分子印迹手性拆分详解
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以拆分手性药物酮洛芬为例：采用 4-乙烯基吡啶为功能单体,以二甲 基丙烯酸乙二醇酯为交联剂,引
发剂偶氮二异丁腈(AIBN).在模板
分子(S)-酮洛芬的存在下,制备出 (S)-酮洛芬的分子印迹聚合(MIPs), 并用匀浆法装柱 (250mm×4mm,i.d.).
然后使用V(乙酸)∶V(乙腈)=
1∶9 的溶液洗脱,至无模板分子, 用HPLC进行分析. 色谱条件:流动相为乙腈(含有一定 量乙酸);UV检测,波长258 nm;流
二、利用HPLC进行手性药物的分离(拆分)
多糖类 Pirkle 型 环糊精类 大环抗生素类 冠醚类 蛋白质类 配体交换类
经典型CSP
手性固定相法 直接法
分 离 方 法
新型CSP
手性流动相添加剂法
间接法 ：手性衍生化试剂法
分子印迹 CSP 环果聚糖类 CSP 杯芳烃类 CSP 浸透限制CSP 新型填充材料 CSP
速0.2 mL/min;进样体积10μL;操作
温度19～36℃ 。
（R)-和(S)-酮洛芬在印迹柱上的分离谱图
（S)-酮洛芬在印迹柱上的谱图
空白柱没有拆分能力,而制得的分子印迹聚 合物对酮洛芬的外消旋混合物显示出良好 的手性拆分能力,(S)-酮洛芬的容量因子为
9.52,选择性因子为1.52,分离度R为0.88。
像的对映异构体，是目前药物研究领域的热点之一。比如人体中的蛋白质、多糖、核 酸和酶等大都是手性的，绝大多数的药物由手性分子构成。虽然它们的理化性质相似 ，但在生物体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异。往往两种异构体中仅 有一种是有效的，另一种无效甚至有害。 2.举例——“反应停事件” 反应停是一种缓解妇女怀孕初期反应的镇痛剂，它的副作用曾经使欧洲2万多个胎儿发生 畸变(“海豹儿”), R型异构体是镇定剂，S型异构体致畸。
（二）大环抗生素类固定相
该方法将大环抗生素键合到硅胶上，并用来拆分外消旋体，此类手性固定相 通过多 作用点实现分离,可拆分羧酸、 氨基酸、 酰胺、酯类等手性药物。且具有选择性好， 色谱柱容量高， 稳定性好，可用于制备分离的特点。
例子：采用三种大环抗生素手性固定相拆分盐酸克伦普罗对映体。盐酸克 伦普罗它是一种β 2肾上腺受体激动剂，主要用于防治人畜支气管哮喘和痉 挛。
高效液相色谱在 手性药物中的应用
基本内容
+ 手性药物的定义 + 利用HPLC进行手性药物的分离(拆分) + 经典CSP实例 + 新型CSP实例 + 高效液相色谱手性流动相添加剂法分离手性药
物 + 高效液相色谱手性衍生化试剂法分离手性药物 + 手性药物分析方法的选择
一、手性药物
1.定义：手性药物是指药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜
例：反相 HPLC 法， 直接进样生物样品来评价新型限进 CSP—poly－CD－RAM， 结果显示， 样品中的蛋白质先被洗脱， 对检测无干扰，同时将其直接注入人血 浆和牛奶中其中进行HPLC分析可以得到的几种手性药物和农药均能够在 poly－ CD－RAM 上实现手性拆分。
五、高效液相色谱手性流动相添加剂法分离手性药物 1、定义：在流动相中添加手性选择剂， 制造手性环境使外消旋 体分离，即手性流动相添加剂(chiral mobile phase additive， CMPA)法。对映体和手性选择剂相互作用形成瞬态非对映体复合 物，两复合物稳定性及其在固定相和流动相之间分配行为的不同 使其在非手性色谱柱从而实现分离的目的。 2、优缺点；CMPA 法拆分对映体不需要柱前衍生化，常规色谱 柱即可分离，成本相对较低且更加灵活，针对不同样品可使用不 同手性添加剂，但是某些手性流动相添加剂不稳定，干扰检测结 果。 3、例Leabharlann Baidu以 β- 环糊精作为手性流动相添加剂，研究佐匹克隆对映体在反相高效
盐酸克伦普罗结构式 含有一个手性中心
四、新型CSP实例
