淀粉酶的提取要点
实验一 淀粉酶的提取及作用
实验一淀粉酶的提取及作用
一．原理：
1.淀粉淀粉酶水解蓝色糊精红色糊精无色糊精麦芽糖葡萄糖
2.葡萄糖+斐林试剂Cu2O↓(砖红色）
二．植物材料与实验器具：
植物材料：萌动的小麦
实验器具：试管；玻棒；量筒；研钵；漏斗；电炉；水浴锅
试剂：2%淀粉溶液；稀I-KI 溶液（原液稀释5倍）；斐林试
三．操作步骤
1. 取10粒萌动的小麦种子放入研钵中，用量筒取10ml蒸馏水作为淀粉酶提取液总量
（包括研钵清洗、种子研磨），分三次加入，将小麦研成浆状，用脱脂棉过滤于试管中,摇匀。
滤液静置5-10min ,上清液为淀粉酶的提取液。
2. 取2只刻度试管做标记A管、B管
A管：2ml 2%淀粉液+2ml蒸馏水38℃
B管：2ml 2%淀粉液+2ml淀粉酶提取液20min
加I-KI 2~3滴观察并比较两管颜色变化。
3.B管+3ml 斐林试剂沸水浴2~5min观察颜色变化
四。
实验结果
淀粉酶能将淀粉水解成葡萄糖。
α-淀粉酶的生产工艺流程
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淀粉酶 原料
淀粉酶是一类能够水解淀粉为糖类的酶，常用于食品加工、酿造和生物技术等领域。
淀粉酶的原料主要包括以下几种：
1.淀粉：淀粉是淀粉酶反应的底物，通常从植物中提取得到。
常见的淀粉源包括玉米、小
麦、马铃薯等。
2.发酵产物：某些淀粉酶可以通过微生物发酵产生。
这些淀粉酶的原料可以是含有淀粉的
废弃物或副产品，如谷物糟粕、纤维素废弃物等。
3.培养基成分：对于通过微生物发酵生产淀粉酶的方法，培养基中需要添加适当的碳源、
氮源和微量元素等。
常见的培养基成分包括葡萄糖、蛋白质源（如酵母提取物）、氨盐等。
4.微生物菌株：淀粉酶的生产通常使用具有高产酶能力的微生物菌株。
这些菌株可以是细
菌、真菌或酵母等。
常见的微生物菌株包括枯草杆菌、曲霉、酵母菌等。
以上是常见的淀粉酶原料，不同的淀粉酶制备方法和应用领域会有所差异。
选择合适的原料和生产工艺对于获得高效、纯度较高的淀粉酶产品至关重要。
简述淀粉酶解法的工艺流程
淀粉酶解法工艺流程简述
一、准备阶段
1.原料准备
确保淀粉供应充足
准备水和其他添加剂
2.设备检查
检查酶解设备和配套设备状态
确保设备清洁和正常运行
3.环境准备
清洁操作场地
调节环境温湿度适宜
二、酶解过程
1.原料混合
将淀粉与适量水混合
添加调节pH值的酸碱剂
2.加酶酶解
加入淀粉酶
控制酶解温度和时间
3.反应结束
根据需要停止酶解反应
冷却淀粉酶解液至室温
三、分离与提取
1.液固分离
过滤或离心分离液体与固体淀粉残渣2.酶提取
对液体部分进行进一步酶提取
可采用浓缩、纯化等方法
四、精制与后处理
1.澄清
通过澄清剂去除淀粉酶解液中的浑浊物2.浓缩
将酶解液浓缩至所需浓度
3.灭酶
对酶解液进行加热或添加抑制剂灭活酶
五、成品处理
1.包装
根据产品性质选择合适的包装方式
2.标签贴附
贴上产品标签和相关信息
3.成品储存
存放于干燥、阴凉、通风的库房中。
怎样提取淀粉酶
3、透析与超滤
利用基因工程对微生物进行改造，通过发酵工程 根据淀粉酶的分子大小 分离浓缩获得淀粉酶 1、获取淀粉酶的基因序列
2、重组质粒，感受态细胞的制备
3、转化 4、质粒制备 5、质粒酶切验证 6、转化到感受态细胞 7、筛选 8、重组菌
9、揺瓶培养产酶
10、酶活性的鉴定，分离 纯化浓缩。
11、小罐发酵：
（三）根据淀粉酶带电性质进行分离
1、电泳法 2、离子交换层析法
1、硫酸铵盐析法
《淀粉酶的纯化_硫酸铵盐析法中几种激活剂对酶回收率的影响》
1、三角瓶取酶液50ml
2、加入25%CaCl2
5ml 加入45ml 蒸馏水 静置4 h
3、加入硫酸铵60g,搅拌完全溶解。静置24小时，过滤， 4、滤物，在40度 烘干。即淀粉酶。
2、电泳法
电泳步骤：
1、淀粉酶的粗提取液
2、电泳槽的组装，制胶 3、标准液的制备 4、点样 5、电泳
6、固定，染色，脱色
7、切胶，捣碎过滤提取，或透析。
烘干
