充分搅拌后抽滤，重复两次，收集滤饼并干燥。
2. 酶粗品制备：- 将干燥的肝粉用氨水溶液恒温抽提两次，合并滤液。
- 将所得水溶液用乙酸溶液酸化，离心后收集上清液。
- 将上清液调pH至中性，用硫酸铵初次盐析，离心后收集上清。
- 再次用硫酸铵盐析，收集沉淀，得到酯酶粗品。
3. 精制：- 将粗品用磷酸盐缓冲液溶解，经过阴、阳离子交换层析柱纯化，接收主峰。
- 将接收的主峰浓缩，再经过凝胶层析柱分离，接收主产物峰。
4. 超滤、浓缩、冻干：- 将收集的溶液用微孔滤膜预过滤后，进行超滤和浓缩。
- 将浓缩后的溶液在冻干机中冻干，得到纯化的酶蛋白。
实验结果：通过上述实验步骤，成功从肝组织中提取并纯化了某种酶。
纯化后的酶蛋白经过鉴定，其纯度达到了预期目标。
实验分析：1. 脱脂肝粉的制备过程中，丙酮和三氯甲烷的使用有助于去除脂质杂质，提高酶的提取效率。
2. 酶粗品的制备过程中，氨水溶液的抽提和硫酸铵的盐析是提高酶蛋白纯度的重要步骤。
3. 精制过程中，阴、阳离子交换层析柱和凝胶层析柱的应用进一步提高了酶蛋白的纯度。
4. 超滤、浓缩和冻干等步骤有助于去除溶剂和低分子量杂质，提高酶蛋白的稳定性。
实验结论：本实验成功地从新鲜动物肝脏中分离、提取并纯化了某种酶，为后续的酶学研究和应用奠定了基础。
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。
但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，- 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
尽量要新鲜原料。
但有时这几方面不同时具备。
含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。
一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。
要事前调查制备的难易情况。
若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。
如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。
但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。
研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。
可能时尽量用全年均可采到的原料。
对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
2、前处理a、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。
要剔除结缔组织及脂肪组织。
如不能立即进行实验，则应冷冻保存。
除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。
不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。
如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。
肝脏蛋白的提取和浓度测定.
实验步骤
1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:
为准
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法 BCA法 紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年 由 Bradford 建 立 的 考 马 斯 亮 兰 法 （Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。
1.肝脏组织的提取
组织取材
操作 步骤
超声匀浆 冰上放置 4度离心
吸取上清
1.肝脏组织的提取
（1）组织取材：
取约100mg大鼠 肝脏组织，用灭菌 的剪刀将组织块尽 量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中
1.肝脏组织的提取
（2）超声匀浆：
加0.5mlRIPA裂解 液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀 浆器进行匀浆,超声 每次10秒，重复3次管号 空白管标准管
试剂(ml)
0
1 234 5
1mg/mL牛血清
白蛋白溶液
蒸馏水 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
待测样品 – –
–
–––
考马斯亮蓝 5
5 5 55
5
G250
测定管 6
0 0 1 5
2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管
调零，测定各管吸光度值。
14
肝脏dna提取实验报告
肝脏DNA提取实验报告实验目的本实验旨在通过提取肝脏组织中的DNA，以便进一步研究和分析肝脏的遗传信息。
实验材料1.新鲜肝脏组织样本2.细胞裂解缓冲液3.蛋白酶K4.脱氧核酸酶5.异丙醇6.乙醇7.磷酸盐缓冲液8.紫外可见分光光度计实验步骤步骤一：准备工作1.将肝脏组织样本切碎，并加入细胞裂解缓冲液中，使细胞释放出DNA。
2.使用均匀器均匀搅拌细胞裂解液，使细胞裂解更加完全。
步骤二：蛋白酶K消化1.在细胞裂解液中加入适量的蛋白酶K，以消化蛋白质。
将细胞裂解液在37°C下孵育1小时，使蛋白质得到降解。
步骤三：脱氧核酸酶处理1.加入适量的脱氧核酸酶，使DNA得到降解，以去除RNA的污染。
2.在细胞裂解液中加入等体积的异丙醇，混匀并离心以沉淀DNA。
步骤四：沉淀DNA1.将离心后的上清液弃置，保留DNA沉淀。
2.加入70%的乙醇，洗涤DNA沉淀。
3.使用离心机离心，将DNA沉淀沉淀下来。
步骤五：溶解DNA1.弃去乙醇，并用磷酸盐缓冲液溶解DNA沉淀。
2.使用紫外可见分光光度计测量DNA的浓度和纯度。
实验结果通过测量，我们得到了肝脏组织中提取到的DNA的浓度和纯度。
根据实验结果，我们可以进一步分析肝脏的遗传信息，从而探究肝脏功能和疾病的相关性。
结论通过本实验，我们成功地提取了肝脏组织中的DNA，并得到了其浓度和纯度。
