特殊药物的生物等效性评价

特殊药物的生物等效性评价
杨劲张玉琥
1、引言
为指导药品研发，世界多国医药监管当局均制定了相应的指导原则，这些指导原则是对药品研发过程中共性问题的解答。

生物利用度和生物等效性指导原则是这些原则中的重要一类，是评价制剂是否具有可替换性的重要评价准则。

按照优选顺序，FDA将评价指标按如下分类[1]：
①药代动力学终点指标Pharmacokinetic endpoint
②药效动力学终点指标Pharmacodynamic endpoint
③临床终点指标Clinical endpoint
④体外终点指标In vitro endpoint
其中，药代动力学终点指标最为常用，目前通用的评价方法是置信区间法，当主要药代动力学参数对数转换后几何均值比的90%置信区间（90%CI）在80-125%内时，受试制剂吸收的速度和程度与参比制剂相当，视为生物等效。

药代动力学参数采用非房室矩方法计算。

单剂量给药时，这些评价参数一般包括AUC0-τ、AUC(0-∞)、C max、T max，可以额外报告终端消除速率常数λz和t1/2；在稳态下测定常释制剂生物等效性的试验中，这些参数包括AUC(0-τ)、C max,ss和T max,ss[2]。

但是，上述指导原则并不能适用于所有药物，例如前药、内源性药物、高变异药物、窄治疗窗药物等。

这些特殊药物的生物等效性评价，在检测对象、试验设计（包括剂量选择）、试验控制、评价指标等的选择上，各自存在特殊性，各国监管当局已在研究和审评实践后形成了相应的指导原则，而且有些还处在不断更新完善之中。

本文对当前的进展详述如下：
2、特殊药物的生物等效性研究
2.1 药物代谢物具有生物活性
原则上，评价生物等效性应该基于母体化合物的测得浓度，因为相对代谢物的C max而言，母体化合物的C max对检测剂型间吸收速率的差异通常更敏感[2,3]。

但是，当药物的代谢物具有生物活性时，以下情况代谢物的药代动力学参数也需要监测[3]：
1)母体药物在生物基质中的浓度过低，无法被准确测定时，例如前体药物的吸收。

此种情形下，生物等效性的评估以代谢物的浓度数据为依据，即受试药物和参比药物的代谢物的AUC0-τ、C max几何均数比的90%CI应在80-125%内。

这可能是用代谢物的浓度数据来确定生物等效性的唯一一种情况。

如坎地沙坦酯片[4,5]、阿司匹林、吗替麦考酚酯的生物等效性研究。

2)药物的活性代谢物经由胃壁代谢或者其他体循环前代谢所形成，对药物的临床安全性和有效性有显著影响时。

如维拉帕米、地氯雷他定、洛沙坦[6]等。

此时建议同时测定母体和代谢物的浓度。

与前体药物不同，此种情况下，代谢物的浓度数据仅作为参考，生物等效性的评估依据依然为母体药物的浓度数据，并计算置信区间。

2.2 内源性药物
内源性药物（如氨基酸、蛋白、脂类、激素等）的生物等效性评价需要注意的问题较多，某些问题仍存在争议并亟待解决。

2.2.1 基线校正
对于内源性药物，由于体内存在一个基底值，进行生物等效性时，应首先进行基线校正，以纠正本底水平引起的偏差。

具体的校正方法，视药物不同而不同。

给药后，如果药物的浓度水平远远高于基底值，可以不需要基线校正，但这种情况比较少。

一般的校正方法为，在给药前测定该物质的初始浓度，在给药后再测定该物质的浓度，计算两者之差，即为药物产生的净浓度。

以校正后的药代动力学参数为基础，计算两种制剂的几
何均值比，并计算90%置信区间。

初始浓度通常取给药前空白样品浓度。

如左甲状腺素钠[7]，以给药后的实测浓度值减去给药前0h、0.25h、0.5h的药物浓度均值作为真实值。

具有昼夜节律特点的内源性药物，如激素类药物，可以采用点对点的校正。

即在与给药后相同的采血时间点上，对服药前药物的基线水平予以测定，以给药前后相应时间点的浓度差作为药物产生的净浓度。

以上两种浓度校正容易出现的问题是过度校正，即出现负值。

出现负值的原因有两个[8]：①基线变化本身较大；②外源性类似物的给药可能会影响内源性物质的产生水平，导致服药后基线降低。

欧盟生物等效性指导原则[9]指出，基线校正还可以用每一个给药后的AUC分别减去与之对应的基础水平的AUC，采用基线校正的AUC进行生物利用度计算，可以减少因血药浓度的基线过度校正产生负值所带来的较大误差。

