水泡性口炎病毒与Monocyte及MoDC的互作研究

水泡性口炎病毒与Monocyte及MoDC的互作研究

邹胜利;聂作明;吴祥甫;方心葵;孙涛

【摘要】为了探究水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)与天然宿主免疫细胞的互作关系,实验用M蛋白第51位甲硫氨酸残基缺失后的重组病毒(VSV△ M51-GFP)和第51位甲硫氨酸敲除、第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸、第226位丝基酸突变为精氨酸的重组病毒(VSV-MT-GFP)以及野生型重组病毒(VSV-GFP)感染猪单核细胞(Monocyte)和单核细胞诱导的树突状细胞(Monocyte-derived dendritic cell,MoDC),通过空斑实验制作病毒生长曲线,用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞的感染状况,ELISA检测细胞培养上清中的细胞因子表达变化.结果表明,VSV、VSV△ M51、VSV-MT均可感染Monocyte和MoDC,且Monocyte的感染率仅为8.38％.3种病毒在MoDC中可以大量复制,但无法在Monocyte中扩增.且与野生型VSV相比,VSV△M51、VSV-MT细胞致病性依次减弱.VSV能有效激活TNF-α、IL-8、IFN-α相关免疫细胞因子在MoDC中的表达,且M蛋白突变程度越大,病毒激活能力越强.

【期刊名称】《浙江理工大学学报》

【年(卷),期】2016(035)005

【总页数】5页(P749-753)

【关键词】水泡性口炎病毒;单核细胞;MoDC;互作;基质蛋白M

【作者】邹胜利;聂作明;吴祥甫;方心葵;孙涛

【作者单位】浙江理工大学生物化学研究所,杭州310018;浙江理工大学生物化学研究所,杭州310018;浙江理工大学生物化学研究所,杭州310018;上海交通大学上

海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;上海交通大学上海市兽医生物技术重

点实验室,上海200240

【正文语种】中文

【中图分类】Q255

水泡性口炎(vesicular stomatitis，VS)是由水泡型口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)引起的一种人畜共患急性传染病，可通过多种媒介广泛传播。VSV属于弹状病毒科水泡病毒属成员，按其血清型可分为新泽西型和印第安纳型[1]，基

因组为一条单链RNA分子，分别编码N、NS、M、G、L 5种主要结构蛋白，其

中M和G蛋白定位于病毒粒子包膜蛋白。M蛋白由229个氨基酸组成，能使核

衣壳同含有G蛋白的包膜或细胞膜发生相互联系，故M蛋白被认为是一种桥连分子和重要的致病因子[2]。树突状细胞[3](Dendritic Cell)是目前已知功能最强大的抗原递呈细胞，作为机体适应性T细胞免疫应答的始动者，DC细胞能够显著刺激初始T细胞的增殖。病毒感染DC后，能够不同程度引起MHC II、TNF-α、IL-12、和CD80/86等细胞因子及表面蛋白的变化。病毒感染致使细胞因子分泌的改变可以反映出细胞免疫的倾向性。IFN-α的分泌可以促进动物体内未成熟DC的成熟[4]，TNF-α的分泌可诱导DC主要组织相容性复合物的表达，可以提高DC细胞

的抗原递呈能力。IL-8是一种强有力的细胞趋化因子和活化因子，是激活中性粒

细胞的吞噬功能和溶酶体活性，此外对T淋巴细胞也有一定的趋化作用[5]。

近年来，VSV相继被人们应用于HIV、乳腺癌[6]等疾病的疫苗研究[7]。2014年，起源于非洲的埃博拉病毒引起全球恐慌，近日，加拿大公共卫生署的科研人员成功研发出基于口炎病毒载体的VSV-EBOV埃博拉疫苗[8]，已投入临床实验，并表现出强大的临床效果。

而此前对VSV与M蛋白的研究数据主要来源于小鼠，在BALB/c小鼠实验中已经

证明基质蛋白M与细胞感染有关，但其在天然宿主致病机制中的作用并不清楚。与小鼠相比，VSV在天然宿主中与免疫细胞的互作模型回归本体动物，使研究结果更具有参考意义。观察DC感染病毒后的功能和表型变化，可帮助人们探究VSV传播机制，通过比较M蛋白突变后病毒的致病性和免疫原性变化，也可为VSV病毒弱化和载体疫苗提供参考。

