清心开窍方含药脑脊液对Aβ25—35所致PC12细胞损伤的保护作用

清心开窍方含药脑脊液对Aβ25—35所致PC12细胞损伤的保护作用目的：从细胞水平研究清心开窍方含药脑脊液对β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）损伤的PC12细胞的保护作用，为该方剂的临床应用提供依据。

方法：SD大鼠灌胃给予清心开窍方水煎液（7.9 g·kg-1），每日2次，连续3.5 d，制备清心开窍方含药脑脊液。

采用PC12细胞和终浓度10 μmol·L-1的β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）共培养，造成神经细胞损伤模型。

RT-PCR方法检测Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA 表达水平，MTT法检测清心开窍方含药脑脊液对PC12细胞活性的影响。

结果：清心开窍方含药脑脊液组PC12细胞活性明显高于模型组，Bax，Caspase-3 mRNA 表达水平降低，Bcl-2 mRNA表达增高，与模型组比较差异显著（P＜0.05，P＜0.01）。

结论：清心开窍方对Aβ25-35损伤的PC12细胞有明显的保护作用。

标签：清心开窍方；PC12细胞；β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）；保护作用清心开窍方源自明代著名医学家张景岳《景岳全书》中的“蛮煎”，由生地黄、麦冬、芍药、石菖蒲、石斛、牡丹皮、茯神、陈皮、知母等组成，具有清心凉血开窍功效。

是用于治疗阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的有效方剂，已广泛运用于临床多年，且疗效显著，尤其对早期出现症状者效果更佳，临床治疗AD能明显改善患者的认知功能障碍、行为和精神症状等[1-2]。

前期的实验研究证实该方水煎剂能明显改善AD小鼠学习记忆能力，降低AD小鼠脑组织中NO，NOS含量及AchE 活性，降低氧自由基对机体的损伤，对海马神经细胞具有保护作用[3-6]。

本研究从细胞水平探讨清心开窍方含药脑脊液对β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）损伤所致神经细胞的保护作用。

1 材料与方法1.1 动物及细胞株SD大鼠60只，雄性，SPF级，体重（250±20）g，健康状况良好，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（湘）2009-0004。

PC12细胞株购自中南大学细胞生物学实验中心。

1.2 药材与试剂清心开窍方（生地黄6 g、麦冬6 g、白芍6 g、石斛6 g、丹皮6 g、茯神6 g、苦参6 g、陈皮4 g、知母5 g、石菖蒲6 g）由湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供。

β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）由北京博奥森生物技术有限公司生产。

尼莫地平由山东新华制药有限公司生产，批号20100711。

1.3 仪器酶标仪（美国Thermo公司）；DNA热循环扩增仪（美国Thermo 公司）；凝胶扫描成像分析系统（美国Startganee公司）。

1.4 含药脑脊液的制备SD大鼠20只，雄性。

给药组10只，灌胃给予清心开窍方水煎液（7.9 g·kg-1），每日早晚2次，连续3.5 d。

正常对照组给予同体积（10 mL·kg-1）生理盐水。

第7次给药后1 h ，以水合氯醛（350 mg·kg-1）麻醉大鼠，颈后部备皮，75%乙醇消毒，将大鼠颈部弯曲以暴露枕骨大孔，用1 mL 无菌注射器，从枕骨大孔刺入延髓池，取50 μL脑脊液后迅速抽出针头，合并脑脊液，4 ℃条件3 000 r·min-1离心10 min，收集上清，过滤，-20 ℃冻存备用。

1.5 PC12细胞培养与分组将复苏后的PC12细胞接种于75 mL培养瓶，用含15%，53 ℃灭活胎牛血清的高糖DMEM培养基，37 ℃，饱和湿度，5% CO2的培养箱中培养。

细胞呈单层贴壁生长，加入0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞为0.5×106个/mL，接种于涂有多聚赖氨酸的96孔培养板，置于37 ℃，5% CO2下继续培养24 h，细胞进入对数生长期后开始加药。

取长满单层PC12细胞的96孔培养板，弃去培养液，用D-Hank′s液洗涤2次，加入无血清DMEM，细胞分为正常组（无血清的DWEM）、模型组、尼莫地平组（1×107 mol·L-1）、10%正常脑脊液组、10%含药脑脊液组、20%正常脑脊液组、20%含药脑脊液组，每组4孔。

除正常组外，其余各组每孔加入终浓度10 μmol·L-1的Aβ25-35造模，37 ℃，5% CO2培养箱继续孵育24 h，然后分别给药。

37 ℃，5% CO2培养箱作用4 h 后，弃去培养液，用D-Hank′s液洗涤2次，加入无血清DMEM培养24 h，在造模过程中及造模后，各给药组均加入相应浓度的药物及脑脊液。

四甲基偶氮唑盐（MTT）检测PC12细胞细胞活力，PC12细胞的保护率=（A含药脑脊液组-A 空白脑脊液组）/（A正常组-A模型组）×100%。

1.6 RT-PCR检测方法组织中总RNA的提取：取50 mg左右冻存组织标本至匀浆器中加l mL Triozl快速研磨。

将匀浆液转移到无菌、RNasse-free的1.5 mL 离心管中，用吸头反复吹打，振荡后室温静置5 min。

加入200 μL氯仿，振荡混匀15 s，室温静置3 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min。

