分子生物学： 翻译-精简版

了所有密码，取得了重大的突破。
三联密码的证实 （4） ——三联体结合实验
1964年Nirenberg又采用三联体结合实验，这
个方法的思路是建立在两项基础上的：
(1) tRNA和氨基酸及三联体的结合是特异的；
(2) 上述结合的复合体大分子是不能通过硝酸纤维 滤膜的微孔，而tRNA-氨基酸的复合体是可以 通过的。
我们把这种突变的tRNA称为抑制子tRNA。
在tRNA抑制系统中，最初的突变改变了mRNA上的密码子，使产
生的蛋白质不再有功能。随后，抑制突变改变了tRNA上的反密码 子，使它能够识别突变的密码子而不是 ( 或也能 )识别它最初的靶 密码子。这时插入的氨基酸又恢复了蛋白的功能。依据最初突变 的性质，把这种抑制子称为无义抑制子(nonsense suppressor)或 是错义抑制子(missense suppressor) 。
三叶草型的二维结构
④ 反密码子臂(anticodon arm)常 由5bp的茎区和7Nt的环区组成， 它负责对密码子的识别与配对。 ⑤ D 环 (D arm) 的茎区长度常为 4bp ，也称双氢尿嘧啶环。负 责和氨基酰tRNA聚合酶结合; ⑥ 额外环 (extra arm) 可变性大， 从4 Nt到21 Nt不等，其功能是 在 tRNA 的 L 型三维结构中负责 连接两个区域（ D 环－反密码 子环和TψC-受体臂）。
体条件下 GUG 的起始翻译的效率要比 AUG 低得多，可能因为它和 甲酰甲硫氨酸-tRNA的亲和力较低，这也可以作为调控该基因表达 的一种手段。
（二）遗传密码的特点
1. 遗传密码是三联体密码。 2. 遗传密码无逗号。 3. 遗传密码是不重迭的。 4. 遗传密码具有通用性。 5. 遗传密码具有简并性(degeneracy (synonyms)。
实验中。合成能从任何碱基起始。
但在体内却并非如此，而是需要一个起始密码子(initiator codons)。
将各种蛋白质的氨基酸顺序和其编码顺序相比较，起始时都是AUG 密码子，读码也都相同，在原核细胞中它编码甲酰甲硫氨酸，在真 核细胞中编码未经修饰的甲硫氨酸。
当正常的 AUG 起始密码子缺失时， GUG 也为起始密码子。但在离
1961年Nirenberg在多核苷酸
磷酸化酶发现的基础上建立 了无细胞系统。