如药物辅酶Q10软胶囊的人体药代动力学及相对生物利用度研究[10]，该文献同时采用了血药浓度基线校正和AUC基线校正的方法来评价辅酶Q10软胶囊的相对生物利用度。

在进行生物等效性评价前，应事先规定基线校正的方法。

对于缺乏文献报道参考的，建议预试验时至少采用两种校正方法，根据试验结果进行讨论，并从中优选[8]。

目前已逐渐认识到基线校正的局限性，可采用的方法是在统计模型中，将相关的基线协变量纳入模型，提供能够比较的生物利用度的精确估计。

虽然它目前不是一个标准的方法，验证也还需要证明，但已经引起广泛关注[8]。

2.2.2 给药方案
设计特殊药物的生物等效性试验时，剂量以及给药次数应该结合药物的本底水平、检测能力、变异水平等，综合考虑。

以耐受性良好为前提，可以多剂量给药或单次给药超过临床治疗剂量[9]。

单次给药剂量超过临床用量的，以左甲状腺素钠为例，左甲状腺素钠是一种内源性物质，其本底水平高，而且低剂量给药时，变异比高剂量给药时要大，FDA指导原则[11]指出
单剂量的生物等效性评价时，为避免本底干扰以及高变异，给药剂量应为600μg（用法用量）。

2.2.3 饮食和环境条件的标准化
饮食和环境条件的标准化在生物等效性评价中是常规方法。

对于内源性物质的生物等效性判断来说，试验过程中受试者的饮食摄入、身体损耗的变化以及内环境的稳定更为重要[8]。

为了最大程度的减少非药源性物质对测定的影响，应统一并标准化饮食，包括饮食量和饮食时间的统一，如辅酶Q10[12]。

氯化钾缓释胶囊的生物等效性研究是环境条件标准化原则的典型范例[13]。

每个试验周期包括饮食平衡期（4天）、基线期（2天）以及给药期（2天），整个试验的关键环节是受试者给予标准化饮食，其中钾含量、钠含量、热量以及饮水量均控制并可知，除此之外，应保证受试者处在气候可控的环境中，尽量保证处在室内，并限制活动，避免过多出汗导致的钾流失；给药后，受试者应保持直立体位至少3小时。

另一个例子是叶酸的生物等效性研究。

叶酸的血药浓度水平也受饮食的影响。

由于食物中广泛含有叶酸，必须尽量标准化叶酸的摄入。

另外，由于个体差异，每个人体内叶酸含量不尽相等。

在叶酸的生物利用度研究过程中，不仅要检测体内叶酸的本底浓度，还需要采取叶酸预饱和的方法，预先给予每个受试者3~7天叶酸(5mg/天，饱和剂量)，以便每个受试者体内的本底相近。

文献数据表明，预饱和给药后停药2天，叶酸在体内即可迅速清除至本底。

2.2.4 消除或抑制内源性物质的分泌
消除或者抑制内源性物质的分泌，是评价其生物等效性最直接的方法，这种方法可以直接降低基线水平对外源性药物的影响。

例如重组人生长激素制剂的生物等效性研究[14]中，皮下注射药物前2h开始持续输入生长抑素，以抑制内源性激素的分泌，输液速率为120μg h-1，并持续到给药后24h。

通过抑制人体生长激素的分泌，可以使结果更真实地反映试验药物的药动学特征。

总之，由于受体内转运、反馈和体外影响因素较多，内源性药物的血药浓度变化比较复杂，其生物等效性的研究一直是国内外关注的热点。

2.3 局部作用药物
局部作用药物，与通过全身血液循环起效的药物（图1）不同，未经血液循环，即可在作用部位起效，如皮肤外用药，对于此类药物，血药浓度不一定能反映药效活性，见图2。

