清心开窍方含药脑脊液对Aβ25—35所致PC12细胞损伤的保护作用

清心开窍方含药脑脊液对Aβ25—35所致PC12细胞损伤的保护作用目的：从细胞水平研究清心开窍方含药脑脊液对β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）

损伤的PC12细胞的保护作用，为该方剂的临床应用提供依据。方法：SD大鼠灌胃给予清心开窍方水煎液（7.9 g·kg-1），每日2次，连续3.5 d，制备清心开窍方含药脑脊液。采用PC12细胞和终浓度10 μmol·L-1的β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）共培养，造成神经细胞损伤模型。RT-PCR方法检测Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA 表达水平，MTT法检测清心开窍方含药脑脊液对PC12细胞活性的影响。结果：清心开窍方含药脑脊液组PC12细胞活性明显高于模型组，Bax，Caspase-3 mRNA 表达水平降低，Bcl-2 mRNA表达增高，与模型组比较差异显著（P＜0.05，P＜0.01）。结论：清心开窍方对Aβ25-35损伤的PC12细胞有明显的保护作用。

标签：清心开窍方；PC12细胞；β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）；保护作用

清心开窍方源自明代著名医学家张景岳《景岳全书》中的“蛮煎”，由生地黄、麦冬、芍药、石菖蒲、石斛、牡丹皮、茯神、陈皮、知母等组成，具有清心凉血开窍功效。是用于治疗阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的有效方剂，已广泛运用于临床多年，且疗效显著，尤其对早期出现症状者效果更佳，临床治疗AD能明显改善患者的认知功能障碍、行为和精神症状等[1-2]。前期的实验研究证实该方水煎剂能明显改善AD小鼠学习记忆能力，降低AD小鼠脑组织中NO，NOS含量及AchE 活性，降低氧自由基对机体的损伤，对海马神经细胞具有保护作用[3-6]。本研究从细胞水平探讨清心开窍方含药脑脊液对β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）损伤所致神经细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物及细胞株SD大鼠60只，雄性，SPF级，体重（250±20）g，健康状况良好，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（湘）2009-0004。PC12细胞株购自中南大学细胞生物学实验中心。

1.2 药材与试剂清心开窍方（生地黄6 g、麦冬6 g、白芍6 g、石斛6 g、丹皮6 g、茯神6 g、苦参6 g、陈皮4 g、知母5 g、石菖蒲6 g）由湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供。β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）由北京博奥森生物技术有限公司生产。尼莫地平由山东新华制药有限公司生产，批号20100711。

1.3 仪器酶标仪（美国Thermo公司）；DNA热循环扩增仪（美国Thermo 公司）；凝胶扫描成像分析系统（美国Startganee公司）。

1.4 含药脑脊液的制备SD大鼠20只，雄性。给药组10只，灌胃给予清心开窍方水煎液（7.9 g·kg-1），每日早晚2次，连续3.5 d。正常对照组给予同体积（10 mL·kg-1）生理盐水。第7次给药后1 h ，以水合氯醛（350 mg·kg-1）麻醉大鼠，颈后部备皮，75%乙醇消毒，将大鼠颈部弯曲以暴露枕骨大孔，用1 mL 无菌注射器，从枕骨大孔刺入延髓池，取50 μL脑脊液后迅速抽出针头，合并脑脊液，4 ℃条件3 000 r·min-1离心10 min，收集上清，过滤，-20 ℃冻存备用。

1.5 PC12细胞培养与分组将复苏后的PC12细胞接种于75 mL培养瓶，用含15%，53 ℃灭活胎牛血清的高糖DMEM培养基，37 ℃，饱和湿度，5% CO2的培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，加入0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞为0.5×106个/mL，接种于涂有多聚赖氨酸的96孔培养板，置于37 ℃，5% CO2下继续培养24 h，细胞进入对数生长期后开始加药。取长满单层PC12细胞的96孔培养板，弃去培养液，用D-Hank′s液洗涤2次，加入无血清DMEM，细胞分