这为进一步的研究提供了基础，有助于深入理解肝脏的遗传信息和其与疾病之间的关系。
此外，我们的实验方法还可以应用于其他组织的DNA提取，有助于开展更广泛的遗传研究。
肝组织总蛋白提取的标准操作规程
肝组织总蛋白提取的标准操作规程（编号：025）
1、目的及适用范围
该SOP用来规范肝组织总蛋白提取的操作。
2、主要仪器及试剂
均质仪、铁架台、冷冻台式离心机、微量移液器、单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX-100，100μg/mL PMSF）
3、相关器皿的预处理
剪刀和均质仪的转头需彻底清洗后高压灭菌。
4、操作步骤
4.1 将少量肝组织块置于玻璃平皿中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，同时去除结缔组织。
4.2 每100mg组织加400μL单去污剂裂解液（含PMSF）于15mL离心管中，使用均质仪进行匀浆，冰上操作。
4.3保持组织块低温状态，均质仪运行3s，停顿2s，直至组织完全碾碎成浆。
4.4 用微量移液器将裂解液移至1.5mL 离心管中，然后在4℃ 12000rpm离心5min，取上清分装于0.5mL离心管中并置于-20℃保存。
5、问题向导
蛋白得率低可能原因：
5.1 组织裂解不彻底
5.2 提取过程中的蛋白降解
6、注意事项
注意初始组织块的处理，尽量剪碎，尽量去除结缔组织。
匀浆彻底，同时保证匀浆过程低温，防止蛋白降解。
根据提取效果，适当调整Detergent的成分。
附：单去污剂裂解液配制方法
单去污剂裂解液：50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX-100，100μg/ml PMSF 1moL/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5mL
NaCl 0.438g
50。
肝脏提取酶
蛋白质粗提取
步骤： 步骤：
1、配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀硫酸或 配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀硫酸或 PH 氨水调PH PH到 氨水调PH到6.2 2、将酶溶液与硫酸铵溶液混合，静止一段时间 将酶溶液与硫酸铵溶液混合， 3、离心，去上清，留沉淀 离心，去上清， 4、加蒸馏水溶解，将溶液放入透析袋中透析，得含酶的 加蒸馏水溶解，将溶液放入透析袋中透析， 溶液
步骤： 步骤：
若结合酶含有辅基，则直接加入底物， 若结合酶含有辅基，则直接加入底物，根据生成物的 性质进行生成物的鉴定 若结合酶含有辅酶，则加入辅助因子（ 若结合酶含有辅酶，则加入辅助因子（小分子有机化 合物和金属离子） 合物和金属离子）然后再加入底物鉴定
鉴定提取纯度
SDSSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： 原理：
SDS-PAGE常用来检测蛋白质样品的纯化程度，如果被鉴定 常用来检测蛋白质样品的纯化程度， 常用来检测蛋白质样品的纯化程度 的蛋白质很纯， 的蛋白质很纯，只含有一种三级结构的蛋白质或含有相同分子量 亚基的具有四级结构的蛋白质，那么SDS-PAGE后就只出现一条 亚基的具有四级结构的蛋白质，那么 后就只出现一条 蛋白质区带。 蛋白质区带。 不连续凝胶电泳的支持体由分离胶和浓缩胶组成。 不连续凝胶电泳的支持体由分离胶和浓缩胶组成。上层为浓缩 下层为分离胶，两层中Acr（丙烯酰胺）浓度不同，孔径大小 胶，下层为分离胶，两层中 （丙烯酰胺）浓度不同， 就不同，带电荷蛋白质离子在浓缩胶中泳动时，因受阻力小， 就不同，带电荷蛋白质离子在浓缩胶中泳动时，因受阻力小，泳 动速度较快。当泳动到小孔径分离胶时，遇到阻力大， 动速度较快。当泳动到小孔径分离胶时，遇到阻力大，移动速度 逐渐减慢，使样品浓缩成很窄的区带。 逐渐减慢，使样品浓缩成很窄的区带。 分离胶的孔径有一定大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说， 分离胶的孔径有一定大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说， 通过时受到的阻滞不同， 通过时受到的阻滞不同，即使静电荷相等的颗粒也会由于此分子 筛的作用，将不同大小的蛋白质分开。 筛的作用，将不同大小的蛋白质分开。
动物肝脏提取实验报告
动物肝脏提取实验报告动物肝脏提取实验报告引言：动物实验在科学研究领域中扮演着重要的角色。
其中，动物肝脏提取实验是一项常见的研究方法。
本报告旨在介绍动物肝脏提取实验的背景、目的、方法、结果和讨论。
背景：肝脏是人和动物体内最重要的器官之一。
它具有多种功能，包括代谢物质、解毒、合成蛋白质等。
通过对动物肝脏的提取实验，我们可以更好地了解肝脏的结构、功能以及与其他器官的相互作用。
目的：本实验的目的是通过提取动物肝脏，研究其组织结构、代谢功能以及与其他器官的联系。
通过实验结果，我们可以进一步了解肝脏在机体中的重要性，并为相关疾病的研究提供参考。
方法：1. 实验动物选择：在本实验中，我们选择了小鼠作为实验动物。
小鼠是一种常见的实验动物，其肝脏与人类肝脏在结构和功能上有很多相似之处。
2. 动物麻醉：在进行肝脏提取实验前，我们需要对实验动物进行麻醉。
麻醉可以减轻动物的痛苦，并确保实验的顺利进行。
3. 肝脏提取：通过手术切口，在麻醉状态下，我们小心地将小鼠的肝脏取出。
在提取过程中，需要注意保持肝脏的完整性，以保证后续实验的准确性。
结果：通过对提取的小鼠肝脏进行观察和分析，我们得到了以下结果：1. 肝脏组织结构：在显微镜下观察，我们可以清晰地看到肝脏的细胞结构和排列方式。
肝脏由许多小叶组成，每个小叶由许多肝细胞组成，这些肝细胞紧密排列，形成了肝脏的基本结构。
2. 代谢功能：通过实验，我们可以检测肝脏中的代谢酶活性。
结果显示，肝脏在葡萄糖代谢、脂肪合成和解毒等方面具有重要的功能。
讨论：通过本实验，我们深入了解了动物肝脏的结构和功能。
肝脏作为人和动物体内最重要的器官之一，其在机体代谢、解毒等方面的作用不可忽视。
通过进一步的研究，我们可以探索肝脏与其他器官之间的相互作用，以及与相关疾病的关联。
然而，动物实验也存在一些伦理和道德问题。
在进行实验前，我们需要严格遵守伦理规范，确保动物的权益和福利得到保护。