4、点样 用移液枪吸取10ul标准品加入到第一个样孔中，然后再吸取样品依 次加入到各个加样孔中，为了获得准确的结果，样品应做两次重复。 5、 电泳 将电泳槽与电泳仪连结，在电泳槽中加入已经稀释的电极缓冲液， 打开电源，选择合适电压，保持恒电压80--120V，进行电泳，直至样品 中燃料迁移至离下端1cm处，停止。 6、固定，染色，脱色 将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡 30min 以上 （染色时间需根据凝胶厚度适当调整）。取出凝胶在水中漂洗数次，再 加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全 脱色则需更换脱色液2～3次，震荡达24h以上。
钟01030207 201030239 201130126
α-淀粉酶的分离提纯
α- 淀 粉 酶 的 分 离 方 法 的 比 较 α-淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途。目前工 淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途。 淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途 业上从发酵液中提取α淀粉酶的方法多 淀粉酶的方法多。 业上从发酵液中提取 淀粉酶的方法多。 主要有直接用硫酸铵沉淀和采用絮凝-超滤 超滤-乙醇 主要有直接用硫酸铵沉淀和采用絮凝 超滤 乙醇 沉淀方法 。 种方法食品工业上不能使用。 第一 种方法食品工业上不能使用。 第二种方法要求发酵液澄清度好， 第二种方法要求发酵液澄清度好，否则超滤膜堵 此外超滤法浓缩酶液是有限度的， 塞， 此外超滤法浓缩酶液是有限度的，沉淀仍消 耗大量的乙醇同时酶的回收率也较低一般在55%左 耗大量的乙醇同时酶的回收率也较低一般在 左 右。 为了提高产品的活性,酶活性的回收和减少乙醇的 为了提高产品的活性 酶活性的回收和减少乙醇的 用量已有相关报道用大孔吸附树脂吸附的方法分 离纯化α- 淀粉酶 。在此进一步改进了洗脱方式， 离纯化 在此进一步改进了洗脱方式， 使其更便于工业化生产， 使其更便于工业化生产，使用离子交换的方法进 一步纯化α- 淀粉酶。 淀粉酶。 一步纯化
吸附树脂法发酵液cacl加水溶解加入絮凝剂搅拌压滤收集滤液滤液中加入吸附树脂过滤弃去滤液收集吸附树脂收集滤液40的乙醇过滤5乙醇成品收集沉淀沉淀无水乙醇洗脱ph为650005mollph为6502mollph为6505moll反复洗涤de32处理好的de32转入烧杯过夜制3cm4cm的层析柱2mlmin的流速平衡2h2mlmin洗脱酶液得洗脱峰1收集洗脱液测酶活性2mlmin洗脱酶液得洗脱峰2收集洗脱液测酶活性称取树脂吸附淀粉酶1g10ml注意
出峰图
注意！！！
–N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经 皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮 肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无 毒物质。沉淀α-淀粉酶过夜 α
淀粉酶生产工艺
淀粉酶生产工艺淀粉酶作为一种重要的工业酶，广泛应用于食品、医药、饲料、糖化、纺织、皮革等领域。
下面将主要介绍淀粉酶的生产工艺。
淀粉酶的生产工艺通常分为两个步骤：种子培养和发酵生产。
1. 种子培养淀粉酶的种子一般由菌丝体制备而得，种子菌株的选取非常重要。
首先，从土壤、植物、食品中分离得到淀粉酶产生菌株，并经过传代培养筛选出优良菌株。
然后，选择合适的培养基进行菌株的预培养，以获得高活性和高产量的种子菌株。
培养基的选择要考虑到菌株的特性和经济性。
在种子培养过程中，通常采用摇瓶培养或容器培养的方式，控制好温度、pH值和氧气供应等条件，优化菌株的生长。
2. 发酵生产种子培养完成后，将种子菌株接种到大型发酵罐中进行发酵生产。
发酵过程需要控制好发酵温度、pH值、氧气供应和添加剂的投放等条件。
温度：淀粉酶的产生通常在30-50°C之间，具体温度要根据菌株的特性来确定。
温度过高或过低都会影响酶活性和产量。
pH值：淀粉酶一般在中性或微酸性环境下活性最高，一般在pH 5.0-7.0 的范围内进行发酵。
