总蛋白质提取方法
Trizol法提取细胞总蛋白
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0.3M盐酸胍95%乙醇溶液:2.866g盐酸胍,加100ml95%乙醇。
1%SDS溶液:1gSDS溶解于100ml去离子水。
5.用2ml含有0.3mol/L盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀,室温放置20min,4℃,7500rpm离心5min;重复洗涤三次;
6.无水乙醇洗涤一次沉淀,室温放置20min;
7.4℃,7500rpm,离心5min;
8.真空干燥沉淀,加入适量l%SDS,55℃振荡溶解3h;
9.不溶物再以4℃,10000rpm离心10min,取上清即为细胞总蛋白溶液,分装后于-80℃保存待用。
Trizol法提取细胞总蛋白
1.提取细胞总RNA吸去上清后,按0.3ml乙醇/1mlTrizol加入中间层和下层有机相,混匀,室温静置3min;
2.4℃,2000rpm,离心5min,取上清转移至新的EP管中(约0.8ml);
3.加ห้องสมุดไป่ตู้1.5ml异丙醇沉淀蛋白质,室温放置10min;
4.4℃,12000rpm,离心10min,弃上清;
组织总蛋白提取步骤
![组织总蛋白提取步骤](https://img.taocdn.com/s3/m/e6e328c5e43a580216fc700abb68a98270feac12.png)
组织总蛋白提取步骤
总蛋白提取是从细胞或组织中提取出的所有蛋白质的混合物。
总蛋白
的提取对于生物学研究和许多实验室技术都至关重要。
以下是一般的总蛋
白提取步骤:
1.组织的收集和处理:
a.收集需要提取总蛋白的组织样品,并尽快处理以防止蛋白质降解。
b.使用冰凉的无菌生理盐水将组织样品洗涤以去除任何外部污染物。
c.如有必要,将组织样品研磨成细小的粉末状,以提高蛋白质的释放。
2.细胞破碎和裂解:
a.使用合适的细胞破碎方法(如液氮研磨、机械破碎器或超声波处理)破碎细胞膜,释放细胞中的蛋白质。
b.加入破碎缓冲液(通常是一种含有盐和蛋白质保护剂的缓冲液),
并将样品在低温下裂解,以避免蛋白质的降解。
3.离心:
a.将处理后的样品进行高速离心,以去除细胞碎片和其他杂质。
b.将上清液(含有总蛋白)转移到干净的离心管中。
4.测定蛋白质浓度:
a. 使用适当的蛋白质浓度测定方法(如二维凝胶电泳、BCA法、Bicinchoninic Acid法)测定总蛋白的浓度。
b.根据测定的浓度进行相应的稀释或浓缩。
5.进一步处理或分析:
a.根据具体实验目的,可以进一步处理总蛋白提取物,如进行蛋白酶消化、亲和层析或其他分离纯化方法。
b. 可以使用各种蛋白质分析技术(如SDS-凝胶电泳、Western blotting、质谱等)对总蛋白进行定性和定量分析。
总蛋白的提取步骤中,诸如细胞破碎方法、破碎缓冲液的配制、离心条件和测定蛋白质浓度的方法等,都需要根据具体需求和实验目的进行优化和调整。
同时,注意使用无菌操作和低温条件,以保证蛋白质的完整性和稳定性。
提取蛋白质的方法
![提取蛋白质的方法](https://img.taocdn.com/s3/m/c35b1d2c53d380eb6294dd88d0d233d4b14e3f3e.png)
提取蛋白质的方法
提取蛋白质的方法有多种,以下是其中几种常用的方法:
1. 细胞裂解:将待提取蛋白质的细胞用物理或化学方法(如超声波、冻融、酸碱处理等)破裂,释放出细胞内的蛋白质。
2. 利用化学试剂:利用化学试剂(如高盐溶液、氯化离子、尿素等)破坏蛋白质的空间结构,使其解离出来。
3. 离心:通过不同离心速度和时间的调整,将细胞碎片、膜片、细胞器等分离,使蛋白质得以分离。
4. 电泳分离:利用电流和凝胶(如聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶板等)的特性,将蛋白质根据其电荷和大小进行分离。
5. 亲和层析:利用亲和剂(如抗体、金属离子等)与目标蛋白质的特异性结合,将其从其他蛋白质中分离出来。
6. 高效液相色谱:通过不同的色谱柱和色谱条件,根据蛋白质的大小、电荷等特性进行分离。
7. 蛋白组学方法:如蛋白质组学分析、质谱分析等高通量技术,可同时鉴定和
定量大量的蛋白质。
需要根据实际情况选择合适的方法,以提取目标蛋白质。
分离提纯蛋白质的方法
![分离提纯蛋白质的方法](https://img.taocdn.com/s3/m/d6d2a8aae109581b6bd97f19227916888486b987.png)
分离提纯蛋白质的方法
蛋白质是营养中很重要的一类物质,它们可以参与营养的过程,也可以参与多种有机反应,因此,提纯蛋白质是很有必要的。
提纯蛋白质的方法一般有硅胶沉淀法、沉淀抽提法、膜分离法等。
一、硅胶沉淀法
硅胶沉淀法是一种常用的提纯蛋白质的方法,它可以将大分子质量,体积小的分子排除在外,只提取蛋白质,这种方法的优点是操作简单,实验时间短,并且耗材成本也较低。
操作时,将样品稀释到所需的浓度,将稀释液中加入适量的硅胶,冷却混匀,经过适当的时间,硅胶就会沉淀在液体中,沉淀物吸附在硅胶上,把沉淀后的液体收集起来,经过一定的漂洗操作,就可以得到纯的蛋白质。
二、沉淀抽提法