（一）分子印迹CSP：分子印迹技术又称为分子烙印， 是一种制备在空间 结构和结合位点上与某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的技术。以手 性药物单个对映体为模板获得分子印迹聚合物，制备出分子印迹 CSP，可 用来拆分手性药物。合成印迹分子过程如下
这是由于分子印迹聚合物中的模板分子 (S)-酮洛芬被洗脱出去后留下了在立体结 构和功能基排布上与其互补的空穴,这样导 致了分子印迹聚合物与(S)-酮洛芬的亲和 力比(R)-酮洛芬大,从而使其得以分离。
（R)-和(S)-酮洛芬在空白柱(无印迹分子 下制备得到的柱子)上的分离谱图
（二）浸透限制CSP 1、定义： 限制进入固定相又叫浸透限制固定相， 简称限进固定相，这类固定 相的特征是表面具有亲水性，而内层是疏水性的。小分子物质可自由通过并与内 部疏水层相互作用， 而大分子物质则被限制， 不能和疏水层接触该类固定相的 分离机制主要是分子排阻、 疏水作用和离子交换作用将这一原理和 CSP 结合 制备出限进 CSP， 这类固定相能限制大分子(如蛋白质)而只允许适宜大小的分 析物(如手性药物)通过， 并和内表面上的手性选择剂相互作用实现手性拆分。 目前， 限进 CSP 逐渐应用于未经预处理而直接进样的手性生物样品分析中。
Molecular model suggesting different interactions between (R)-2,2,2trifluoro-1-(10-methyl-9anthryl)ethanol and (S)enantiomer (I) and (R)enantiomer (II) of methyl 2,4dinitrophenyl sulfoxide: (a) π-π interaction, (b) and (c) hydrogen bonding interaction
三、经典CSP实例 （一）Pirkle 型手性固定相：将单分子层的手性有机分子通过适宜的连接基
团键合到硅胶载体上。因而被称为“刷型”手性固定相，此类手性固定相化学结 构的特点是在手性中心附近至少含有下列一种官能团
（1）π-吸电子或π-给电子的芳香基团（在手性识别过程中发生π-π电荷相互作用） （2）能形成氢键的原子或基团 （3）能发生偶极相互作用的极性键或基团 （4）能提供立体排斥范德华相互作用和构型控制较大的非极性基团
发剂偶氮二异丁腈(AIBN).在模板
分子(S)-酮洛芬的存在下,制备出 (S)-酮洛芬的分子印迹聚合(MIPs), 并用匀浆法装柱 (250mm×4mm,i.d.).
然后使用V(乙酸)∶V(乙腈)=
1∶9 的溶液洗脱,至无模板分子, 用HPLC进行分析. 色谱条件:流动相为乙腈(含有一定 量乙酸);UV检测,波长258 nm;流
二、利用HPLC进行手性药物的分离(拆分)
多糖类 Pirkle 型 环糊精类 大环抗生素类 冠醚类 蛋白质类 配体交换类
经典型CSP
手性固定相法 直接法
分 离 方 法
新型CSP
手性流动相添加剂法
间接法 ：手性衍生化试剂法
分子印迹 CSP 环果聚糖类 CSP 杯芳烃类 CSP 浸透限制CSP 新型填充材料 CSP
速0.2 mL/min;进样体积10μL;操作
温度19～36℃ 。
（R)-和(S)-酮洛芬在印迹柱上的分离谱图
（S)-酮洛芬在印迹柱上的谱图
空白柱没有拆分能力,而制得的分子印迹聚 合物对酮洛芬的外消旋混合物显示出良好 的手性拆分能力,(S)-酮洛芬的容量因子为
9.52,选择性因子为1.52,分离度R为0.88。
像的对映异构体，是目前药物研究领域的热点之一。比如人体中的蛋白质、多糖、核 酸和酶等大都是手性的，绝大多数的药物由手性分子构成。虽然它们的理化性质相似 ，但在生物体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异。往往两种异构体中仅 有一种是有效的，另一种无效甚至有害。 2.举例——“反应停事件” 反应停是一种缓解妇女怀孕初期反应的镇痛剂，它的副作用曾经使欧洲2万多个胎儿发生 畸变(“海豹儿”), R型异构体是镇定剂，S型异构体致畸。
（二）大环抗生素类固定相
该方法将大环抗生素键合到硅胶上，并用来拆分外消旋体，此类手性固定相 通过多 作用点实现分离,可拆分羧酸、 氨基酸、 酰胺、酯类等手性药物。且具有选择性好， 色谱柱容量高， 稳定性好，可用于制备分离的特点。