氧气供应：氧气供应对淀粉酶的产生有重要影响，因为淀粉酶属于需要氧气的好氧菌株。
因此，在发酵过程中需要控制好氧气的供应，提供充足的氧气以促进酶的产生。
添加剂：为了提高淀粉酶的产量和稳定性，常常会在发酵过程中添加一些助产剂或诱导剂，如优质动物蛋白、磷酸盐和氨基酸等。
这些添加剂能够提供菌株合成淀粉酶所需的营养物质，增加产酶能力。
发酵时间一般为24-72小时，根据菌株的生长速率和淀粉酶产量进行调整。
发酵过程中，可以通过监测酶活性和生物量的变化来掌握发酵的进程和产酶情况。
在发酵结束后，可通过离心、超滤等技术手段将淀粉酶提取和分离出来，经过加工和精制，最终得到纯净的淀粉酶产品。
综上所述，淀粉酶的生产工艺主要包括菌株的培养和发酵生产两个步骤。
通过控制好培养条件和发酵参数，能够提高淀粉酶的产量和质量，达到产业化生产的要求。
淀粉酶的提取-α-淀粉酶的提取、分离及测定
α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chroma togra phy)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。
20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。
到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromat ograp hy, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。
但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。
20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。
自20世纪40年代以来以Mart in 为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。
20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。
而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。
淀粉酶的制备
0时刻5min时 刻Fra bibliotek0时刻
5min时 刻
0时刻
5min时 刻
B1 B1’ F1 F1’ B2 B2’ F2 F2’ B3 B3’ F3 F3’
淀粉酶液 (ml)
0.3
0.2
0.5
H2O (ml) 3.5 pH 6.8缓冲液
0.3 ％ NaCl
预热
各 1 ml 各 1 ml 摇匀， 37 ℃ 水浴 2 min
一、实验目的
掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法
本实验是以一定量的α -淀粉酶液，于37 ℃ 、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间内将 淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用， 比色测定求得还原糖的生成量，从而计算出酶反 应的初速度，即酶的活力
这里规定，一个淀粉酶活力单位为在37 ℃ 、 pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1 mg还原 糖所需要的酶量。
酶提取液解冻，取上清液0.05 mL，加蒸馏水稀释 到25 mL，摇匀备用 （2）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析 蛋白质解冻，取上清液0.05 mL，加蒸馏水稀释到 25 mL，摇匀备用 （3）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取 0.05 mL，稀释。
收集1管的同学，将0.05 mL稀释到15 mL 收集2管的同学，将0.05 mL稀释到10 mL
NaOH (ml)
11
11
11
预热的淀粉
各 1 ml，迅速摇匀
酶促反应
37 ℃ 水浴 5 min (准确计时)