沉淀抽提法是一种常用的提取蛋白质的方法,它可以对样品中的蛋白质进行极限沉淀,然后通过抽提的方式分离蛋白质和其他组分。
操作时,将样品加入硫酸钾溶液,然后搅拌均匀,再添加一定量的酒精,使大分子量的蛋白质极限沉淀,抽提上层液体,将抽提的液体经过一定的处理,利用蒸馏抽提的方法,就可以提取出纯净的蛋白质。
三、膜分离法
膜分离法是一种利用滤膜的选择性孔径对物质的分离。
WB实验组织总蛋白提取方法
![WB实验组织总蛋白提取方法](https://img.taocdn.com/s3/m/afa574cfcd22bcd126fff705cc17552707225ede.png)
WB实验组织总蛋白提取方法总蛋白提取是生物学实验中常用的一种方法,主要用于从细胞或组织中提取所有蛋白质。
提取总蛋白的目的是为了进一步分析蛋白质的功能和结构,例如Western blot分析等。
下面是一种常用的总蛋白提取方法。
实验材料和试剂:1.已培养的细胞或组织样品2. RIPA裂解液:含有非离子界面活性剂(Tween-20或Triton X-100)、蛋白酶抑制剂(如苯甲砜)和磷酸酯酶抑制剂(如磷酸酯酶)3.低温高速离心管4.超声波细胞破碎仪或机械研磨器5.10%SDS-凝胶电泳试剂6.蛋白加载缓冲液7.高压电泳设备实验步骤:1.将细胞样品从培养皿中用PBS缓冲液洗涤一次,用PBS轻轻冲洗组织样品。
2.吸去PBS缓冲液,加入足够的RIPA裂解液使细胞或组织完全浸没。
注意:RIPA裂解液的加入量需根据样品的大小进行调整。
3.将细胞或组织样品转移到低温高速离心管中。
4.使用超声波仪器或机械研磨器对样品进行破碎。
这一步旨在使细胞或组织的细胞膜破裂,释放出胞浆中的蛋白质。
5.离心样品以除去细胞碎片和细胞核等大颗粒。
将离心管置于低温离心机中进行离心,离心条件需根据实验需要进行调整。
6. 将上清液转移至新的离心管中,得到总蛋白提取物。
可以根据需要进行蛋白质浓度的测定,常用的方法有BCA法、Lowry法等。
7.将总蛋白提取物加入相应的蛋白加载缓冲液,并在沸水中加热变性。
8.蛋白质经过热变性后,将其进行SDS-凝胶电泳分离。
9. 将凝胶中的蛋白质转移到PVDF或NC膜上,通过Western blot分析来检测目标蛋白质。
总蛋白提取方法的关键是裂解液的配方和破碎细胞或组织的方式。
裂解液中的各种成分旨在破坏细胞膜、解离蛋白质和保护蛋白质不被降解。
破碎细胞或组织的方式可以选择超声波破碎、机械研磨或冷冻-解冻法等。
总蛋白提取方法的优化可根据实验需要进行调整。
例如,在一些情况下,可以添加磷酸酯酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或还原剂等成分来保护蛋白质的完整性。
总蛋白的提取
![总蛋白的提取](https://img.taocdn.com/s3/m/039bd9cf6f1aff00bed51e98.png)
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取:(1)倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
(2)每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞,然后弃去洗液。
重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
(3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100mM),摇匀置于冰上。
(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
)(4 )每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
(5 )裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
(整个操作尽量在冰上进行。
)(6 )于4℃下12000rpm离心5min。
(提前开离心机预冷)(7 )将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于-20℃保存。
2. 组织中总蛋白的提取:(1 )将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
(2)加400 μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中,进行匀浆。
然后置于冰上。
(3 )几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。
(4)裂解30 min后,即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,然后在4℃下12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取:由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除按(一)操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取:(1 )将培养液倒至15ml离心管中,于2500rpm离心5min。
