重复经颅磁刺激对阿尔茨海默病学习记忆功能的预保护研究

重复经颅磁刺激对阿尔茨海默病学习记忆功能的预

保护研究

陶华英1，田心2*

1天津医科大学总医院神经病学研究所神经生理室，天津（300052）

2天津医科大学生物医学工程系，天津（300070）

E-mail：tianx@

摘要：重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS)可对有记忆主诉者的脑认知功能产生积极的影响[22]。本文针对经颅磁刺激的神经保护作用，将其用于AD的保护性干预，通过Morris行为学检测及电镜下形态学观察在进行AD造模之前，预先给予大鼠rTMS对AD学习记忆功能的预保护作用。结果显示预先施加低频(LFrTMS-AD)及高频(HFrTMS-AD) rTMS组、直接造模组（AD）较对照组Morris水迷宫行为测试的全时程及末2天平均逃避潜伏期显著均延长；在平台象限的游泳时间和路程占总游泳时间和总路程的百分比均明显下降；这一结果在AD组更为显著，与两个rTMS干预组均存在统计学差异；而LFrTMS-AD组较HFrTMS-AD组潜伏期短，百分比值高(P<0.05)。电镜下AD组海马CA3区神经细胞突起肿胀，线粒体肿胀嵴消失，突触结构扭曲变形；rTMS干预组神经细胞结构大致完整，突触形态结构稍有改变或基本正常。上述结果说明：1. 预先施加rTMS能减轻AD造模对神经元及突触形态结构的损伤，对学习记忆功能具有一定的保护作用，且低频rTMS较高频效果更显著；2. rTMS对AD大鼠学习记忆功能保护作用的可能机制是：通过交变磁场（感应电流）的生物学效应，增高了与学习记忆及神经营养、保护有关的物质（如BDNF）水平，进而实现其对神经元、突触结构以及学习记忆功能的保护作用。

关键词：重复经颅磁刺激；阿尔茨海默病；Morris水迷宫；β淀粉样蛋白；鹅膏酸；预保护；学习记忆

阿尔茨海默病，（ Alzheimer’s Disease，AD），是人类老年期最常见的中枢神经系统原发性退行性病症之一。我国六十岁以上人群患病率为3－5％，85岁以上为40－60％，估计我国现有700－800万AD患者，这一数字还将随人口老化程度增加而增长。该病起病隐匿，早期可能仅有记忆困难或轻度健忘，往往难以及早察觉。当病人逐渐出现记忆障碍（近记忆及记忆保持障碍为主）、认知功能障碍、行为异常和社交障碍时，往往病情进行性加重，通常在2-3年内丧失独立生活能力，并常因并发症而死亡。

当前对AD尚缺乏有效的防治手段和客观的特异性早期诊断的生物学标志, 对于AD的治疗只限于延缓发病和疾病进展，因此对AD的防治已成为21世纪医学研究的热点和难点，寻找有效、费用低廉且易于实现的预防方法具有重要社会意义。

近十年来，作为一种非侵入性、无痛、易行的刺激方法，日益成为神经科疾病的临床诊断治疗和研究的新途径。rTMS已被应用到神经科学的许多研究领域，如大脑感觉和运动传导通路的研究、学习和记忆的研究、认知和语言功能的定位研究等，并对脑血管病、帕金森氏病、偏头痛和多种心理疾患取得了较好的临床治疗疗效。多项研究表明在常规临床参数和标准情况下，rTMS不但不会引起神经组织损伤和出血，而且还具有减轻脑水肿、保护缺血神经元的作用[9,10,11,12]。最新研究还指出rTMS可募集参与记忆编码过程的代偿性神经网络，因而可对有记忆主诉者的脑认知功能产生积极的影响[22]。鉴于AD最早出现的临床症状即为近记忆减退，即使仅有记忆主诉并保持正常认知水平, 亦有可能在未来一段时间进展为AD，因此在出现典型的AD临床症状前，施加rTMS，有可能对有记忆主诉者的学习记忆功产生保护作用。以此为切入点，本文针对经颅磁刺激的神经保护作用，首次将其用于AD的保护性干预，即在造模前给予