NaOH (ml) DNS试剂 显色反应
比色
11
11
11
各 2 ml，摇匀
沸水浴 5 min，冷却，各用水定容至25ml，摇匀
介绍一种淀粉酶的简易取材方法
介绍一种淀粉酶的简易取材方法
裴进华
高中《生物》(必修)课本第45页的演示实验，证明酶是生物催化剂。
所用的酶，是选取萌发的小麦种子芽，与石英砂和蒸馏水碾磨后的过滤液。
我们做此实验时改用人的唾液方法较简便。
首先，准备好过滤装置，如漏斗、脱脂棉、试管等。
然后让几个同学漱口后，将脱脂棉含入口中吸足唾液，再将唾液挤入基部放有脱脂棉的漏斗中过滤，收集滤液，滤液内就含有丰富的唾液淀粉酶，按1∶50稀释即可直接用于实验。
此法既解决了酶的取材问题，又提高了学生的学习兴趣，效果很好。
淀粉酶的提取原理
淀粉酶的提取原理
淀粉酶的提取原理是利用微生物（如真菌或细菌）产生的淀粉酶对淀粉进行降解和分解。
提取淀粉酶的步骤通常如下：
1. 选择合适的产酶微生物：选择能产生大量淀粉酶的微生物，如放线菌、曲霉等。
2. 制备培养基：制备含有适宜碳源、氮源、矿物质和其他辅助物质的培养基，以提供微生物生长和淀粉酶产生所需的营养物质。
3. 预处理培养基：对培养基进行适当的预处理，如调整pH值、消毒等。
4. 接种培养基：将选定的微生物接种到预处理的培养基中，并进行培养。
5. 酶液分离：经过一定时间的培养后，将微生物分离出来，通常通过离心或其他分离方法。
6. 纯化酶液：对酶液进行纯化和浓缩，以去除杂质。
7. 测定酶活力：通过测定酶液的酶活力来评估酶提取的效果。
提取淀粉酶的原理主要是通过培养合适的微生物产生酶，然后对酶液进行分离、纯化和测定酶活力，以获取纯化的淀粉酶。
淀粉酶的测定
淀粉酶的测定（青样）
称取鲜样0.2克（或0.5g），加1%NaCl 8毫升研磨（低温），放置15分钟，不时摇动。
3000rpm离心10分钟。
（1）取1ml酶液，加1％淀粉1ml
（2）空白：取1ml酶液，100度水浴10min，加1％淀粉1ml，混匀，40度水浴5min（准确）,取出，将各试管各加入DNS2ml，煮沸5min，冷却，定容至25ml，然后在520nm下比色。
注：淀粉临时配制。
1％淀粉：1g溶于100ml水中。
DNS试剂：精确称取3、5－二硝基水杨酸1g溶于20ml1mol/lNaOH 中，加50ml蒸馏水中，再加入30g酒石酸钾钠，溶解后盖紧瓶塞，勿使CO2进入。
麦芽糖标液称取麦芽糖0.1000g溶于少量蒸馏水中，定容至ml即为1mg/ml的麦芽糖标液。
标准曲线的制作：取25ml具塞刻度试管7支，按下表加入各种试剂混匀，在沸水浴中加热5分钟，取出，冷却后加蒸馏水至25ml 刻度，摇匀，在520nm下比色，绘出标准曲线。
淀粉酶及其在实验室中的制取讲解
式分为四种 :
酶的种类
α 酶
-
淀粉
β 酶
-
淀粉
葡萄糖淀 粉酶
α-
1, 6糖苷酶Biblioteka 酶的性质随机内切 酶
直链端切 酶
外切酶
特异性水解 α - 1, 6糖苷键
产 物 糊精 二糖 葡萄糖 直链淀粉
多 数淀 粉 由 20% ～25%的 直 链 淀 粉 和 75% ～ 80%的支链淀粉组成 ,直链淀粉借助分子内的氢键卷 曲成螺旋状 ,如果加入碘液 , I2 分子就会嵌入到螺旋结 构的空隙处 ,形成一种较稳定的淀粉 - 碘络合物 ,从而 使淀粉呈蓝色 。各种淀粉酶的作用部位不尽相同 [1 ] , 图 1。
(3)新编试题 新编试题也称为原创题 ,重点体
结论 (表 2) :在以多糖为原料的情况下 ,微生物产 生的淀粉酶较多 ,尤其以淀粉为主要原料时 ,微生物产 生的淀粉酶最多 ;单糖 、二糖为原料时 ,产生的淀粉酶 较少 ;在不含糖的培养基中 ,不产生淀粉酶 。
实验 2:不同疏松剂对淀粉酶产量的影响 。由以
A
BC
3
6
7
++
+
+
结论 :多数微生物在淀粉培养基中 ,均能产生 α 淀粉酶 。而当淀粉中加入纯种面包酵母时 ,蓝色消退 最快 ,产生淀粉酶较多 (表 3) 。
实验 3:不同植物中的淀粉对淀粉酶产量的影响 实验步骤 :称取各类淀粉 40g,分别加 2g面包干酵 母 ,加水搅拌成面团 ,常温下发酵 5 ～10 小时 ; 各加水 350mL ,摇匀 ,继续发酵数天 ,澄清液就是新鲜的淀粉 酶溶液 。用淀粉酶溶液 1. 5 mL 分别水解 3mL 3%的可 溶性淀粉溶液 (已加入碘液 ) , 50℃～60℃水浴 ,观察蓝 色消退时间并记录 。