(2 )弃上清,加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500rpm离心5min。
弃上清后用PBS重复洗涤一次。
(3)用枪洗干上清后,加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
蛋白质的十种提取方法
![蛋白质的十种提取方法](https://img.taocdn.com/s3/m/c1f9a7a8e109581b6bd97f19227916888586b950.png)
蛋白质的十种提取方法蛋白质是构成生物体重要组成部分的大分子有机化合物,对于生物研究和工业生产具有重要意义。
目前,蛋白质的提取方法多种多样,根据不同的目的和实验要求可以选择合适的提取方法。
下面将介绍蛋白质的十种常用提取方法。
1.溶液渗透法:该方法利用溶液渗透作用,通过梯度离心或薄膜渗透,将蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法适用于体积较小且溶解度高的蛋白质。
2.超声波破碎法:通过使用超声波的机械波作用,使得细胞膜破碎,释放出蛋白质。
这种方法操作简单,操作快速,适用于处理小体积的样品。
3.离心法:通过离心来分离混合物中的蛋白质。
根据蛋白质的分子量和比重差异,可以利用离心的力把蛋白质沉淀到离心管的底部。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
4.水解法:通过将蛋白质与水或酸性溶液共同处理,使蛋白质发生水解反应,从而分离出目标蛋白质。
这种方法对于含有多种蛋白质的混合物有效。
5.超滤法:利用超滤膜的渗透性,将蛋白质从混合物中分离出来。
根据蛋白质的分子量大小,可以选择合适孔径的超滤膜。
这种方法可以快速、高效地提取蛋白质。
6.毛细管电泳法:利用毛细管对溶液中的蛋白质进行分离。
该方法可以根据蛋白质的电荷、大小和形状来分离不同蛋白质。
这种方法操作简单、实验时间短。
7.离子交换法:利用离子交换树脂或离子交换膜,根据蛋白质的电荷特性来分离蛋白质。
这种方法可以选择不同类型和大小的离子交换树脂,以实现对不同蛋白质的选择性提取。
8.吸附法:通过特定配体与蛋白质之间的亲和作用,将蛋白质吸附到固相材料上,并通过洗脱来分离蛋白质。
这种方法可以用于高效地纯化蛋白质。
9.柱层析法:利用固定相和流动相之间的亲和力或互斥力分离蛋白质。
依据蛋白质的大小、形状和电荷特性,选择不同类型的柱层析材料,实现对蛋白质的选择性提取。
10.电泳方法:通过电场驱动蛋白质在凝胶中迁移,根据蛋白质的大小和电荷来分离蛋白质。
这种方法可以分离不同分子量和电荷的蛋白质,并可用于纯化和定量分析。
蛋白质提取的方法和原理
![蛋白质提取的方法和原理](https://img.taocdn.com/s3/m/4a5f3ac48662caaedd3383c4bb4cf7ec4bfeb64b.png)
蛋白质提取的方法和原理蛋白质提取是生物化学研究中一项非常重要的工作,它是通过化学或物理方法将目标蛋白质从混合物中提取出来,并获得纯度较高的蛋白样品。
蛋白质提取的方法和原理可以根据不同的需求和样本特点而有所区别,下面我将从样品处理、细胞破碎、蛋白质分离、纯化等方面详细介绍蛋白质提取的常用方法和原理。
一、样品处理样品的类型有很多,包括动物组织、细胞、血液等,每种样品的提取方法都有一定差异。
一般来说,细胞或组织样本在提取之前需要冷冻保存,并进行快速破碎以避免蛋白质降解。
对于血液样本,需要血样离心分离血浆或红细胞,再进行提取。
二、细胞破碎细胞破碎是蛋白质提取的关键步骤,目的是破坏细胞膜和细胞器,并释放蛋白质。
常见的细胞破碎方法有机械破碎、超声波破碎和化学法。
1. 机械破碎机械破碎是最常用的细胞破碎方法之一,可以通过碾磨、研磨、切割等方式破坏细胞。
例如,将样品置于液氮中冷冻后,使用研钵和研杵进行研磨,将细胞研磨成粉末状。
2. 超声波破碎超声波破碎是利用高频高能量的超声波震荡来破碎细胞,通常是在冷冻样品和显微量水中进行。
超声波的震荡可以高效破坏细胞和细胞器,并释放蛋白质。
3. 化学法化学法通常是通过加入化学试剂来破坏细胞。
例如,使用洗涤剂(如SDS、Triton X-100)可以溶解细胞膜,释放细胞内的蛋白质。
三、蛋白质分离蛋白质提取后,需要对蛋白质进行分离,去除杂质和其他成分。
1. 离心离心是最常用的蛋白质分离方法之一,通过不同速度的离心来分离蛋白质。
一般来说,较重的细胞碎片、细胞器和沉淀物会沉积在离心管的底部,而较轻的蛋白质上清液则在上方。
2. 电泳电泳是利用电场将带电蛋白质分离的技术。
常见的电泳方法有SDS-PAGE和凝胶过滤层析等。
SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小和电荷来分离,凝胶过滤层析则可以根据蛋白质的分子量和渗透性进行分离。
四、蛋白质纯化蛋白质分离后,还需要进行纯化以获得较高纯度的蛋白样品。
细胞总蛋白提取方法
![细胞总蛋白提取方法](https://img.taocdn.com/s3/m/1f776e025f0e7cd18425367e.png)