1.1 材料与试剂

1.1.1 病毒株与细胞

表达绿色荧光蛋白的野生型重组VSV(VSV-GFP)、M蛋白第51位甲硫氨酸缺失的重组病毒VSVΔM51-GFP、以及在VSVΔM51-GFP基础上将第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸、第226位丝基酸突变为精氨酸的重组病毒(VSV-MT-GFP)、猪肾细胞系(IBRS2)和非洲绿猴肾细胞(VERO)、Monocyte及MoDC均由上海交通大学兽医生物技术重点实验室分离制备和诱导。采血用猪为上海交通大学实验动物中心的中型西双版纳猪。

1.1.2 主要试剂及仪器

细胞培养用RPMI-1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清以及MHC II、CD80荧光抗体购自赛默飞。低吸附24孔细胞培养板购自美国康宁公司，细胞磁珠分选设备及CD14抗体购自德国Miltenyi公司，流式细胞仪分别用到BD公司FACSCalibur和Beckman Coulter公司的CytoFLEX型号，激光共聚焦显微镜为德国徕卡TCS SP5 II型号，TNF-α、IL-8、IFN-α检测试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。其他常用试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 猪Monocyte及MoDC的分离及诱导

从猪心脏静脉丛取血120 mL，加适量1 %肝素抗凝，缓慢移入装有17 mL淋巴细胞分离液的50 mL离心管中，2000 r/min离心20 min，使离心机自然减速。

将上层与中层之间的乳白色单个核细胞层用吸管吸出，加入红细胞裂解液裂解5 min后再加DPBS缓冲液2000 r/min离心5 min，进行细胞计数后按照每107个细胞加入10 μL CD14磁珠抗体，室温孵育10 min，加DPBS缓冲液离心后加入3 mL的无血清RPMI-1640培养基过柱，将磁性分选柱从磁场中移走，用含10% FBS得到Monocyte细胞。将得到的Monocyte细胞计数，用RPMI-1640培养基调整细胞密度至2×106/mL，加入猪IL-4和GM-CFS，使二者工作浓度为10 ng/mL，将细胞移至表面低吸附24孔细胞培养板，诱导5 d。

1.2.2 MoDC的鉴定

把经过诱导培养的MoDC细胞从低吸附24孔板中轻轻吹打洗出，用DPBS洗1遍，用MHC II及CD80荧光抗体避光染色20 min，1000 r/min离心2 min，加入500 μL DPBS重悬，上流式细胞仪检测MHC II和CD80含量。

1.2.3 病毒在IBRS2、Monocyte及MoDC细胞的多步生长曲线

按MOI(multiplicity of infection)=1，用VSV-GFP、VSVΔM51-GFP和VSV-MT-GFP分别感染IBRS2、Monocyte及MoDC细胞，孵育1 h后，用DPBS洗3遍，在接种病毒后的2、8、12、24、48 h收集细胞上清，并依次按1∶103；1∶104；1∶105；1∶106；1∶107；1∶108稀释后，感染12孔细胞培养板中的VERO细胞，37℃孵育1h后用PBS洗涤，按1∶1加入含有10% FBS的DMEM 培养基和1 %低熔点琼脂糖凝胶，等凝胶冷却凝固后，放置在5 %的二氧化碳培养箱中培养16～24 h，待空斑形成后用微波炉加热，弃去培养基和琼脂糖凝胶，加入1 %的结晶紫染色液染色2 min后洗去染色液，晾干后选取合适的孔对空斑进行计数，根据病毒稀释倍数计算病毒滴度，制作病毒多步生长曲线。

1.2.4 Monocyte和MoDC细胞病毒感染检测

分别按MOI=1将3种病毒接种MoDC细胞，按MOI=1和MOI=10接种Monocyte细胞。病毒孵育1 h后，用DPBS洗3遍，培养12 h。用流式细胞仪