淀粉酶的提取要点
α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。
20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。
到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。
但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。
20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。
自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。
20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。
而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。
同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。
气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。
20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。
淀粉酶测定的原理及方法
淀粉酶测定的原理及方法
淀粉酶测定的原理是利用淀粉酶对淀粉的水解作用来测定淀粉的含量。
淀粉酶是一种能够将淀粉分解为较小的多糖分子的酶类。
通过测定淀粉被酶解后产生的还原糖的量，可以间接推算出淀粉的含量。
淀粉酶测定的方法包括以下步骤：
1. 准备样品：将待测样品中的淀粉提取出来，通常使用适当的缓冲溶液进行提取。
2. 添加淀粉酶：将淀粉酶加入到提取得到的淀粉溶液中，使得酶与淀粉反应。
3. 反应：在一定的温度和pH条件下，将淀粉酶与淀粉反应一定的时间，使得淀粉被酶水解成还原糖。
4. 添加试剂：在反应结束后，添加适当的试剂，如碘化钾、硫酸或硫酸铵等，以停止淀粉酶的作用，并与未被水解的淀粉反应产生颜色的复合物。
5. 颜色测定：通过比色法、分光光度法或电化学法等测定淀粉酶反应产生的复合物产生的颜色强度或光学信号，来确定样品中淀粉的含量。
值得注意的是，淀粉酶测定需要在特定的温度、pH条件下进行，以使酶能够发挥最佳的活性。
同时，还应该进行合适的对照实验，在没有添加淀粉酶的条件下进行反应，以消除其他可能干扰测定结果的因素。
淀粉酶的发酵提取和
2. 在碱性溶液(NaOH)中，双缩脲 (H2NOC—NH—CONH2)能与Cu2+作用，
形成紫色或紫红色的络合物，这个反应
叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含 有很多与双缩脲结构相似的肽键（－CO －NH－），因此，蛋白质可与双缩脲试 剂发生颜色反应。 此络合物在540nm吸
收值在一定范围内与蛋白质的质量成正 比.
一、实验目的
通过以α-淀粉酶的发酵生产为实例，学 习和掌握酶的液体发酵和盐析沉淀法提 取纯化的基本原理和过程，掌握α-淀粉 酶分析方法、发酵和提取的评价标准。
二、实验原理
1、工业生产中酶的提取多数采用盐析沉 淀法，即：通过加入不同的金属盐破坏 酶的水化层同时中和酶的表面电荷，而 使酶快速的形成沉淀，得到分离纯化。 本实验通过向枯草杆菌发酵液中加入适 量的硫酸铵，对发酵液中的胞外α-淀粉 酶进行纯化提取。
2.0
3.0
4.0
5.0
?
震荡15分钟，室温静置30分钟后，540nm比色，以蛋白质含量（mg/ml）为横坐标，吸 光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 取发酵液5ml +5ml去离子水(即稀释一倍)
3. 分别测定酵液和提取液中的α-淀粉酶的酶活并 计算它们各自的酶比活力
α-淀粉酶的酶活测定
具体操作:5ml发酵液,加1.87克硫酸铵细粉 末,混匀, 静置30min.