细胞总蛋白提取方法一、溶液配制1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml称取NaF 41.99mg,超纯水8ml溶解后定容至10ml。
2.100 mM PMSF3.RIPA溶液100ml成分分子量终浓度Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4)NaCl 58.44 0.87 g 150 mMEDTA 372.24 37.22 mg 1 mMNP-40 1 ml 1%SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中,待溶解后加入HCl调pH值至7.4,定容至100 ml。
※使用前加入成分储存浓度加入量终浓度PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mMNaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μlLeupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl二、方法1.细胞收取1)细胞传代至60mm培养皿中,待细胞融合约100%,收集细胞2)弃培养基,加入PBS 2ml清洗培养皿一次,弃PBS。
3)加入0.05%胰酶2ml,37℃温育1min。
4)待细胞变形后,将细胞吹下转移至一个1.5mlependorf 管中,10,000rpm×3min,4℃5)弃上清,1ml预冷的PBS清洗沉淀,10,000rpm×3min,4℃6)重复PBS清洗一次7)弃上清,-80℃冻存待裂解2.蛋白提取1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin)后冰上放置40mins10,000rpm×15min,4℃将上清转移至一个新的ependorf 管中(约250μl)三、注意事项1、低温可避免蛋白降解,所有离心管需预冷。
2、PBS要吸干,但避免细胞干掉,以免使蛋白浓度过低。
分子生物学实验中常用的蛋白质提取方法
![分子生物学实验中常用的蛋白质提取方法](https://img.taocdn.com/s3/m/80bbc54217fc700abb68a98271fe910ef12dae93.png)
分子生物学实验中常用的蛋白质提取方法蛋白质提取是分子生物学研究中的一个重要步骤,通过提取出目标蛋白质可以进行进一步的分析和研究。
在实验室中,常用的蛋白质提取方法有多种,本文将介绍几种常见且有效的蛋白质提取方法。
一、细胞裂解法细胞裂解是最基本且重要的蛋白质提取步骤,它将细胞破裂,使内部蛋白质释放到裂解液中。
细胞裂解方法有多种,如机械破碎、超声波破碎和冻融破碎等。
其中,机械破碎是最常用的方法之一,它利用高速旋转的研钵或研磨珠对样品进行机械破碎,快速破裂细胞。
二、溶液裂解法溶液裂解法是一种温和的提取方法,适用于含有脆弱或难以裂解的细胞。
该方法通过将细胞置于含有细胞膜破坏剂的缓冲溶液中,使细胞膜破裂释放蛋白质。
常用的溶液裂解剂有洗涤剂(如SDS、Triton X-100等)和脂质体(如Tween 20)等。
三、超声波法超声波法是一种物理破碎的蛋白质提取方法。
它利用高频超声波的振荡作用,产生机械特效,使细胞破裂释放蛋白质。
超声波法可以实现非接触式破碎,不会污染样品,且对细胞结构的损伤较小,适用于多种细胞类型的蛋白质提取。
四、离心法离心法是一种通过差速离心来分离细胞碎片、细胞核或其他蛋白质复合物的方法。
通过调整离心速度和时间,可以使不同大小和密度的颗粒分层沉淀,从而实现蛋白质的分离和提取。
五、柱层析法柱层析法是一种高效的蛋白质提取方法,通过将样品溶液通过填充有特定亲和剂或离子交换基质的柱子,实现目标蛋白质的选择性吸附和洗脱。
柱层析法具有选择性强、分离效果好的特点,适用于高纯度蛋白质的提取。
六、电泳法电泳法是一种通过电场作用将蛋白质分离和提取的方法。
常见的电泳法有聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、SDS-PAGE等。
通过将样品经过电泳分离,可以将目标蛋白质从其他蛋白质分子中分离出来,实现蛋白质提取的目的。
总结:以上是分子生物学实验中常用的蛋白质提取方法。
根据实验需要和样品特点的不同,选择合适的提取方法对于蛋白质研究的成功至关重要。
蛋白质提取的方法和原理
![蛋白质提取的方法和原理](https://img.taocdn.com/s3/m/adab90fd250c844769eae009581b6bd97f19bcac.png)
蛋白质提取的方法和原理
1、蛋白质提取方法
1.1 热处理法
热处理是一种简单而有效的蛋白质提取方法,通过高温高压或烧
焦来破坏细胞壁和细胞膜,并释放出蛋白质。
如热溶液法、微波法、
热压法等。
1.2 酸碱法
酸碱法是一种常用的蛋白质提取方法,通过改变蛋白质的电荷性质,使其带有正负电荷,从而在特定的pH下沉淀出来。
如硫酸钾法、
亚硫酸盐法、三氯乙酸法等。
1.3 有机溶剂法
有机溶剂法是一种常见的蛋白质提取方法,常用有机溶剂如甲醇、丙酮、氯仿等,通过溶解细胞膜并使蛋白质溶于有机溶剂中,经离心