rTMS，以研究rTMS对AD模型的学习记忆功能的预保护作用，为AD的临床预防提供实验依据和方法。

1．材料与方法

1.1 实验动物及分组

Sprague-Dawley（SD）大鼠，5月龄，雌雄各半，雌鼠体重250-350g，雄鼠体重350-450g, 由军事科学院实验动物中心提供（合格证号：0056093）。12h光照，12h 黑暗。室温维持在25±1℃。所有涉及动物的实验均按美国国立卫生研究院（NIH）颁布的“实验动物的照料和使用指南”的要求进行。

将全部大鼠按体重随机分为4组，每组12只，雌雄各半，分别为：1. 预先低频rTMS 组(LFrTMS-AD)；2. 预先高频rTMS组(HFrTMS-AD)；3. 直接造模组（AD）；4.空白对照组。

1.2 实验方法

预先分别对LFrTMS-AD组、HFrTMS-AD组大鼠施加低频及高频rTMs 后(参数见后述)，采用脑内立体定位，双侧NBM核联合注射Aβ和鹅膏酸（Ibo）的方法，对rTMS干预组及AD组大鼠进行AD造模，并分别进行大鼠学习记忆功能测试及形态学检测。

1.2.1 AD模型大鼠的制备

大鼠用乌拉坦腹腔注射(33mg/Kg体重)麻醉后，置于脑立体定位仪上，定位脑NBM 核，位点为Bregma点向后1.8mm；正中旁开2.8mm；硬脑膜下7.0mm。采用微型电钻，左右对称各钻一孔（直径0.8mm）,由微注射泵每侧分别注射Aβ1-40 4µl(含Aβ1-404µg, 已在37℃孵育1周)及Ibo 1µl(含Ibo 1µg)，20min内注射完毕，留针10min。术后常规饲养，对出现惊厥者给予少量安定（肌肉注射），视体温情况给予抗生素。1.2.2 AD模型大鼠的Morris水迷宫行为学

检测

各组大鼠均在购入后，经10天适应性饲养，开始进行初次Morris水迷宫测试。于造模术后3周，各组大鼠再次进行Morris水迷宫测试。包括定位航行实验和空间搜索试验。

定位航行实验：历时4天，第1天大鼠自由游泳2min（随机点入水,无平台），从第2天起，每天分为两个训练时段（间隔大于8小时），每个训练时段训练4次，每次均由不同象限入水，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(即逃避潜伏期)。本实验设定大鼠在平台停留时间大于2秒为找到平台；如果在120秒内未找到平台，则将其引至平台，使其停留20秒，其逃避潜伏期记为120秒。

空间搜索试验：第5天撤除平台，大鼠由Ⅰ象限入水，同步记录其120秒运动轨迹。计算其在平台所在象限的游泳时间及游泳路径长度占总游泳时间及总路径长度的百分比。

1.2.3 rTMS的实施方法及参数确定

采用丹麦Meditronic公司Maglite Pro-25型磁刺激器，选用聚焦效果较好的“8”字型刺激线圈，内径10mm，外径80mm, 厚度60mm。施加刺激时，将“8”字线圈中心对准清醒大鼠矢状缝的中央点，线圈表面紧贴头皮，平行于大鼠顶骨。

本文中造模前对LFrTMS-AD组采用的刺激参数为：20个串/日，20个pulse/串，刺激频率为1Hz，连续刺激5天为一疗程，共4个疗程，疗程间隔为1周；HFrTMS-AD组刺激频率为5Hz，其他刺激参数同LFrTMS-AD 组。限于实验条件，本文参照Luft等人对大鼠rTMS所测得的运动阈值[14]，刺激强度选定为0.4-0.5 Tesla。

1.3 海马CA3区超微结构电镜观察的动物取材

随机选取HFrTMS组、LFrTMS组、直