两组配平,4000r.m.p离心10分钟, 离心去 除上清液保留沉淀。测活前加入10ml去离 子水溶解。(即稀释一倍)
注意:(剩下的溶液留下来用于下一次测蛋 白含量)
2.双缩脲法绘制小牛血清白蛋白标准曲线
取7支试管，编号，按下表加入试剂：
背景知识
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广 泛存在于动植物和微生物中。α-淀粉酶作 用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4键 而生成糊精和还原糖。产物的末端葡萄糖 残基C1碳原子为α-构型，故称α-淀粉酶。 如枯草杆菌BF7658 α-淀粉酶，广泛应用于 食品、酿造、制药、纺织以至石油开采等 许多方面。
产淀粉酶菌株的分离与纯化
产淀粉酶菌株的分离与纯化淀粉酶是一种非常重要的酶，能够分解淀粉成为可溶性糖，因而在食品、医药、酿酒等行业得到广泛应用。
因此，分离和纯化产淀粉酶菌株是具有重要意义的。
下文将介绍产淀粉酶菌株的分离与纯化方法。
1. 采集样品：淀粉酶通常存在于地下、水中、土壤等环境中。
样品的选择应根据所需的淀粉酶的类型和应用场景来决定。
2. 感染培养基：将样品置于适宜的环境中，如适温、适湿度、适pH值的培养基中，让细菌在培养基中生长和繁殖。
比较常用的培养基有TSA、PDA、LB、NB等。
3. 分离单菌：通过分离单菌，可以确定产淀粉酶的细菌，操作方法较为简单。
将样品分别在加了32g/L的琼脂和未加琼脂的培养基上涂布，按舞台上单菌生长的特点，通过肉眼观察或显微镜观察，挑选纯化细菌。
采用串联稀释法和滤膜法也可以分离单菌。
4. 鉴定菌株：通过对不同细菌的营养代谢特性，生化特性和形态特征等鉴定菌株，找出含有产淀粉酶的菌株。
1. 生长条件的调节：影响淀粉酶生长和产酶能力的因素有很多，如温度、pH、营养物质等。
应该根据菌株特性，适当调整这些因素，以提高淀粉酶的产量。
2. 分离淀粉酶：淀粉酶通常存在于细菌的胞外，利用超声波破碎、离心、超滤等方法可以将淀粉酶从菌体的胞外获得。
离心法是最常用的方法，将菌液离心后，分离出淀粉酶液，可以去除不溶性的杂质。
3. 纯化淀粉酶：淀粉酶纯化的方法有许多种，如酒精沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等。
其中，离子交换层析法是常用的一种方法，先将淀粉酶溶液加到离子交换树脂中，随后用缓冲溶液洗脱离子交换树脂，分离出淀粉酶。
以上介绍了产淀粉酶菌株的分离与纯化方法，这些方法可以得到高产量和纯度的淀粉酶，为利用淀粉酶提供了重要的技术支持。
淀粉酶的生产及应用
淀粉酶的生产及应用淀粉酶是一种重要的工业酶制剂，具有广泛的应用前景。
以下将就淀粉酶的生产和应用进行详细阐述。
一、淀粉酶的生产淀粉酶是通过发酵工艺生产的，主要来源于微生物、动物和植物。
1. 微生物源生产微生物源生产淀粉酶是目前主要的生产方式，常用的微生物有真菌和细菌。
常见的真菌有Aspergillus、Penicillium、Trichoderma等，常见的细菌有Bacillus、Streptomyces等。
微生物源生产淀粉酶的步骤一般为：选材→筛选高效菌株→发酵→提取淀粉酶→纯化淀粉酶。
2. 动物源生产动物源淀粉酶主要来自猪胰腺。
提取过程一般为：猪胰腺养殖→收集猪胰腺→粉碎破碎→提取淀粉酶→纯化淀粉酶。
3. 植物源生产植物源淀粉酶主要来自马铃薯、玉米等植物中。
提取过程一般为：马铃薯破碎→破菌、杀菌、酶解→提取淀粉酶→纯化淀粉酶。
二、淀粉酶的应用1. 食品工业中的应用淀粉酶在食品工业中有着广泛的应用，主要用于食品加工中的葡萄糖浆、糖化醇、果胶等的制备和糖化工艺的调控。
例如，淀粉酶可将淀粉酶解为较小的糖分子，提高食品中糖的含量，改善口感和稳定性。
此外，淀粉酶还可用于面包、饼干等面粉制品的改良，并提高其贮存性和食用品质。
2. 纺织工业中的应用淀粉酶在纺织工业中主要用于织物的整理处理，如退浆、硫酸盐还原等。
其作用是分解纺织原料中的淀粉，提高降解淀粉成分的活性和效果，从而达到改善织物的柔软度、光泽度和手感等目的。
3. 制浆造纸工业中的应用淀粉酶在造纸工业中广泛应用于原料中的淀粉和非淀粉物质的降解处理。
通过添加适量的淀粉酶，可以有效降低造纸原料中淀粉的含量，提高浆料的筛选效率和纸张的强度、光泽度等性能。
4. 医药工业中的应用淀粉酶在医药工业中主要用于药物的合成和改良。
例如，淀粉酶可以用于制备药物辅料，改变其物化性质，提高药物的稳定性和可溶性。
此外，淀粉酶还可用于药物的表面活性剂、缓释剂等的改良，提高药效和降低毒副作用。
怎样提取淀粉酶
3、透析与超滤
利用基因工程对微生物进行改造，通过发酵工程 根据淀粉酶的分子大小 分离浓缩获得淀粉酶 1、获取淀粉酶的基因序列
2、重组质粒，感受态细胞的制备
3、转化 4、质粒制备 5、质粒酶切验证 6、转化到感受态细胞 7、筛选 8、重组菌
9、揺瓶培养产酶
10、酶活性的鉴定，分离 纯化浓缩。
11、小罐发酵：
微生物、植物和动物都可做为制备淀粉酶的原材料。
பைடு நூலகம்
1、对现有含有的动植物组织进行提取纯化。 2、进行微生物分泌淀粉酶或通过基因工程对微生物进行改造大量生产淀 粉酶。
（一）根据淀粉酶溶解度不同的分离方法 1、硫酸铵盐析法 2、等电点沉淀法 3、低温有机溶剂沉淀法 （二）根据淀粉酶分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 2、凝胶过滤法
广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦 芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌 性的。此酶以 Ca2+ 为必需因子并作为稳定因子 ，既 作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切 断α －1，4-链。
（2）β-淀粉酶：