而且，如果药物同时存在全身吸收，进入血液循环的比例增加，可能意味着作用于起效部位的药物会减少，药效降低。

图1、Systemic acting drugs
图2、Locally acting GI drugs
对于许多这类药物，FDA建议采用临床疗效终点（Clinical endpoint）作为终点指标进行等效性评价[15]。

1)阿卡波糖生物等效性试验
阿卡波糖是一种治疗糖尿病的α-糖苷酶抑制剂，其作用靶点在胃肠道，血药浓度与其临床疗效无直接关系。

类似药物还有伏格列波糖、米格列醇等。

基于阿卡波糖特殊的作用机制，FDA在阿卡波糖生物等效性评价的指导草案[16]中，推荐以药效动力学指标进行生物等效性研究。

由于阿卡波糖是降血糖药物，所以可以采用血清血糖的变化作为效应指标。

效应指标及获取方法如下：
A.给药之前，应测定给予75g蔗糖后的血糖基线值：禁食一夜后，受试者服用蔗糖水（75g 蔗糖溶于150ml水中），采血点为服糖水后的0-4h。

第二天，阿卡波糖与75g蔗糖同服，采血点与前一天相同。

B.给予阿卡波糖后血糖的最大降幅可能出现在1h内，因此此时间段内应密集采血。

C.阿卡波糖生物等效性的评价应基于与基线相比血糖的降低值。

主要有两个指标：
①ΔC SG,max，血清葡萄糖浓度降低幅度的最大值( Maximum reduction in Serum Glucose concentration)
②AUEC(0-4h)，血清葡萄糖浓度减少量经时曲线下4小时内的面积，
AUEC(0-4h)=ΔAUC SG,(0-4h)=AUC SG,(0-4h)（服阿卡波糖前只服蔗糖水的）-AUC SG,(0-4h)（蔗糖/阿卡波糖同服的）。

等效性标准为：受试制剂和参比制剂ΔC SG,max和AUEC(0-4h)均值比的90%置信区间应落在生物等效性的80%-125%内。

同时，FDA认为检测血液中阿卡波糖的药物浓度没有必要。

FDA指南中推荐的试验设计方案为随机、平衡的双交叉设计，清洗期为一周。

在正式试验
前必须进行预试验，预试验的目的有两个：一个是由低到高探索正式试验中阿卡波糖的剂量，另一个是确定正式试验中能获得足够功效的受试者例数。

正式试验的剂量应该是与血糖本底水平相比，能产生降血糖药效的最低剂量，这个剂量应该避开阿卡波糖量效曲线的坪剂量，初始剂量应为制剂的最小规格，如果无效，剂量递增。

本文作者主持的阿卡波糖的生物等效性试验[17]，按照FDA指导原则进行设计，探索了剂量50mg和100mg，并选择了100mg 剂量作为正式试验剂量。

该剂量下，与只服蔗糖比较，阿卡波糖可以明显降低血糖浓度。

正式试验中受试者例数为40名。

统计结果表明，FDA推荐的两个参数中，ΔC SG,max是一个可以采用的评价指标。

另外一个参数AUEC(0-4h)由于血糖调节机制的存在，导致大约30%左右的受试者出现负值，不能作为阿卡波糖生物等效性评价的指标，作者探索了新的生物等效性评价指标，以血糖的坪浓度和波动水平作为联合指标进行了生物等效性评价，效果良好。

其中波动水平不能采用相对的波动度
DF=(C max-C min)/C55
而应该采用fAUC（degree of fluctuation of serum based on AUC）作为基于血糖AUC的血糖波动度，该参数计算公式及示意图如下：
f AUC=AUC(C≥C55)+AUC(C≤C55)
该试验中还探讨了其他表示波动度的参数，效果和fAUC类似，和坪浓度一起能有效反映阿卡波糖的临床效应，成功地用于阿卡波糖生物等效性评价。

