代谢组学开展实验方案讲课讲稿

培养基与菌体分离
关键： 菌体的形态、发酵液的粘稠度 方法：离心【1】
过滤清洗【2】
终止反应（淬灭）
培养基与菌体分离 胞内代谢物提取 胞内代谢物监测
数据分析 代谢组学解释
淬灭液
双蒸水
淬灭液
PBS或生理盐 水或蒸馏水
重复三次
菌体沉淀
废液缸
0.22μ m
0.8μm
0.45μ m
1.0μm
失败原因：①丝状菌体，相互交联，堵塞孔径。
代谢组学实验方案
实验方案和实验细节 代谢组学实验基本思路 终止反应（淬灭） 培养基与菌体分离 胞内代谢物提取 胞内代谢物监测 数据分析 代谢组学解释
核心问题 如何终止 如何分离 如何提取 如何监测 如何分析 如何解释
关键因素
关键因素：酶活、温度、溶剂、时间 方法：60%甲醇、50%甘油水溶液； 5min，1h…..
培养基与菌体分离
胞内代谢物提取
胞内代谢物监测
数据分析 代谢组学解释
气质联用
要求：沸点≤350℃，分子量＜1000，能完全气化，气化后对色谱柱和仪器无损伤（比如Ar、二氧化碳、
关键：菌体形态；发酵液粘稠度 方法：离心，过滤
关键：细胞壁 方法：超声破碎、研磨、反复冷冻
关键：是否具有挥发性；论文目的 方法：GC-MS；LC-MS；或者两者联用
关键：数据是否具有同步性？系统误 差小 方法：Matlab、NIST library、Golm metabolome database、AMDIS 关键：解释FK506高产原因 方法：与FK506的合成相关联（前体？ 分支代谢？能量？）
代谢组学解释
20mL
5min
甘油：水=3:2
方案一 【1】
20mL
5min
甘油：生理盐水水=3:2
方案二 【2】
20mL
5min
甲醇：水=3:2（可变动）
方案二 【3】
【1】Villas-Bôas, S.G. and P. Bruheim, Cold glycerol–saline: The promising quenching solution for accurate intracellular metabolite analysis of microbial cells. Analytical Biochemistry, 2007. 370(1): p. 87-97. 【2】Smart, K.F., et al., Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nat. Protocols, 2010. 5(10):
如果清洗不干净，会混入提取液中，严重影响实验结果
3.生理盐水中的NaCl和PBS中的钠盐、钾盐会干扰实验结果。 整个过程必须带手套，枪头不能接触其他物质。
4.FK506发酵液的处理 ①转速为2700rpm，4min ②采用去离子水洗涤菌体
③将培养基中的酵母粉（不溶物）改为酵母提取物（可溶）
【1】Smart, K.F., et al., Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nat. Protocols, 2010. 5(10): p. 1709-1729. 【2】Ding, M.-Z., X. Zhou, and Y.-J. Yuan, Metabolome profiling reveals adaptive evolution of <i>Saccharomyces <i>cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics, 2010. 6(1): p. 42-55.
三轮冷冻与解冻
液氮-196℃中冷冻 5min，冰上0℃解冻 15min
真菌
厚25nm，占细胞干重的 25%。分为三层：葡聚糖、 甘露聚糖和蛋白质
液氮
研磨
反复冷冻
超声破碎
称量
菌体研磨
胞内代谢物监测
终止反应（淬灭）
-气质联用
关键因素：
①分子量＜1000 ②沸点＜350℃ ③或者通过衍生化，能够具有挥发 性（300℃成气态）
终止反应（淬灭）
终止反应（淬灭） 培养基与菌体分离
关键：终止酶活
方法：胞内温度≤-10℃ 溶液温度：根据细胞壁的厚度而定 策略：用甲醇或者甘油降低水的凝固点 公式：ΔTf = Tf* – Tf = Kf*m（m为溶液的质量摩尔浓度，Kf 为凝固点下降常数）
胞内代谢物提取
5mL
5mL
5mL
胞内代谢物监测 数据分析
②淀粉、葡萄糖、和糊精灭菌后，本身就是一 种“浆糊”，严重堵塞孔径
1.转速和时间 时间一般为4min~5min，转速的大小根据具体的菌体而定：
离心结束后，菌体刚好贴在管壁，不结团，加入PBS或蒸馏 水后，轻微震荡即可重新悬浮。
2.天然复合培养基面临的难题 天然复合培养基（主要为蛋白胨、酵母粉）成分复杂，
胞内代谢物提取 关键因素：细胞壁
终止反应（淬灭）
培养基与菌体分离 胞内代谢物提取 胞内代谢物监测
数据分析 代谢组学解释
G+菌Baidu Nhomakorabea
单层，（20~80nm），组 分简单。90%的肽聚糖 （含量高，交联度大）， 10%的胞壁酸。
方法：
G-菌
多层，（10-15nm），组 分复杂。内壁层还有较
少的肽聚糖（含量低， 交联度疏松，2-7nm）， 外膜层为脂多糖、磷脂 和脂蛋白，约8nm
p. 1709-1729. 【3】Bölling, C. and O. Fiehn, Metabolite Profiling of Chlamydomonas reinhardtii under Nutrient Deprivation. Plant Physiology, 2005. 139(4): p. 1995-2005.