分离得到蛋白质。
如甲醇法、氯仿法、醋酸纤维素膜法等。
1.4 冻融法
冻融法是一种新兴的蛋白质提取方法,通过冻结细胞后迅速回温,使细胞壁破裂并释放出蛋白质。
该方法不需要使用有机溶剂或酸碱处理,可避免蛋白质的降解和失活。
2、蛋白质提取的原理
蛋白质提取的原理是利用特定的化学物质或物理条件,破坏细胞
膜和细胞壁,从而释放出蛋白质。
蛋白质在细胞内可以存在于细胞膜、细胞壁、细胞质或细胞核中,提取蛋白质需要根据不同的生物学样品
及其组分情况采用不同的方法。
其中,热处理法是利用高温高压或烧焦等方式破坏细胞壁和细胞膜,从而释放出蛋白质;酸碱法是通过改变蛋白质的电荷性质,在特
定的pH值下使其沉淀出来;有机溶剂法是利用有机溶剂溶解细胞膜,
并使蛋白质溶于有机溶剂中;冻融法则是通过冻结细胞后迅速回温,
使细胞壁破裂并释放出蛋白质。
在蛋白质提取过程中,需要注意避免蛋白质的降解和失活,以及
尽量减少对蛋白质的污染。
细菌总蛋白的提取方法
![细菌总蛋白的提取方法](https://img.taocdn.com/s3/m/56cbdb77ccbff121dd3683c5.png)
细菌总蛋白和膜蛋白提取方法一、从新鲜样品中提取总蛋白(简易法)1、自配裂解液(pH ):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,% Triton X-100,调pH 值至备用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。
该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。
2、将40ml 菌液在12000g,4℃下离心15分钟收集菌体,沉淀用PBS悬浮洗涤2遍,沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。
3、超声粉碎,采用300w,10s超声/10s间隔,超声20min,反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。
4、1000g离心去掉大碎片,上清可直接变性后PAGE电泳检测,或者用1% SDS溶液透析后冻存。
缺点:Western blotting结果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。
二、从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后,加氯仿分层,2-8℃下10000g离心15min,上层水相用于RNA提取,体积约为总体积的60%。
2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。
每使用1ml Trizol加入无水乙醇混匀,室温放置3min,2-8℃不超过2000g离心5min。
3、将上清移至新的EP管中,用异丙醇沉淀蛋白质。
每使用1ml Trizol加入异丙醇,室温放置10min,2-8℃下12000g离心10min,弃上清。
4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。
每1ml Trizol加入2ml洗液,室温放置20min,2-8℃下7500g离心5min,弃上清,重复洗涤2次。
最后加入2ml无水乙醇,涡旋后室温放置20min,2-8℃下7500g离心5min,弃上清。
5、冷冻干燥5-10min,1%SDS溶液溶解,反复吹打,50℃温浴使其完全溶解,2-8℃下10000g 离心10min去除不溶物。
6、替代方案:将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中,在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次,1000g离心10min去除沉淀,上清可直接用于蛋白实验。
提取蛋白质的4种方法
![提取蛋白质的4种方法](https://img.taocdn.com/s3/m/c83abf4adcccda38376baf1ffc4ffe473368fd15.png)
提取蛋白质的4种方法
1. 离子交换:离子交换是最常用的蛋白质提取方法,它使用含有
有机硫酸盐的磷酸盐溶液来提取pH4-9之间的膜蛋白。
它使用有机硫
酸盐作为极性试剂,使蛋白质从其离子溶液中沉淀出来并固定到树脂上,从而被提取。
2. 垂直层析:垂直层析是蛋白质提取的另一种方法,它使用流动
相来垂直运动横穿膜,从而把低浓度的蛋白质从其结晶盐溶液中提取
出来。
它是一种有效的后处理方法,能有效地改善提取的蛋白质的细节、稳定性和纯度。
3. 高通量流精密:高通量流精密设备可以将流体和分散体相分离,包括沉淀物和蛋白质。
它使用高压水流将杂质和悬浮物从蛋白质溶液
中清除,然后用不同的层析方法将蛋白质从其分散体中提取出来。
4. 柱单柱层析:柱单柱层析是另一种蛋白质提取技术,它使用多
种不同的树脂来分离蛋白质从其离子溶液中。
它将溶液通过固定式柱,并使用柱中所含的不同类型的树脂来把具有不同电荷性质的蛋白质从
溶液中提取出来。
总蛋白提取方法
![总蛋白提取方法](https://img.taocdn.com/s3/m/4cb35a51f02d2af90242a8956bec0975f465a4fc.png)