2)硫糖铝生物等效性研究
除了阿卡波糖，抗溃疡药物硫糖铝也是一个在胃肠道作用的典型例子。

硫糖铝是蔗糖硫酸酯的碱性铝盐，与损伤的粘膜接触后，分解成硫酸化蔗糖和氢氧化铝，并与胃粘膜的粘蛋白结合，形成保护膜覆盖于溃疡面起屏障作用，可保护胃粘膜免受胃酸和胆汁的伤害，也直接与胃蛋白酶结合，发生沉淀而抑制其分泌蛋白的活性，阻止对胃粘膜的进一步损伤。

1998年，美国药品评价研究中心（CDER）通过了Ratiopharm公司硫糖铝片的仿制药申请[18,19]。

该公司除了辅助以Carafate Tablet为参比制剂下，硫糖铝片的体外崩解数据外，通过8周
的在十二指肠溃疡患者中进行的临床试验，确定了受试制剂与参比制剂的疗效等效，从而确定了制剂的生物等效性。

3)皮质类固醇激素类皮肤外用药
皮质类固醇激素类皮肤外用药也是通过临床终点（Clinical endpoint）来进行生物等效性评
价的。

此类药物通过渗透，顺序性地作用于皮肤角质层、表皮层和真皮层中的一层或几层起效，不须经过全身吸收就可以到达作用部位。

对于皮质类固醇激素药物，FDA指导原则（1995）提出利用体内药效法即以药效动力学终点（Pharmacodynamic endpoint）来研究其生物等
效性[20]。

局部皮肤外用药，属于局部作用药物中的一种，整体药物暴露水平并不能真正反映药物的疗效。

药物只有在皮肤局部达到一定的浓度并维持一定的时间才能发挥理想的药理活性。

皮肤局部药物浓度的测定方面，目前有不少新技术和新方法在积极探索和应用之中[21]，如体外
扩散法(In vitro diffusion)、皮肤贴片法、微透析技术、近红外光谱技术等。

临床试验是在其他体外、体内等方法都没有充分证据效力时的最后选择。

4)喷鼻剂
喷鼻剂分为溶液喷鼻剂和混悬喷鼻剂两类，对于前者，生物等效性用体外测试来确定，而对
于混悬喷鼻剂，除了体外测试外，还要求药品的有效性和全身吸收等同。

5)口腔吸入剂
口腔吸入剂分为气雾吸入剂和干粉吸入剂，其生物等效性的基本原则和喷鼻剂是一样的，不同的是，两种吸入剂均需通过一系列体外和体内的测试结果来证明生物等效性。

目前FDA 正在进行这些方法的探索和研究。

2.4 以效应指标（Pharmacodynamic endpoint）为等效性评价指标的药物
除了局部起效的药物可以采用效应指标作为生物等效性评价的依据外，还有一些全身起效的药物也可以采用，例如硫酸软骨素和干扰素IFN-α-con-1。

2.4.1 硫酸软骨素生物等效性试验
硫酸软骨素片是一种治疗关节炎（OA）的药物，硫酸软骨素制剂吸收后，存在多个代谢物，但是并没有证据表明这些成分的血药浓度与临床疗效有关，因此，评价硫酸软骨素片生物等效性最直接的方法就是通过比较硫酸软骨素制剂的临床效应[22]。

硫酸软骨素的效应-时间方程符合Hill方程，如下式：
E max×T y
E=E0 －-----------
T50y+T y
其中E是测得的效应，T为对应的时间，E0是基础效应，E max是最大效应，T50是达到最大效应一半所需要的时间，γ为陡度因子。

临床效应采用Lequesne指数(Lequesne index)、Huskinson 100mm视觉模拟评分法(visual analogue scale，VAS)等指标进行表示。

在整个实验90天周期内，至少测定9个效应点。

评价相同剂量的不同口服制剂的生物等效性，即可通过比较E max，T50，γ的值来完成。

计算E max，（或E max/E0）、T50，γ的90%置信区间，只有这些置信区间均在在0.8-1.25的范围内时，这两种制剂才能被认为生物等效。

按
照该方案进行的硫酸软骨素生物等效性研究已经获得FDA的认可。

2.4.2 重组组合干扰素α-con-1生物等效性研究
重组组合干扰素α-con-1（IFN-α-con-1）为例。

IFN-α-con-1是一种合成的，非天然存在的Ⅰ型干扰素。

依据现有的干扰素测定方法，在人用剂量范围内，IFN-α-con-1浓度不能达到可检测血清水平。

有日本研究者通过测定经IFN-α-con-1活化的抗病毒蛋白2’-5’OAS（寡腺苷酸合成酶）和β2-巨球蛋白的浓度，并计算AUC、C max、T max，两者的数据都提示AUC 和C max的剂量-反应相互关系[23]。