同时，我们也应该积极探索替代动物实验的方法，以减少对动物的使用。
膜蛋白提取
1分离组织膜蛋白的方法：1、取组织,加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管.3、100000g，4℃离心1hr。
弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬,冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf 台式离心机10000rpm,4℃离心30min。
4、收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0。
32M 蔗糖，5mM Tris—HCl（PH 7.5）,120mM KCl,1mM EDTA,1mM EDTA, 0。
2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin.冰上预冷.Buffer B：20mM HEPES（PH 7。
5），10%甘油，2％Triton X-100，1mM EDTA，1mM EDTA, 0。
2mM PMSF，1ug/ml Leupeptin，1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
2取约0.1g肝组织,加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次,4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。
样品蛋白含量测定采用酚试剂法。
3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1．将细胞种于 T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。
将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0。
1M，NaH2PO4：0。
01M,EDTA：0.04％）加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3~5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。
2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。
高原环境对肝脏糖异生的影响及调节机制
高原环境对肝脏糖异生的影响及调节机制高原环境对肝脏糖异生的影响及调节机制本文关键词：肝脏，高原，调节，机制，环境高原环境对肝脏糖异生的影响及调节机制本文简介：机体发生一系列非遗传的、可逆的代偿性变化以适应高原低压、低氧环境的过程称为高原习服。
对于初次进入高原的人群而言，能量产生和利用的平衡是机体顺利适应高原环境的关键。
通常高原暴露时间≤2周称为急性高原暴露期，>2周称为慢性高原暴露期。
人和动物实验表明，在急性高原暴露期，心肌、骨骼肌对葡萄糖的摄高原环境对肝脏糖异生的影响及调节机制本文内容：机体发生一系列非遗传的、可逆的代偿性变化以适应高原低压、低氧环境的过程称为高原习服。
对于初次进入高原的人群而言，能量产生和利用的平衡是机体顺利适应高原环境的关键。
通常高原暴露时间≤2周称为急性高原暴露期，>2 周称为慢性高原暴露期。
人和动物实验表明，在急性高原暴露期，心肌、骨骼肌对葡萄糖的摄取增加，高糖饮食有利于机体尽快适应高原环境[1 -3].可见，糖代谢在高原习服过程中具有重要作用。
在饥饿、低氧等特殊环境中，机体会通过增加糖异生以保证组织供能。
但是，急性或慢性高原暴露情况下机体糖异生过程的变化在国内外少有报道。
肝脏是糖异生的主要场所，通过研究肝脏糖异生变化可以间接了解高原环境对机体糖代谢的影响。
葡萄糖- 6 - 磷酸酶（glucose - 6 - phosphatase,G6pase）是糖异生的关键酶，催化水解6 - 磷酸葡萄糖生成葡萄糖，转录因子叉头框蛋白O1（forkheadboxO1,FoxO1）是重要的肝脏糖异生调节因子，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate actived pro-tein kinase,AMPK）在糖代谢和脂代谢中都具有调节作用。
本研究通过观察大鼠在海拔4300 m 高原暴露1、3、7、15、30 d 时肝脏中G6Pase、FoxO1 和肝糖原含量的变化并结合本课题组的前期研究AMPK[4]的变化，以了解高原环境对肝脏糖异生的影响及调节机制。
从动物肝组织中分离、提取酶
4.离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶
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4.离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶
实验步骤：
1. DEAE-纤维素处理为PH值为6.1（Hcl） 2. 装柱与平衡（乙酸铵溶液） 3. 样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或 磺基水杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号 为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收 集第一个峰的蛋白 溶液 4. 处理DEAE-纤维素溶液为PH=6.3 5. 装柱与平衡（乙酸铵溶液） 6. 样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含 量为纵坐 标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线， 收集第二个峰的酶溶液 即为PI=6.2左右的蛋白质溶液
实验步骤：
1. 离心管中加入5ml 0.34M蔗糖，将5ml匀浆轻 轻覆在 其上，1600r/min离心10min，得上清 液（1） 2. 沉淀加10ml 0.25M蔗糖混匀，3500r/min离心 10min， 得上清液（2） 3. 将上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min 离心 10min，得上清液，即为酶体和微粒体