将上清小心转移到无菌、RNasse-free的1.5 mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇（-20 ℃预冷），混匀，冰浴10 min。

4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min。

弃上清，吸水纸控干液体，加入75%冰乙醇（DEPC水配制）l mL，混匀。

4 ℃，8 000 r·min-1离心5 min，弃上清，吸水纸控干。

重复1次。

控干后，斜放室温晾20 min，加入20～30 μL DEPC水，所得溶液即为RNA样品，可立即使用或置-80 ℃冰箱保存。

RNA纯度鉴定：取5 μL RNA溶液，加DEPC水稀释至60 μL，以DEPC水作为空白对照，读取紫外分光光度计260，280 nm波长的吸光度，计算其A260/A280。

RNA浓度测定：取5 μL RNA溶液，加DEPC水稀释至60 μL，枪头混匀，以DEPC水作为空白对照，读取紫外分光光度计260 nm波长下的吸光度。

按公式计算RNA浓度（g·L-1）=A260 ×40×60/5/1 000。

RNA完整性鉴定：应用1%甲醛变性的琼脂糖电泳鉴定RNA完整性。

一步法RT-PCR扩增：参照一步法RT-PCR试剂盒说明进行操作。

Bax（扩增片段376 bp）：上游5′-TGGTTGCCCTTTTCTACTTTG -3′，下游5′-GAAGTAGGAAAGGAGGCCATC -3′；Bcl-2（扩增片段236 bp）：上游5′-GCATCTTCTCCTTCCAG-3′，下游5′-ATCCCAGCCTCCGTTAT-3′；Caspase-3（扩增片段420 bp）：上游5′-GGTATTGAGACAGACAGTGG -3′，下游5′- CATGGGATCTGTTTCTTTGC-3′；内参β-actin（扩增片断512 bp）：上游5′-GCCAACCGTGAAAAGATG-3′，下游5′- CCAGGATAGAGCCACCAAT-3′。

RT-PCR产物的检测及半定量分析：取6 μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，恒压80 V，电泳1 h，紫外灯下分析PCR结果，并用凝胶成像分析系统测定灰度值，计算Bcl-2（Bax，Caspase-3）/β-actin的比值，以获得目的片段的相对表达量。

1.7 统计学处理方法采用SPSS 16.0统计软件处理，实验数据以±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间方差分析用F检验，有差异的组间两两比较用SNK-q检验。

2 结果2.1 清心开窍方对PC12细胞活力的影响PC12细胞模型组与正常组相比，A明显降低（P＜0.01）；10%正常脑脊液组和20%正常脑脊液组与模型组相比，A无显著性差异；尼莫地平组、10%含药脑脊液组和20%含药脑脊液组与模型组相比，A均明显升高（P＜0.01）；10%含药脑脊液组A低于尼莫地平组（P＜0.01），而20%含药脑脊液组A高于尼莫地平组（P＜0.05），见表1。

2.2 清心开窍方对PC12细胞Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA表达的影响PC12细胞模型组与正常组相比，Bax，Caspase-3 mRNA表达明显升高，Bcl-2 mRNA 表达明显降低（P＜0.01）；10%正常脑脊液组和20%正常脑脊液组与模型组相比，Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA表达无显著性差异；尼莫地平组、10%含药脑脊液组和20%含药脑脊液组与模型组相比，Bax，Caspase-3 mRNA表达均明显降低，Bcl-2 mRNA表达均明显升高（P＜0.01）；10%含药脑脊液组Bax mRNA表达高于尼莫地平组（P＜0.05），20%含药脑脊液组Bax mRNA表达、10%含药脑脊液组Caspase-3 mRNA表达与尼莫地平组相比无显著性差异；10%含药脑脊液组和20%含药脑脊液组Bcl-2 mRNA表达、20%含药脑脊液组Caspase-3 mRNA 表达均低于尼莫地平组（P＜0.01），见表2，图1。

3 讨论阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是老年人的常见病、多发病。

其首要症状是智力、记忆力、感官定向力、判断力、语言思维能力不可逆的进行性退化，并常伴有性格改变。

由于AD主要病理特征是老年斑（senile plaque，SP），神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT），神经元大量丢失。

而SP的核心成分为β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ），由39～43个氨基酸组成，因此，目前普遍认为聚集状的Aβ具有神经毒性，越来越多的证据证明Aβ在脑内沉积是AD早期的主要病理变化[7]。

PC12 细胞（pheochromocytoma cells）为大鼠肾上腺嗜铬肿瘤细胞株，具有较典型的神经内分泌细胞特性，可传代，己广泛用作神经细胞体外模型。

MTT 测试通过测定细胞线粒体脱氢酶活性借以判断活细胞数目，即A。

A越大，表示存活的细胞数目越多，细胞损伤越小。

大量证据表明凋亡参与了AD神经元的变性，它是由多基因控制的细胞主动死亡的过程，受促凋亡基因和抑凋亡基因的协同控制。

目前已知有多种基因，如Bcl-2，Bax，P53，fas等[8]，特别是Bax和Bcl-2基因与凋亡的调控关系更为密切[9-10]，Bcl-2和Bax作为一对关系密切的凋亡相关基因，在中枢神经系统中均有表达，在神经细胞凋亡的控制中起重要作用。