以临床效应为指标进行生物等效性研究，则效应指标的选择是试验设计的重点，必须能充分反应临床疗效，同时能反应一定的药物作用机理，以前一个目的为主。

效应指标的选择必须和审评当局充分磋商。

2.5 高变异性药物(High Variable Drugs,HDV)
生物等效性研究，等效标准是主要药动学参数的几何均值比的90%置信区间在80-125%内，但是，对于部分药物，由于个体内差异较大，达到生物等效性要求所需例数有时候会变得很大，甚至会达到100例以上。

通常认为药动学参数(AUC和/或C max)的个体内差异
（within-subject variability，CV WR）大于30%时，该药物即被视为高变异药物。

如果已经上市的参比制剂自身就有较大的变异，那么要求受试制剂达到很窄的等效标准就超越了临床需求，加大了注册申请人的申报难度，使得高变异药物的仿制药上市门槛增加。

高变异药物并不是少见现象。

在2003至2005年度内申报至FDA的212个生物等效性试验中，有33个试验AUC和/或C max的CV WR>30%。

高变异药物的生物等效性的评价方法一直是国内国际会议的重要议题。

早期，注册申请人通常采用增加受试者例数、重复交叉设计和多剂量稳态评价和放宽90%CI限制的方法，以减小误判制剂生物不等效的几率。

经过数年多方国际组织的反复讨论，FDA最终选择比例标
化平均生物等效性法（Scaled Average Bioequivalence，SABe），并于2010年出台了埃索美拉唑的生物等效性研究指南草案[24]。

在该指南中，注册申请人可以选择经典的生物等效性方法进行评价，也可以选择SABe方法进行评价。

指南要求试验采用单剂量、随机、三交叉设计，受试者随机按照RTR、TRR、RRT的顺序给药，利用两次服用参比制剂的血药浓度数据计算参比制剂的个体内变异（CV WR），再依据该变异来决定生物等效性评价标准[25,26]。

该方法的核心是放宽生物等效标准，标准放宽的程度取决于参比制剂的变异。

参比制剂变异越大，等效性标准越宽。

等效标准具体计算方法如下：
当CV WR>30%时
其中σWO=0.25。

但是这种方法对受试制剂和参比制剂几何均值比的差别缺乏敏感性，因此FDA建议在比例标化平均生物等效性法的基础上，加入对参数点估值的限值，以减少Ⅰ型错误的概率。

要求受试制剂/参比制剂的几何均值的比值在±20%内。

同时FDA要求，试验中受试者例数不得少于24例。

欧洲药品管理局（EMA）也采用了类似的方法进行生物等效性评价，唯一的区别在于
σWO=0.294。

0.294来源于CV WR=30%的换算公式：
s代表方差分析中试验的偶然标准变异，s2表达偶然变异。

两种等效标准比较如下：
目前已有文献报导的高变异药物有埃索美拉唑、氯丙嗪、法莫替丁、硝苯地平等。

2.6 高毒性和/或治疗窗窄药物(Critical Dose Drugs, CD/ Narrow Therapeutic Index Drugs，NTI)
目前对于一些高毒性和/或治疗窗窄的药物，例如环孢素、地高辛、华法林等，由于其毒性大、治疗窗窄，所以仿制药替换原研药，病人会面临一定的额外的风险。

目前对于该类仿制药物的生物等效性究究竟如何评价，一些要点问题尚存在很大的争议，例如高毒性和/或治疗窗窄的药物的定义、采用哪种等效标准、标准的范围如何确定等等。

目前，澳大利亚、加拿大、欧洲、日本、南非等国家和地区陆续出台了相关的指南或意见，其中2012年2月加拿大卫生部治疗产品局（TPD）颁布了新版相对生物利用度研究指南，明确了高毒性和/或治疗窗窄药物的生物等效性研究要求[27]。

