生物工程下游技术 第四章 沉淀法
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蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、 构象以及分子周围的环境所决定。
一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分 子蛋白质更易溶解。
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell) 可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）
因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存 在的。
DLVO理论
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗 粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势 垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现 为吸引位能。
沉淀策略及方法 策略
破坏蛋白质周围的水化层 降低双电层厚度（ζ电位）
第二节 蛋白质的表面特性
蛋白质组成 20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性
氨基酸和亲水性氨基酸 蛋白质折叠趋势
疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势 结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基 暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区构成。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时 就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中 各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
基本概念
通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固 体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技 术称为固相析出技术。
β 2.5
2.0
1.5 S0
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Βιβλιοθήκη Baidu
123456 μ
应用：
蛋白质和酶分离提纯 多肽、多糖和核酸也可以用盐析法进行沉淀分
离 20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉
淀 43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，
而tRNA保留在上清。
一、盐析法的原理及特点 原理
沉淀方法
改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂
第三节 盐析法
定义： 蛋白质在高离子强度的溶液
中溶解度降低、发生沉淀的 现象称为“盐析”。
两种现象：
盐溶：低盐情况，盐离子强 度的增高，蛋白质溶解度 增大。
盐析：高盐，盐离子强度增 加，蛋白质溶解度减小。
logS
胶体的定义
胶体是一种尺寸在1～100 nm以 至1000 nm的分散体。它既非大 块固体，又不是分子分散的液体， 而是具有两相的微不均匀分散体 系。
-《被遗忘了尺寸的世界》
Wilhelm Friedrich Ostwald (1853 – 1932)
蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球 体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成 的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体 颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的 凝聚和絮凝现象相似。
◆通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相 后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；
◆沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存 或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的， 即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。
◆沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况 下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初 级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉 淀分离得到目标产品的工业实例。
★静电斥力 ★吸引力
蛋白质/胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似
蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要 是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是 电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质 表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。
吸引力
颗粒间的相互作用 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力 Keeson 引力（偶极力） Debye 引力 （诱导力） London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
⑴ 中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的 分离纯化。 ⑵ 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸 以及生物小分子的分离纯化。 ⑶ 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多 用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂 蛋白。
⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质 的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使 用。 ⑸ 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主 要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为 沉淀剂。
基本原理：
根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的 目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质 与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大 小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的 改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子 强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
沉淀的分类
结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时称为 结晶法。
沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体 时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶 剂沉淀法和等电点沉淀法等。
沉淀法的特点和应用
◆沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用 于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分 离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用 的方法。
第四章 沉淀法
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲)
粗分离(盐析、萃取、超过滤等)
复性
纯化(层析、电泳)
脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
第一节 概述
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有 以下主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯 化的步骤繁多，流程长。
一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分 子蛋白质更易溶解。
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell) 可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）
因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存 在的。
DLVO理论
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗 粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势 垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现 为吸引位能。
沉淀策略及方法 策略
破坏蛋白质周围的水化层 降低双电层厚度（ζ电位）
第二节 蛋白质的表面特性
蛋白质组成 20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性
氨基酸和亲水性氨基酸 蛋白质折叠趋势
疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势 结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基 暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区构成。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时 就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中 各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
基本概念
通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固 体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技 术称为固相析出技术。
β 2.5
2.0
1.5 S0
1.0
0.5
0
-0.5
-1.0
-1.5
Βιβλιοθήκη Baidu
123456 μ
应用：
蛋白质和酶分离提纯 多肽、多糖和核酸也可以用盐析法进行沉淀分
离 20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉
淀 43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，
而tRNA保留在上清。
一、盐析法的原理及特点 原理
沉淀方法
改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂
第三节 盐析法
定义： 蛋白质在高离子强度的溶液
中溶解度降低、发生沉淀的 现象称为“盐析”。
两种现象：
盐溶：低盐情况，盐离子强 度的增高，蛋白质溶解度 增大。
盐析：高盐，盐离子强度增 加，蛋白质溶解度减小。
logS
胶体的定义
胶体是一种尺寸在1～100 nm以 至1000 nm的分散体。它既非大 块固体，又不是分子分散的液体， 而是具有两相的微不均匀分散体 系。
-《被遗忘了尺寸的世界》
Wilhelm Friedrich Ostwald (1853 – 1932)
蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球 体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成 的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体 颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的 凝聚和絮凝现象相似。
◆通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相 后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；
◆沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存 或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的， 即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。
◆沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况 下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初 级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉 淀分离得到目标产品的工业实例。
★静电斥力 ★吸引力
蛋白质/胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似
蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要 是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是 电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质 表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。
吸引力
颗粒间的相互作用 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力 Keeson 引力（偶极力） Debye 引力 （诱导力） London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
⑴ 中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的 分离纯化。 ⑵ 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸 以及生物小分子的分离纯化。 ⑶ 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多 用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂 蛋白。
⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质 的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使 用。 ⑸ 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主 要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为 沉淀剂。
基本原理：
根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的 目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质 与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大 小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的 改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子 强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
沉淀的分类
结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时称为 结晶法。
沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体 时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶 剂沉淀法和等电点沉淀法等。
沉淀法的特点和应用
◆沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用 于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分 离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用 的方法。
第四章 沉淀法
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲)
粗分离(盐析、萃取、超过滤等)
复性
纯化(层析、电泳)
脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
第一节 概述
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有 以下主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯 化的步骤繁多，流程长。