与α -淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐 次以麦芽糖为单位切断α －1，4-葡聚糖链。
（三）根据淀粉酶带电性质进行分离
1、电泳法 2、离子交换层析法
1、硫酸铵盐析法
《淀粉酶的纯化_硫酸铵盐析法中几种激活剂对酶回收率的影响》
1、三角瓶取酶液50ml
2、加入25%CaCl2
5ml 加入45ml 蒸馏水 静置4 h
3、加入硫酸铵60g,搅拌完全溶解。静置24小时，过滤， 4、滤物，在40度 烘干。即淀粉酶。
培养基成分为蛋白胨 1 ％、酵母粉 O ． 5 ％、 NaCl l ％、 l Ⅲ 2P040 ． 03 ％、 MgS04· 7H200 3 ％、葡萄糖 1 ％和 (NH4)3P040．2％，
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α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。
20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。
到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。
但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。
20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。
自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。
20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。
而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。
同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。
气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。
20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。
随着环境科学的发展，不仅需要对大量有机物质进行分离和检测，而且也要求对大量无机离子进行分离和分析。
1975年美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出了离子交换分离抑制电导检测分析思维即提出了离子色谱这一概念离子。
色谱概念一经提出便立即被商品化产业化由Dow公司组建的Dionex公司最早生产离子色谱并申请了专利。
我国从20世纪80年代开始引进离子色谱仪器，在我国八五、九五科技攻关项目中均列有离子色谱国产化的项目，对其进行了重点技术攻关。
色谱的分类色谱的分类有多种，主要按两相的状态及应用领域的不同可分为两大类1. 按应用领域不同分类制备色谱半制备色谱2. 以流动相和固定相的状态分类气相色谱、气固色谱、气液色谱、液相色谱、液固色谱、液液色谱、超临界色谱、毛细管电泳离子交换色谱离子色谱分离主要是应用离子交换的原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离子。
它在离子色谱中应用最广泛，其主要填料类型为有机离子交换树脂，以苯乙烯二乙烯苯共聚体为骨架在苯环上引入磺酸基形成强酸型阳离子交换树脂，引入叔胺基而成季胺型强碱性阴离子交换树脂，此交换树脂具有大孔或薄壳型或多孔表面层型的物理结构以便于快速达到交换平衡。
离子交换树脂耐酸碱，可在任何pH范围内使用，易再生处理，使用寿命长。
缺点是机械强度差，易溶胀，易受有机物污染。
离子色谱基本流程图如下图所示：离子交换的分类及常见种类（一）分类离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。
各类交换剂根据其解离性大小，还可分为强、弱两种，即强酸剂阳离子交换剂弱酸剂强硷型阴离子交换剂弱硷型。
1.阳离子交换剂阳离子交换剂中的可解离基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羟基（-OH）等酸性基。
某些交换剂在交换时反应如下：强酸性：R-SO3 -H+ ＋Na+ R-SO3- Na+H+弱酸性：R-COOH＋Na+ R-COONa ＋H+国产树脂中强酸1×7（上海树脂＃732）和国外产品Dowex 50、Zerolit 225等都于强酸型离子交换剂。
2.阴离子交换剂阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺[N-（CH3）2]和季胺[-N（CH3）2]等硷性基团。
某些交换反应如下：强硷性：R-N+（CH3）2 H·OH- ＋Cl R-N+（CH3）2 Cl＋OH-弱硷性：R-N+（CH3）2 H·OH- ＋Cl R-N+（CH3）2 HCl＋OH-强硷性＃201号国产树脂和国外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都属于强硷型阴离子交换剂。
（二）种类1.纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱（DESE-纤维素）。
2.交联葡聚糖离子交换剂：是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。
常用的Sephadex 离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。
阴离子交换剂有DEAE-Sephadex A-25，A-50和QAE- Sephadex A25 ，A50 ；阳离子交换剂有CM-Sephaetx C-50，C-50和Sephadex C-25，C-50。
阴离子交换剂用英文字头A，阳离子交换剂的英文字头是C。
英文字后面的数字表示Sephadex型号。