总蛋白提取方法嘿,朋友们!今天咱就来聊聊总蛋白提取这个事儿。
你说这总蛋白啊,就像是一个神秘的宝藏,藏在细胞的世界里,等着我们去把它挖掘出来。
要提取总蛋白,就好像是一场和细胞的“战斗”。
首先呢,得准备好各种“武器”,也就是实验器材和试剂啦。
就像战士上战场得有趁手的家伙事儿一样。
然后呢,就是要选择合适的样本。
这可不能马虎,就好比你要去钓鱼,总得选个有鱼的地方吧。
不同的样本,提取的难度和效果可都不一样哦。
接下来,就是关键步骤啦!就像解开一个复杂的谜题。
你得小心翼翼地操作,不能有一点马虎。
比如要掌握好各种试剂的用量和比例,这就好比做饭时放盐放调料,多了少了味道可就不对啦。
有时候我就在想啊,这提取总蛋白不就跟我们找东西一样嘛。
在一堆乱七八糟的东西里面,要精准地找到我们想要的那个。
而且还得保证它的完整性和活性,不能给弄坏了呀。
提取的过程中还得注意各种条件,温度啦、时间啦,都得拿捏得死死的。
这就像烤蛋糕,温度高了低了,时间长了短了,蛋糕可就不完美啦。
你说要是一个不小心,操作失误了,那不就前功尽弃啦?那得多郁闷啊!所以啊,每一步都得谨慎再谨慎。
还有啊,不同的提取方法也各有特点呢。
就像不同的武功秘籍,各有各的厉害之处。
有的方法简单快捷,但是可能纯度不那么高;有的方法复杂一些,但是能得到更纯的蛋白。
这可就得根据我们的需求来选择啦。
哎呀,说了这么多,其实提取总蛋白真的不简单啊!但这也是科学的魅力所在嘛。
我们就是要不断地探索,不断地尝试,才能找到最好的方法。
总之呢,提取总蛋白是一项既有趣又有挑战的工作。
它需要我们有耐心,有细心,还要有扎实的专业知识。
朋友们,加油吧,让我们在总蛋白的提取之路上不断前进,挖掘出更多的宝藏!。
细胞总蛋白提取方法
![细胞总蛋白提取方法](https://img.taocdn.com/s3/m/2afcc5100029bd64783e2ce5.png)
细胞总蛋白提取方法、溶液配制1. 100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml称取NaF 41.99mg,超纯水8ml 溶解后定容至10ml 。
2. 100 mM PMSF3. RIPA 溶液 100ml成分分子量终浓度Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4)NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA372.2437.22 mg 1 mM NP-401 ml1% SDS0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g0.5%溶解于80 ml 超纯水中, ※使用前加入待溶解后加入 HCl 调pH 值至7.4, 定容至100 ml o成分储存浓度加入量 终浓度PMSF 100 mM 10 ^/11ml 1 mM NaF 100 mM 10 ^/11ml 1 mM Aproti nin 10(_g/ 卩1 0.2(i/11ml 2用/卩1 Leupeti n10(_g/ 卩10.2(i/11ml2创卩1、方法1. 细胞收取1)细胞传代至60mm 培养皿中,待细胞融合约100%,收集细胞 弃培 养基, 加入PBS 2ml 清洗培养皿一次,弃 PBS 。
加入0.05%胰酶2ml ,37 C 温育1min 。
待细胞变形后,将细胞吹下转移至一个 1.5mlependof 管中,10,000rpm x 3min ,4C-弃上清,1ml 预冷的PBS 清洗沉淀,10,000rpm 3min , 4°C2) 3) 4) 胞收至分两次将细6)重复PBS清洗一次2. 蛋白提取1mM NaF 、2 ⑥/ml Aproti nin 、2 pg/ml Leupet in),混匀加入缓冲液前先将将上清转移至一个新的ependof 管中(约250^)11) 向细胞沉淀中加入200卩R IPA 缓冲液(含1mM PMS 、2) 后冰上放置40mins10,000rpm 15min ,4 °C 细胞沉淀敲散,加。
Trizol法提取细胞总蛋白
![Trizol法提取细胞总蛋白](https://img.taocdn.com/s3/m/c68ca3be69dc5022aaea0081.png)
Trizol法提取细胞总蛋白
1.提取细胞总RNA吸去上清后,按0.3ml乙醇/1ml Trizol加入中间层和下层有机
相,混匀,室温静置3 min;
2.4℃,2000 rpm,离心5 min,取上清转移至新的EP管中(约0.8 ml);
3.加入1.5 ml异丙醇沉淀蛋白质,室温放置10 min;
4.4℃,12000 rpm,离心10 min,弃上清;
5.用2 ml含有0.3 mol/L盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀,室温放置20 min,
4℃,7500 rpm离心5 min;重复洗涤三次;
6.无水乙醇洗涤一次沉淀,室温放置20 min;
7.4℃,7500 rpm,离心5 min;
8.真空干燥沉淀,加入适量l%SDS,55℃振荡溶解3 h;
