6、膜片钳实验流程

膜片钳记录系统

仪器简介：膜片钳技术是细胞电生理方面的高端技术，是研究细胞膜离子通道的重要工具。目前细胞膜离子通道的研究已经应用到了药物作用、环境对细胞膜离子通道的影响、神经网络研究以及疾病的诊断和治疗等多个领域。膜片钳技术是神经科学、心血管、药物学和药效学、功能基因组学和许多遗传病深入研究的有力手段。

仪器名称：膜片钳记录分析系统

主要设备：PC-2B放大器、AXON200B放大器、正置显微镜、倒置显微镜、NIR-DIC 成像系统、水镜头、微操纵器、微电极拉制仪、抛光仪、振动切片机等。

仪器功能及应用范围：单细胞膜片钳记录（急性分离细胞、培养细胞）、脑片膜片钳记录（盲法、可视法）

收费标准：培训费：1个月以内—500元；1~3个月—1000元。

指导操作：院内20元/小时，院外40元/小时。

独立操作：院内60元/天，院外120元/天（由两位指导老师认可培训

合格，方可进行独立操作）。

开放时间：周一至周五

管理规定：

⑴膜片钳记录分析系统属于高端精密仪器，因此任何进入本室进行膜片钳实验的人员，必须经过本室专门人员培训合格认可后，经允许方可进行膜片钳放大器、微操纵器、拉制仪、切片机、显微镜等仪器的操作。

⑵在实验过程中，必须严格按照实验流程进行操作，不得擅自更改操作步骤，不许自行调改仪器设置，以免造成仪器毁损。

⑶仪器损坏赔偿事宜按照我室赔偿制度进行处理。

⑷统一安排实验时间，使用仪器后作登记。

⑸实验人员负责当天的水电安全和室内卫生。

脑片膜片钳实验流程

(PC-2B)

一、脑片制作

1.配制新鲜蔗糖溶液（4°C）和NaCl孵育液（室温，20~25°C）各1L。

2.用丙酮浸泡刀片30 min。

3.麻醉动物：爪蟾—MS-222，大鼠—乌拉坦。

4.解剖动物，取脑组织。

5.切片：根据不同的动物和组织选择不同的方案。

方案一：低熔点琼脂包埋组织后进行切片。

方案二：普通琼脂作托进行切片。

6.处理脑片：蔗糖溶液中40～60min（4°C或32°C）。

7.孵育脑片：NaCl溶液中放置0.5~1h（室温）后可进行膜片钳实验。

注：脑片制作过程需全程通入95%O2+5%CO2混合气。

二、全细胞膜片钳记录

（一）盲法

1.将脑片置于灌流槽内，用银丝压牢，并确保灌流系统通畅、稳定。

2.双手接触屏蔽罩以释放操作者身体静电。

3.打开放大器POWER→ON，记录模式选择SEARCH档。

4.打开IBBpatch-clamp软件，点击按钮，监测电流及电阻变化。

5.系统holding选择-50~ -80mV。

6.安装玻璃微电极。

7.用注射器给电极内施加适度正压。

8.降低电极入水，并接近脑片。

9.封接：用微操纵器推动电极接触脑片，并逐渐向脑片深处推进，当电阻突然增大，电流降低1/3以上时，释放注射器内正压，缓慢抽吸，逐渐形成千兆欧姆封接（gigohm）。

10.破膜：轻拉注射器，突然出现大的电容电流，表明已破膜，Whole-cell 模式

形成。

11.迅速点击按钮，记录模式选择VC档。

12.点击按钮，可观察电流变化，但是不记录、不保存。点击按钮，可观察并保存电流变化。

（二）可视法

基本步骤同盲法，不同的是需要在步骤8之前打开监视器的DVCView软件，在水镜头下找到目的细胞后再将电极入水，逐渐接近脑片直至到达该细胞，在可视的情况下完成后续步骤。

单细胞膜片钳实验流程

(AXON200B)

一、单细胞急性分离

一般过程为：解剖→切片→孵育→消化→洗酶→吹打→细胞贴壁。

以急性分离大鼠海马神经元为例叙述如下：

1.配制人工脑脊液(ACSF) 250ml。

2.解剖：断头取脑，在冰冷（0~4°C）ACSF中取出海马。

3.切片：将海马沿矢状位切成400~600μm厚的脑片。

4.孵育：脑片在ACSF中室温下孵育50min。

5.消化：将孵育后的脑片移入酶消化液中，32°C消化25min。

6.洗酶：用ACSF洗脑片3次。

7.吹打：依次用口径递减的三个吸管轻轻吹打脑片，制成单细胞悬液。

8.贴壁：将单细胞悬液竖直静置5min，吸取上方细胞悬液加到培养皿中，约30min后细胞贴壁，即可进行膜片钳实验。

注：细胞急性分离过程需全程通入95%O2+5%CO2混合气。

二、全细胞膜片钳记录：

单细胞膜片钳实验需要在倒置显微镜下进行，其步骤与脑片膜片钳记录过程基本相同。由于可直接看到细胞，故可以将微电极直接接近并接触目的细胞，完成封接、破膜等一系列过程。软件设置和放大器操作不同之处主要有以下几点：

1.按下放大器POWER，记录模式选择Vm档

2.进入记录软件：开机后按F8键进入MS-DOS系统→ 输入“cd pclamp6”命令→ 输入“clampex / fetchex”进入记录界面。

3.File选择预先设定好的刺激参数。

4.Trial → TestSeal 监测电流变化，进行封接和破膜，形成全细胞模式。

5.记录模式选择V TRACK档

6.Trial → View 观察电流变化，但是不记录、不保存。

7.Trial → Record可观察并保存电流变化。

拉制仪操作流程

采用两步法拉制玻璃微电极：

1.打开电源POWER(-)，预热10min。

2.调节拉制参数。

第1步拉制参数：将左侧旋钮旋置NO.1 HEATER，再旋转右侧第一个旋钮NO.1 HEATER ADJ，调到所需参数。

第2步拉制参数：将左侧旋钮旋置NO.2 HEATER，再旋转右侧第二个旋钮NO.2 HEATER ADJ，调到所需参数。

注：调节参数过程的动作要迅速，持续时间不宜过长。

3.将左侧旋钮置于STEP2位置。

4.安装电极，将加热丝旋到上方，按START，完成第一步拉制。

5.将加热丝旋下，待加热丝完全变暗后，按START，完成第二步拉制。

6.关闭电源POWER(○)。