为正常组（无血清的DWEM）、模型组、尼莫地平组（1×107 mol·L-1）、10%正常脑脊液组、10%含药脑脊液组、20%正常脑脊液组、20%含药脑脊液组，每组4孔。除正常组外，其余各组每孔加入终浓度10 μmol·L-1的Aβ25-35造模，37 ℃，5% CO2培养箱继续孵育24 h，然后分别给药。37 ℃，5% CO2培养箱作用4 h 后，弃去培养液，用D-Hank′s液洗涤2次，加入无血清DMEM培养24 h，在造模过程中及造模后，各给药组均加入相应浓度的药物及脑脊液。四甲基偶氮唑盐（MTT）检测PC12细胞细胞活力，PC12细胞的保护率=（A含药脑脊液组-A 空白脑脊液组）/（A正常组-A模型组）×100%。

1.6 RT-PCR检测方法组织中总RNA的提取：取50 mg左右冻存组织标本至匀浆器中加l mL Triozl快速研磨。将匀浆液转移到无菌、RNasse-free的1.5 mL 离心管中，用吸头反复吹打，振荡后室温静置5 min。加入200 μL氯仿，振荡混匀15 s，室温静置3 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min。将上清小心转移到无菌、RNasse-free的1.5 mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇（-20 ℃预冷），混匀，冰浴10 min。4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min。弃上清，吸水纸控干液体，加入75%冰乙醇（DEPC水配制）l mL，混匀。4 ℃，8 000 r·min-1离心5 min，弃上清，吸水纸控干。重复1次。控干后，斜放室温晾20 min，加入20～30 μL DEPC水，所得溶液即为RNA样品，可立即使用或置-80 ℃冰箱保存。RNA纯度鉴定：取5 μL RNA溶液，加DEPC水稀释至60 μL，以DEPC水作为空白对照，读取紫外分光光度计260，280 nm波长的吸光度，计算其A260/A280。

RNA浓度测定：取5 μL RNA溶液，加DEPC水稀释至60 μL，枪头混匀，以DEPC水作为空白对照，读取紫外分光光度计260 nm波长下的吸光度。按公式计算RNA浓度（g·L-1）=A260 ×40×60/5/1 000。

RNA完整性鉴定：应用1%甲醛变性的琼脂糖电泳鉴定RNA完整性。

一步法RT-PCR扩增：参照一步法RT-PCR试剂盒说明进行操作。Bax（扩增片段376 bp）：上游5′-TGGTTGCCCTTTTCTACTTTG -3′，下游5′-GAAGTAGGAAAGGAGGCCATC -3′；Bcl-2（扩增片段236 bp）：上游5′-GCATCTTCTCCTTCCAG-3′，下游5′-ATCCCAGCCTCCGTTAT-3′；Caspase-3（扩增片段420 bp）：上游5′-GGTATTGAGACAGACAGTGG -3′，下游5′- CATGGGATCTGTTTCTTTGC-3′；内参β-actin（扩增片断512 bp）：上游5′-GCCAACCGTGAAAAGATG-3′，下游5′- CCAGGATAGAGCCACCAAT-3′。

RT-PCR产物的检测及半定量分析：取6 μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，恒压80 V，电泳1 h，紫外灯下分析PCR结果，并用凝胶成像分析系统测定灰度值，计算Bcl-2（Bax，Caspase-3）/β-actin的比值，以获得目的片段的相对表达量。

1.7 统计学处理方法采用SPSS 16.0统计软件处理，实验数据以±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间方差分析用F检验，有差异的组间两两比较用SNK-q检验。

2 结果

2.1 清心开窍方对PC12细胞活力的影响PC12细胞模型组与正常组相比，A明显降低（P＜0.01）；10%正常脑脊液组和20%正常脑脊液组与模型组相比，A无显著性差异；尼莫地平组、10%含药脑脊液组和20%含药脑脊液组与模型组相比，A均明显升高（P＜0.01）；10%含药脑脊液组A低于尼莫地平组（P＜0.01），而20%含药脑脊液组A高于尼莫地平组（P＜0.05），见表1。

2.2 清心开窍方对PC12细胞Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA表达的影响PC12