9.不溶物再以4℃,10000 rpm离心10 min,取上清即为细胞总蛋白溶液,分装
后于-80℃保存待用。
全程大约需配制试剂
0.3M盐酸胍95%乙醇溶液:2.866 g盐酸胍,加100 ml 95%乙醇。
1%SDS溶液:1g SDS 溶解于100 ml去离子水。
提取蛋白质的4种方法
![提取蛋白质的4种方法](https://img.taocdn.com/s3/m/7770ae2c59fafab069dc5022aaea998fcc2240e1.png)
提取蛋白质的4种方法1.离心法:离心法是一种基于蛋白质的大小和密度差异进行分离的方法。
它是最基本的蛋白质提取方法之一、在这个步骤中,样品通过离心机进行离心,这样会使蛋白质在管底或管顶形成一个沉淀或浮游。
通过离心,可以将细胞碎片、核酸和细胞器分离出来。
2.电泳法:电泳法是一种基于蛋白质的电荷和大小差异进行分离的方法。
电泳法可分为两种类型:SDS-和等电聚焦。
在SDS-中,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳进行分离,根据蛋白质的大小产生不同的迁移速度。
而等电聚焦则是根据蛋白质的等电点(pI)进行分离。
3.柱层析法:柱层析法是一种基于蛋白质的亲和性、大小、电荷或亲水性进行分离的方法。
这种方法通过将样品与一个固相材料(如凝胶或颗粒)进行结合,然后通过流动相沿柱上运动,以分离和纯化蛋白质。
常用的柱层析方法包括气相色谱法、蛋白A/G层析法和亲和层析法。
4.免疫沉淀法:免疫沉淀法是一种利用抗体与蛋白质的特异性结合进行分离和纯化的方法。
在这个步骤中,抗体与特定的目标蛋白质结合,然后使用磁珠或琼脂糖等材料结合抗体,使其沉淀在底部。
通过将样品离心,可以将蛋白质与抗体沉淀分离。
总结蛋白质的提取方法有许多种,每一种都有其优势和适用范围。
离心法可以通过离心把蛋白质从其他细胞碎片和核酸中分离出来。
电泳法可以根据蛋白质的大小和电荷差异进行分离。
柱层析法可以根据蛋白质的亲和性和大小进行分离和纯化。
而免疫沉淀法则依赖于抗体与特定蛋白质的结合能力进行分离。
根据需要和实验室资源的可用性,选择适合的蛋白质提取方法可以确保蛋白质的高质量提取和纯化。
细胞总蛋白的提取及裂解液
![细胞总蛋白的提取及裂解液](https://img.taocdn.com/s3/m/8bcdeccb80eb6294dd886cfd.png)
细胞总蛋白的提取及裂解液一.悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中,加入饱和浓度一抗(1/10)或(10ug/ml)4℃15-30min后,短暂离心4000 转×3分,用PBS 0.4-0.5ml重悬(室温),加入饱和浓度二抗(1/100)或(20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后(迅速加入终止液0.5ml(冷pbs中含有400uM Na3VO4,5mM EDTA,10mM NaF)),离心4000 转×3分,弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度108/ml?)吸管轻轻混匀,冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml 的PMSF储存液,冰点孵育30分钟。
4度离心15000g 20min。
上清液即为全部细胞溶解成分。
二.裂解缓冲液:50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4150-300mM NaCl1%(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100)5mM EDTA(现加1ml加10ul)临用前加入蛋白酶抑制剂:Na3VO4钒酸钠1mM (75mM—13.3ul/ml)(用0.2mol/L储存液配制)PMSF苯甲酰氟1mM (10mg/ml PMSF 用量:10ul/ml)或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor (加10-20ul)Aprotinin 抑肽酶10ug/ml(10ul/ml)(Leupeptin 亮肽素10ug/ml 未加) Western blotting三.给你介绍一个裂解液:50mM Tris-HCl (PH8.0)缓冲液,含:NaCl 150mM叠氮钠0.02%SDS 0.1%NP-40 1%PMSF 100ug/ml(使用前临时加入)(10mg/ml PMSF 用量:10ul/ml)尽量用少的裂解液裂解细胞,取上清电泳,最好用6xSDS 上样buffer。
细胞总蛋白的提取及裂解液
![细胞总蛋白的提取及裂解液](https://img.taocdn.com/s3/m/5e7a68df910ef12d2bf9e71f.png)