具体方法是:
(1) 去模板：用DNAase处理E.coli抽提物，使DNA降解， 除去原有的细菌模板。
(2) 加入pol U：合成了多聚苯丙氨酸，

这一结果不仅证实了无细胞系统的成功 ，同时还表明 UUU是苯丙氨酸的密码子。 分别加入 polyA，polyC 和polyG 结果相应地获得了多聚 赖氨酸，多聚脯氨酸和多聚甘氨酸。 由于当时还未分离RNA pol酶，无法按设计的模板来合成 RNA ， Nirenberg 又想出了一种新的方法，就是按一定的 碱基比例来合成RNA。
点有很高的亲和性，因此结合较快，解离较慢。随着tRNA的结合， 此酶就要“审查”这个被结合的 tRNA 。若是正确的 tRNA ，那么 通过酶构象的改变使结合更为稳定。接着迅速的发生氨基酰化。 若是错的tRNA，构象不会发生改变，结果反应过程变得很慢，这 样增加tRNA在负载前从酶中解离出来的机会。这种控制的类型称 为动力学校对（kinetic proofreading）。
无义抑制
错义抑制
（四）氨基酰-tRNA的形成
氨基酸进入蛋白质合成途径是通过氨基酰 -tRNA合成酶，这种酶
将氨基酸和特异的tRNA连接起来。通过构象、反应动力学及化学 等不同途径分别对tRNA和氨基酸进行鉴别校对。
氨基酰-tRNA合成酶将tRNA和氨基酸分成相应的组，每种合成酶
都能识别单一的氨基酸和所有能携带它的tRNA，然后将相应的氨 基酸和tRNA装配起来。
码子。
根据无义突变的三种昵称，三个终止密码子：
UAA叫赭石（ochre）密码子（相应于赭石突变）； UAG叫琥珀
(amber) 密码子（相应于琥珀突变）；
UGA 叫蛋白石（ opal ）Байду номын сангаас码子（相应于蛋白石突变）
或乳白密码子。
起始密码子的确定
在Nirenberg的三联体结合实验和Khorana的重复共聚物的体外翻译
在这篇文章中Crick对遗传密码提出了4个特点：
① 3个碱基一组，编码一个氨基酸
② 密码是不重叠的；
③ 碱基的顺序从固定起点解读 ,即mRNA具有固定的 阅读框； ④ 密码子是简并（degeneracy）的,即某个特定的氨 基酸可以由几个密码子来编码。
三联密码的证实 （2） —— 利用突变来解读密码
的位点和类型。
他们一共获得了约200个突变株，经反复比较分析结果破
释了少数几个密码子，但他们直接地证实了密码子是不 重叠的。若当时可以测序的话，用这一方法是可以破译 所有的密码子。
三联密码的证实 （3） ——无细胞系统的建立
1955 S. Ocha在细菌中分离
了 多 核 苷 酸 磷 酸 化 酶 （ polynucleotide phosphorylase ） , 它催化核糖核苷二磷酸的聚 合，它不需要任何 DNA 模板 就可合成.
•Khorana就用这种方法将所有的遗传密码都破译了。 •这项实验还同时证实了： •三联密码的正确性， •以及兼并的存在。
各种氨基酸密码子的数目和氨基酸在蛋白质中出现的频率不成正比
终止密码子的确定
1964年Yanofsky在研究E.coli色氨酸合成酶A蛋白
时推测无义密码子(nonsense codons)（即终止密 码子）的存在。
的排列组合;
3 个碱基编码一种氨基酸，经排列组合可产生 43=64 种不同
形式
若是四联密码，就会产生44=256种排列组合
三联密码的证实 （1）
1961 年 Crick 和 Brenner.S 等证实了三联密码的真实性。 他们用T4染色体上的一个基因（rⅡ位点）通过用原黄
素（ proflavin ）处理，可以使 DNA 脱落或插入单个碱 基，插入叫“加字”突变，脱落叫“减字”突变.无论 加字和减字都可以引起移码突变。
三联密码的证实 （5） ——利用重复共聚物
Khorara 采用了有机合成一条短的单链 DNA 重复顺序，
然后用DNA pol I合成其互补链，再用RNA pol及不同 的 底 物 合 成 两 条 重 复 的 RNA 共 聚 物 ， 作 为 翻 译 的 mRNA ，加入到体外表达系统中。
三联密码的证实 （5） ——利用重复共聚物
I（次黄嘌呤）
A、U或C
有义密码子 (sense codons) 虽有 61 个，但反密码子由于
的摆动可能少于61个。
原核和真核细胞都只有约30种反密码子
三中读二一般可分为三种情况：
1. 第１ , ２两个碱基形成６个氢键时，可三中读二。 如ＣＣＸ，ＣＧＸ，ＧＣＸ和ＧＧＸ。 2. 第1 ,2两个碱基形成4个氢键时,不可三中读二。 如AAX，ＡＵＸ，ＵＡX 和ＵＵＸ。 3. 第１，２两个碱基形成５个氢键时,

当第二个碱基为嘧啶时，可三中读二；
如ＵＣＸ，ＡＣＸ，ＣＵＸ和ＧＵＸ。 当第二个碱基为嘌呤时则不能三中读二， 如ＣＡＸ， ＧＡＸ，ＵＧＸ和ＡＧX。
（三） tRNA的结构和功能
（一）三叶草型的二维结构 ①tRNA 的长度范围一般为 74~95 个碱基， 其中22个碱基是恒定的。 ②5’ 端和 3’ 端配对（常为 7bp ）形成茎区， 称为受体臂（ acceptor arm ）或称氨基 酸臂 。在3’端永远是4个碱基（XCCA） 的单链区，在其末端有 2’-OH 或 3’-OH ， 是被氨基酰化位点。此臂负责携带特异 的氨基酸。 ③ TψC 常由 5bp 的茎和 7Nt 和环组成。此 臂负责和核糖体上的rRNA识别结合；
1.氨基酸受体臂位于 L 型的一 侧，距反密码子环约70 Ǻ 2.D 环和 TψC 环形成“ L” 的转 角
抑制子tRNA
在分析 tRNA 与 mRNA 上密码子的作用能力和检测 tRNA 分子上不
同部位对密码子－反密码子的识别作用时，经常会用到分离突变 的tRNA的方法。
有些tRNA的突变体能抑制蛋白质编码基因中的突变所造成的影响，