3.琼脂糖离子离交换剂：是将DESE-或CM-基团附着在Sepharose CL-6B 上形成，DEAE-Sephades（阴离子）和CM-Sepharose（阳离子），具有硬度大，性质稳定，凝胶后的流速好，分离能力强等优点。
交换剂的处理，再生与转型新出厂的树脂是干树脂，要用水浸透使之充分吸水膨胀。
因其含有政绩一些杂质，所要要用水、酸、硷洗涤。
一般手续如下：1.新出厂干树脂用水浸泡2 小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水2.加4倍量0.1-2N HCl搅抖4小时，除去酸液，水洗到中性3.再加4倍量0.1-2N NaOH搅抖4小时，除硷液，水洗到中性备用。
4.将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。
如希望阳树脂带Na+，则用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂带H+，可用HCl处理。
阴树脂转型也同样，若希望带Cl-则用HCl，希望带OH-则用NaOH。
再生：用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。
并非每次再一都用酸、硷液洗涤，往往只要转型处理就行了。
树脂保存方法使用过的树脂用大量的去离子水洗至中性后，放置于20％酒精中，4℃冰箱保存。
再次使用时，需先用大量的去离子水洗至中性，再用0.5N 氢氧化钠和0.5N 氯化钠处理0.5小时，洗至中性即可使用。
柱上操作⑴交换剂装柱最简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。
处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。
交换剂在柱内必须分布均匀。
装柱前应先在柱内保留1/3的缓冲液，并排除柱底部气泡，然后再倾入树脂。
⑵上样：向层析柱内倾入样品液⑶洗脱与收集不同样品选用的洗脱液不同。
原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。
由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。
1.3 试验流程1.3.1 粗酶液的制备将一定量的发酵酶粉溶于醋酸钠或者磷酸盐缓冲液中，4℃浸泡12h，1×104r/min，4℃离心10分钟，弃去沉淀，收集上清夜进行分离。
(备注：这一步骤已完成)1.3.2 色谱柱的准备（装柱）按标准方法将离子交换树脂装填于色谱柱内，用平衡缓冲液平衡。
1.3.3 α-淀粉酶的分离将一定量的样品溶液缓慢上入色谱柱内，先后用平衡缓冲液和洗脱缓冲液洗涤，每隔2分钟收集一次样品，每个样品检测280nm的吸光值，绘出色谱曲线。
将每个峰的样品集中起来，以备酶活和蛋白质含量的测定。
（备注：具体操作步骤及上样量以ppt课件为准）试验二、α-淀粉酶的活性测定及比活计算1.1 试剂及设备3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)葡萄糖标准液（10mg/ml）福林试剂淀粉溶液（10mg/ml）磷酸盐缓冲液（pH6.0，0.02M）722 型（或721 型）分光光度计4 000r/min 的离心机分析天平1.2 原理与方法1.2.1 Folin-酚试剂测定蛋白含量Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质- 铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5～100μg 蛋白质。
Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。
此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
1.2.2 淀粉酶活性测定淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。
淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。
淀粉酶主要包括α-55淀粉酶和β-淀粉酶两种。
α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。
β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。
淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应式如下：淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。
用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6 以下迅速钝化。
β-淀粉酶不耐热，在70℃15min 钝化。
根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。
本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。
在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。
1.3 试验部分1.3.1 Folin-酚试剂测定蛋白含量（按ppt课件为准，以下仅供参考）1.3.1.1 标准曲线的制作（1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g 结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL 容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250μg/mL 的牛血清白蛋白溶液。