细胞总蛋白的提取及裂解液一.悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中,加入饱和浓度一抗(1/10)或(10ug/ml)4℃15-30min后,短暂离心4000 转×3分,用PBS 0.4-0.5ml重悬(室温),加入饱和浓度二抗(1/100)或(20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后(迅速加入终止液0.5ml(冷pbs中含有400uM Na3VO4,5mM EDTA,10mM NaF)),离心4000 转×3分,弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度108/ml?)吸管轻轻混匀,冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml 的PMSF储存液,冰点孵育30分钟。
4度离心15000g 20min。
上清液即为全部细胞溶解成分。
二.裂解缓冲液:50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4150-300mM NaCl1%(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100)5mM EDTA(现加1ml加10ul)临用前加入蛋白酶抑制剂:Na3VO4钒酸钠1mM (75mM—13.3ul/ml)(用0.2mol/L储存液配制)PMSF苯甲酰氟1mM (10mg/ml PMSF 用量:10ul/ml)或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor (加10-20ul)Aprotinin 抑肽酶10ug/ml(10ul/ml)(Leupeptin 亮肽素10ug/ml 未加) Western blotting三.给你介绍一个裂解液:50mM Tris-HCl (PH8.0)缓冲液,含:NaCl 150mM叠氮钠0.02%SDS 0.1%NP-40 1%PMSF 100ug/ml(使用前临时加入)(10mg/ml PMSF 用量:10ul/ml)尽量用少的裂解液裂解细胞,取上清电泳,最好用6xSDS 上样buffer。
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总蛋白质提取方法
(1)在研钵中预先加入0.25 g PVPP交联聚维酮和少量石英砂,在电子天平上调零后称取5g 黄皮层组织样品,用液氮研磨至细粉末状,全部转移至50 mL压口离心管中;
(2)依次加入30 mL 12.5% TCA/丙酮、2 mL 1 M DTT和1 mL 100 mM PMSF 苯甲基磺酰氟化物,充分振荡混匀后冰浴振荡提取15 min,然后4℃条件下13,000×g离心15 min(重复2~3次至沉淀基本变成白色);
(3)弃上清,轻轻磕散沉淀,加入30 mL 经-20℃预冷的0.1 M乙酸铵/甲醇溶液,充分振荡混匀后冰浴低速振荡提取15min,然后4℃条件下13,000×g离心15min;
(4)弃上清,轻轻磕散沉淀,加入30 mL经-20℃预冷的丙酮,充分振荡混匀后冰浴低速振荡提取15 min,然后4℃条件下13,000×g离心15 min;
(5)弃上清,-20℃条件下在吸水纸上倒置30 min除去残留丙酮;
(6)轻轻磕散沉淀,依次加入15 mL 提取Buffer(700 mM蔗糖+ 500 mM Tris-base + 100 mM KCl)、15 mL Tris-饱和酚(pH 7.5)、2 mL 1 M DTT和1 mL 100 mM PMSF,充分振荡混匀后冰浴低速振荡提取30 min,然后4℃条件下5,000×g 离心30 min;
(7)小心吸取上层深色酚相提取液转移至新的50 mL压口离心管中,加入20 mL 0.1 M 乙酸铵/甲醇溶液,轻轻颠倒混匀后-20℃静置3~6 h沉淀蛋白,然后4℃条件下13,000×g离心30 min;
(8)弃上清,加入30 mL预冷甲醇,冰浴中轻摇5 min充分洗涤管壁及沉淀,然后4℃条件下13,000×g离心15 min;
(9)弃上清,加入15 mL预冷丙酮,冰浴中轻摇5 min充分洗涤管壁及沉淀,然后4℃条件下13,000×g离心15 min;
(10)弃上清,用预冷小药勺将所有沉淀轻轻刮下并小心转移至2 mL灭菌离心管中(冰浴),原管用2 mL预冷丙酮快速洗涤后一并转移至2 mL灭菌离心管中,然后4℃条件下13,000×g离心15 min;
(11)弃上清,-20℃条件下在吸水纸上倒置30 min除去残留丙酮;
(12)所得蛋白质干粉可密封后置-70℃保存备用,或加入270 μL样品溶解Buffer (8 M尿素+ 4% CHAPS + 40 mM Tris-Base)、20 μL 1 M DTT和10 μL 100 mM PMSF,室温间隔涡旋溶解30 min,然后15℃条件下13,000×g离心15 min,将上清液转移至1.5 mL灭菌离心管即可;用Bradford法定量后可按每管20 μL分装至灭菌PCR管中,置-70℃保存备用。
提取的总蛋白质样品先用SDS-PAGE初步检测:各取20 μL与等体积SDS-PAGE凝胶上样缓冲液(TIANGEN, Beijing, China)混匀后煮沸5 min,稍离心后取上清液上样,上样量均为20 μL。
所用仪器为六一DYCZ-24EN型垂直板电泳仪(Beijing, China),所用蛋白质标准品为ProteinRule rⅡ(Transgen, Beijing, China)。