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实验流程：
1.取动物肝组织 2.制作组织浆液 3.动物肝酶的初步分离提取 4.离子交换柱层析法分离纯化肝酶 5.肝酶活性检验 6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度
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6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离 纯度
原理：
Acr (丙烯酰胺) + Bis (交联剂N) 网状结构凝胶 引发剂过硫酸铵（Ap），催化剂四甲基乙二胺（TEMED）
6
梯度离心获得含有酶的细胞液
原理：
离心基本原理是根据物质沉降系数、质量、 浮力因子等不同，利用离心机产生的强大 离心力来分离具有不同沉降系数的物质。 沉降系数是为颗粒在离心力场的作用下， 从静止状态到达极限速度所需要的时间。 其单位用S表示，反映的是单位离心力作用 下颗粒沉降的速度。
最全面蛋白质提取与制备的原理和方法（精华版）
最全面蛋白质提取与制备的原理和方法（精华版）蛋白质提取与制备的原理和方法蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。
但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、提取、分离及纯化蛋白质和酶。
丙酮及丁醇等有机溶剂中。
因此可采用不同溶剂蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。
故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。
温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。
提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。
将细胞内蛋白质提取出来。
并与其它不需要的物质分开。
但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。
蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。
这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。
水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。
如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。
如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin ）溶液或有机溶剂来抽提。
其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。
蛋白质类别和溶解性质白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。
真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。
拟球蛋白:析出醇溶蛋白: 及无水乙醇壳蛋白:稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白:沉淀组蛋白: 沉淀硬蛋白质: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵溶于70～80%乙醇中，不溶于水在等电点不溶于水，也不溶于溶于水和稀酸，易在稀氨水中溶于水和稀酸，易在稀氨水中不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白( 包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等): 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，优势。
实验动物肝脏提取详解演示文稿
（3）插入梳子，梳齿下端离板底0.5－1mm。 （4）在胶床上滴加2－3滴 0.5μg/mL的EB溶液。 （5）将60℃凝胶不间断倒入胶床，高3－4mm，避免气泡，摇匀，
室温下凝固。
（6）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液 ，高于胶面1－2mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气 泡。
因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实 验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常 用琼脂糖凝胶电泳。
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荧光染料EB染色 后，在紫外灯 (λ305nm)下观察
到的电泳结果：
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* 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？ 1、原理：
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荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并将 能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm和360nm 的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出波长为 590nm的红橙色荧光。
溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在 含EB的溶液中浸泡.