首先，TPD的指南明确了CD的定义：剂量或浓度的较小变化从而导致剂量或浓度依赖性的治疗失败和/或出现严重ADR的药物。

严重ADR是指ADR持久、不可逆或恢复缓慢、
危及生命、导致患者住院或需延长住院时间、持久或重大残疾、致残，甚至死亡等。

需药物干预以预防上述事件发生的ADR也被列为严重ADR。

目前被TPD认可的CD药物包括：环孢素、地高辛、氟卡尼、锂制剂、苯妥英、西罗莫司、他克莫司、茶碱、华法林。

TPD对该类药物BE试验的一般要求：①受试制剂的AUC在参比制剂的90.0-111.0％范围内。

②受试制剂的C max在参比制剂的80.0-125.0％范围内。

以上参数在空腹和进食状态下必须同时满足。

另外，通常情况下无须进行多次给药达稳态情况下生物利用度研究，但是特殊情况下，如果需要进行稳态研究，受试制剂的C min亦必须在参比制剂的80.0-125.0％范围内。

该类药物BE试验注意事项：
①基于CD药物的不良反应的严重性，受试者最好采用已经服用该药物的患者。

②为突出药品间的差异，减少受试者例数，受试者的疾病状态应尽可能一致。

③对于临床需要长期给药的药物，在给药达稳态后，研究一个给药间隔内的生物利用度是可行的。

由于这类病人通常不能中断用药，所以临床试验开始后，病人从治疗药品替换成试验药品，必须至少给药五个半衰期以上才能采血，以清洗前期治疗药品对试验药品的影响。

④研究条件标准化程度(每天的给药时间需要固定，受试者状态尽量相近)对结果影响很大。

⑤出于伦理学方面的考虑，要求试验采用平行设计，而不是交叉设计。

欧洲药品管理局（EMA）人用医疗产品委员会(CHMP,Committee for Human Medicinal Products)委托药动学工作组(PKWP，Pharmacokinetics Working Party)发布的Questions & Answers: Positions on specific questions addressed to the Pharmacokinetics working party文件中，对于窄治疗窗的他克莫司和环孢素提出了明确的的生物等效性要求。

对于他克莫司，AUC的等效性标准为[90-111%]，单剂量给药时的C max的等效性标准为[80-125%]。

对于环孢素，要求在饮食和空腹条件下AUC、C max均满足[90-111%]等效性标准。

FDA对于窄治疗窗药物的等效性评价采用了另外一种思路。

2012年12月FDA出台了华法令生物等效性评价指南草案[27]，明确表明采用全重复交叉试验设计(fully replicated crossover design)，等效性的标准采用前述比例标化平均生物等效性法，同时还要比较参比制剂和受试制剂的个体内变异。

后一个目的就只能采用全重复交叉试验设计，而不能采用部分重复交叉试验设计。

治疗指数窄的药物，通常只能是低变异药物，否则安全性就不可控。

此时90%置信区间一
般很窄，例如85-90%或115-120%，依然落在等效标准80~125%范围内。

这种情况下，患者在治疗过程中替换药物(interchangeability，Switchability)，可能会导致安全性或有效性问题。

所以，对于窄治疗窗药物，需要在严格等效性界值的基础上(FDA将等效界值从80%~125%缩窄至95%~105%，最终确定为90%~111%。

关于此等效性界值，FDA药学和临床药理专业咨询委员会的观点已有多次变化和反复)，再根据参比制剂的变异放宽等效标准。

另外，还必须求算σWT/σWR的90%置信区间，其上限必须小于等于2.5。

计算公式详见文献[27]。

FDA关于华法令的生物等效性指导原则草案的出台，事实上是对1999年FDA 的指导原则草案《Statistical Approaches to Establishing Bioequivalence》的补充修订，明确表明等效统计过程中不再考虑受试者X制剂的交互变异。

2.7 特殊缓控释制剂的新型评价参数
对于缓控释制剂的生物等效性评价，对于参数AUC、C max要求等效，并加上相近的T max。

但是有些药物以上三者等效/相近并不能保证药物的安全性和有效性。

盐酸唑吡坦为催眠药物，吸收快，起效迅速。

但是，由于消除斗衰期平均为2.4小时，作用。