UUU：UGG＝（555）:（511）＝ 25 :1
同理UUU：UUG ＝5:1，
根据检测结果推测:


苯丙氨酸（UUU）：半胱氨酸（UGU）＝5:1
苯丙氨酸（UUU）：缬氨酸（GUU）＝5:1 苯丙氨酸（UUU）：甘氨酸（GGU）＝25:1
苯丙氨酸的密码子是已知的，由3个U组成那么:


(3) 按比例加入２种核苷混合的多聚物
比如在底物中加5份的UDP和1份的GDP，碱基比为U：G＝5：1，
它们能组成8种三联体：
UUU，UUG，UGU，GUU，
GGG，GGU，GUG，UGG。
U和G将随机地加入到三联体中，这样按比例各个位子上进入 U和G
的概率不同，如氨基酸测定结果：
用二个或三个、四个核苷酸构造重复共聚体来确定密码子 重复顺序 (UC)n (UUC)n (UUAC)n 可组成的三联密码 UCU-CUC (UUC); (UCU); (CUU) (UUA-CUU-ACU-UAC) 多肽的氨基酸组成 Ser-Leu poly Phe, poly Ser, poly Leu Leu-Leu-Thr-Tye
1960 ， A. Tsugita ， H. Fraenkel-Connrat 小 组 和 H.G.
Wittmann小组试图通过用亚硝酸来对TMV进行诱变。
当时根据亚硝酸诱变的原理，mRNA中的A→G或C→U。 当时已搞清了TMV肽链的一级结构由159个氨基酸组成 将突变型和野生型进行比较就能确定肽链上氨基酸取代
第四章 生物信息的传递（下） ——从RNA到蛋白质
RNA 复制 复制
DNA
转录 逆转录
RNA
翻译
蛋白质
一、遗传密码和翻译系统
（一） 遗传密码的破译 1954年G.Gamov对破译密码首先提出了设想
若一种碱基对应与一种氨基酸，那么只可能产生4种氨基酸;
若2个碱基编码一种氨基酸的话，4种碱基共有42=16种不同
1965 年 Weigert,M. 和 Garen,A 由碱性磷酸酶基因
中色氨酸位点的氨基酸的置换证明E.coli中无义密
码子的碱基组成揭示了琥珀和赭石（ochre）突变
基因分别是终止密码子UAG和UAA。
终止密码子的确定
1967 年 Brenner 和 Crick 证明 UGA 是第三个无义密
Crick 小组用这种方法获得一系列的 T4“ 加字”和“减
字”突变，再进行杂交来获得加入或减少一个，二个， 三个的不同碱基数的系列突变。
通过这样的方法他们发现加入或减少一个和二个
碱基都会引起移码突变，而加入或减少 3 个碱基 时反而可以恢复正确的读框，表明每个密码子的 确是由3个碱基组成的。
携 带 同 种 氨 基 酸 的 不 同 tRNA 称 为 同 工 tRNA (isoaccepting
tRNA）。因为它们被同一个合成酶识别，所以也称为同族tRNA （cognate tRNA）。
氨基酰-tRNA的形成
氨基酰-tRNA合成酶
氨酰tRNA合成酶的校读功能
tRNA 和合成酶的结合通过两步反应来进行，相关 tRNA 对结合位
6. 密码子有起始密码子和终止密码子。
7. 反密码子中的“摆动”（wobble）
摆 动 假 说 (wobble
遗传密码中的摆动 反密码子5′端 G C A U 密码子3′端可 配对碱基 U 或C G U A 或G
hypothesis) 是 由 Crick.F （ 1966 年 ）提 出的 。 即 当 tRNA 的 反 密 码 子 与 mRNA的密码子配对时前 两对严格遵守碱基互补配 对法则，但第三对碱基有 一定的自由度可以“摆 动”。摆动假说也称为三 中 读 二 （ 2 out of 3 reading）

半胱氨酸一定是由2个U，1个G组成； 缬氨酸同样如此； 甘氨酸应是由一个U两个G组成。
Ochoa,S. 及其合作者也采用该方法，两组展开了激烈
的竞争，经过两个组一年多的努力，结果搞清了各种 氨基酸的碱基组成。但是并不知其顺序。
Nirenberg于1964年又采用三联体结合实验，一举破译