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更 少的DNA。
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DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中 向正极移动（电荷效应） 。 DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外，还 与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的分子筛效应 ）。 电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的确切位置。 溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个 碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激发下发出 橙黄色的荧光。
小鼠肝组织DNA的提取及其含量测定
小鼠肝组织DNA的提取及其含量测定1.2 掌握DNA提取和鉴定的方法。
实验原理：本实验所用的是DNA酚抽提法。
可用于多种来源标本的高分子量DNA样品的制备，包括单层培养细胞、悬浮生长细胞、新鲜组织以及血液标本等。
提取DNA的基本思路，DNA 以核蛋白形式存在于细胞核中。
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
它是以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚进行抽提，离心分层后，蛋白质因变性位于有机相与水相的界面，而DNA进入水相，再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染。
重复抽提DNA至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需大小范围的高分子量DNA样品。
沉淀处理常以乙酸铵为沉淀用盐，用无水乙醇沉淀。
其中EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。
SDS为生物阴离子去垢剂，SDS 可破坏细咆膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分子分离，并能与脂质和蛋白质结合使他们沉淀，同时还有降解DNA酶的作用。
无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化。
蛋白酶K 或链霉蛋白酶 E 均为广谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS 和EDTA 存在下保持很高的活性。
将蛋白质降解成小肽或氨基酸，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，使 DNA 分子完整地分离出来也有裂解细胞的作用。
酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性。
氯仿可除去微量酚。
实验材料：小鼠器材：解剖盘、解剖剪、镊子、匀浆器、微量加样枪、烧杯、试管架、EP管、低温高速离心机、紫外分光光度计试剂：生理盐水、10%的SDS溶液、饱和酚、氯仿:异戊醇(24:1)、无水乙醇、10mmol/L的乙酸铵溶液、1×TE(pH8.0)缓冲液（注：1×TE(pH8.0)缓冲液由10mmol/L(pH=8.0)的Tris-HCl和1mmol/L（pH=8.0）的EDTA 配制而成）。
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1肝组织蛋白的提取
准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作均在冰上）
1）取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状
2）加入组织裂解液约500μL（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20~30min
3）吸取组织液到已高压灭菌的Ep管中，4℃离心，12000rpm×15min 4）取出EP管放在冰盒内,仔细吸取上清，取2μl的上清用于蛋白浓度的测定
5）剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min 6）瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。
2. RNA抽提
1、取等量肝组织，液氮中磨碎；
2、加入TRIZOL Reagent lml，室温孵育5min；
3、 )b[I)k2001al氯仿剧烈振荡l 5sec，室温孵育2min；
4、 4℃，12，000rpm，离心15min；
5、吸取上层含有RNA的水相入新管，Dla入500rtl异丙醇沉淀RNA，室温孵育l 0min；
6、 4℃，12，000rpm，离心l 5min；
7、弃上清，加入lml 75％的乙醇洗涤RNA沉淀，4"C，75009，离一L,5min；
8、干燥RNA，用20tal DEPC水溶解RNA；
9、用紫外分光光度计测定RNA的含量，．20℃保存，准备做RT．PCR。
2蛋白浓度测定
1）蛋白标准液（用BSA配制）25mg/ml储存液，稀释为0.5mg/ml，稀释步骤：例：10μL 25mg/ml的蛋白标准液＋90μL PBS混合成2.5mg/ml蛋白标准液20μL 2.5mg/ml的蛋白标准液＋80μL PBS混合成0.5mg/ml蛋白标准液2）需设置八个标准孔以绘出标准曲线，采用BCA试剂盒测出蛋白浓度，标准孔设置及所加试剂量如下：
试剂添加量（μL）
蛋白标准液
3）配制BCA蛋白测定液，溶液A：溶液B=50：1先混合均匀，至完全互溶备用4）待测蛋白孔加：2μL蛋白液+18μL PBS，每孔的体积均为20μL
5）每孔加180μL配好的BCA蛋白测定液，使每孔总体积均为200μL；
6）室温避光放置两个小时或37℃放置30min；
7）用酶标仪测出每孔的吸光度，（570nm），测三次；
8）用excel工具根据标准孔的数据作散点图，并做出直线及公式。
以标准孔的浓度为X轴（分别为0，0.0025，0.005，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05），以所测标准孔的吸光度为Y轴，绘制线性关系图，并取相关度（R2值）最高的公式代入计算出需测的蛋白浓度，进而计算出做Western的每孔加样量=（所需上样的蛋白量）/（蛋白浓度×100）μL。
（注：文档可能无法思考全面，请浏览后下载，供参考。
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