例子：采用三种大环抗生素手性固定相拆分盐酸克伦普罗对映体。盐酸克 伦普罗它是一种β 2肾上腺受体激动剂，主要用于防治人畜支气管哮喘和痉 挛。
高效液相色谱在 手性药物中的应用
基本内容
+ 手性药物的定义 + 利用HPLC进行手性药物的分离(拆分) + 经典CSP实例 + 新型CSP实例 + 高效液相色谱手性流动相添加剂法分离手性药
物 + 高效液相色谱手性衍生化试剂法分离手性药物 + 手性药物分析方法的选择
一、手性药物
1.定义：手性药物是指药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜
例：反相 HPLC 法， 直接进样生物样品来评价新型限进 CSP—poly－CD－RAM， 结果显示， 样品中的蛋白质先被洗脱， 对检测无干扰，同时将其直接注入人血 浆和牛奶中其中进行HPLC分析可以得到的几种手性药物和农药均能够在 poly－ CD－RAM 上实现手性拆分。
五、高效液相色谱手性流动相添加剂法分离手性药物 1、定义：在流动相中添加手性选择剂， 制造手性环境使外消旋 体分离，即手性流动相添加剂(chiral mobile phase additive， CMPA)法。对映体和手性选择剂相互作用形成瞬态非对映体复合 物，两复合物稳定性及其在固定相和流动相之间分配行为的不同 使其在非手性色谱柱从而实现分离的目的。 2、优缺点；CMPA 法拆分对映体不需要柱前衍生化，常规色谱 柱即可分离，成本相对较低且更加灵活，针对不同样品可使用不 同手性添加剂，但是某些手性流动相添加剂不稳定，干扰检测结 果。 3、例Leabharlann Baidu以 β- 环糊精作为手性流动相添加剂，研究佐匹克隆对映体在反相高效
盐酸克伦普罗结构式 含有一个手性中心
四、新型CSP实例
（一）分子印迹CSP：分子印迹技术又称为分子烙印， 是一种制备在空间 结构和结合位点上与某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的技术。以手 性药物单个对映体为模板获得分子印迹聚合物，制备出分子印迹 CSP，可 用来拆分手性药物。合成印迹分子过程如下
这是由于分子印迹聚合物中的模板分子 (S)-酮洛芬被洗脱出去后留下了在立体结 构和功能基排布上与其互补的空穴,这样导 致了分子印迹聚合物与(S)-酮洛芬的亲和 力比(R)-酮洛芬大,从而使其得以分离。
（R)-和(S)-酮洛芬在空白柱(无印迹分子 下制备得到的柱子)上的分离谱图
（二）浸透限制CSP 1、定义： 限制进入固定相又叫浸透限制固定相， 简称限进固定相，这类固定 相的特征是表面具有亲水性，而内层是疏水性的。小分子物质可自由通过并与内 部疏水层相互作用， 而大分子物质则被限制， 不能和疏水层接触该类固定相的 分离机制主要是分子排阻、 疏水作用和离子交换作用将这一原理和 CSP 结合 制备出限进 CSP， 这类固定相能限制大分子(如蛋白质)而只允许适宜大小的分 析物(如手性药物)通过， 并和内表面上的手性选择剂相互作用实现手性拆分。 目前， 限进 CSP 逐渐应用于未经预处理而直接进样的手性生物样品分析中。
Molecular model suggesting different interactions between (R)-2,2,2trifluoro-1-(10-methyl-9anthryl)ethanol and (S)enantiomer (I) and (R)enantiomer (II) of methyl 2,4dinitrophenyl sulfoxide: (a) π-π interaction, (b) and (c) hydrogen bonding interaction
三、经典CSP实例 （一）Pirkle 型手性固定相：将单分子层的手性有机分子通过适宜的连接基
团键合到硅胶载体上。因而被称为“刷型”手性固定相，此类手性固定相化学结 构的特点是在手性中心附近至少含有下列一种官能团
（1）π-吸电子或π-给电子的芳香基团（在手性识别过程中发生π-π电荷相互作用） （2）能形成氢键的原子或基团 （3）能发生偶极相互作用的极性键或基团 （4）能提供立体排斥范德华相互作用和构型控制较大的非极性基团