碱性磷酸酶染色(NAP)
人中性粒细胞碱性磷酸酶NAP酶联免疫分析ELISA
人中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)水平。
用纯化的人中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)，再与HRP标记的中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)浓度。
试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
中性粒细胞碱性磷酸酶
中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）碱性磷酸酶主要存在于成熟阶段的中性粒细胞，其他细胞均呈阴性反应。
阳性反应为在胞质中出现灰色到棕黑色颗粒，反应强度分为5级，即-、+、2+、3+、4+。
反应结果以阳性反应细胞的百分率和积分值来表示。
血涂片经染色反应后，在油镜下，连续观察100个成熟中性粒细胞，记录其阳性反应细胞所占的百分率即为阳性率；并对所有阳性反应细胞逐个按其反应强度作出+~4+的分级，将各级所占的百分率乘以级数，然后想加，即为积分值。
参考值：阳性率10-40%，积分值40-80。
意义：（1）急性化脓性感染时NAP活性明显升高，病毒性感染时其活性在正常范围或略低。
因此，NAP可用于细菌和病毒感染的鉴别；（2）慢性粒细胞白血病的NAP活性明显降低，积分值常为0。
类白血病反应的NAP活性极度增高，故可作为与慢性粒细胞白血病鉴别的重要指标。
（3）急性粒细胞白血病时NAP积分值减低；急性淋巴细胞白血病的NAP多增高；急性单核细胞白血病时一般正常或减低。
故可作为急性白血病的鉴别方法之一。
（4）再生障碍性贫血时NAP活性增高；阵发性睡眠性血红蛋白尿时活性减低，可作为两者的鉴别。
（5）其他情况：如应用肾上腺皮质激素时NAP升高；恶性组织细胞病时NAP活性降低。
中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）是中性粒细胞的标志酶，主要存在于成熟中性粒细胞内，是其胞质特殊颗粒释放的一种在碱性条件（pH9.3～9.6）能催化各种醇和酚的单磷酸酯水解的非特异性水解酶。
NAP活力可反映成熟粒细胞的成熟程度和功能，随着细胞的成熟，酶的活性也逐渐增强。
当中性粒细胞活化后，NAP阳性率及积分升高在病理情况下，NAP活性的变化常有助于某些疾病的诊断和鉴别诊断。
碱性磷酸酶染色(NAP)
临床义
临床上主要用于鉴别： 临床上主要用于鉴别： 1. 慢性粒细胞白血病与类白血病反应： 慢性粒细胞白血病与类白血病反应： 慢性粒细胞白血病(无继发性感染者 时，NAP积分一般明显下降， 慢性粒细胞白血病 无继发性感染者)时 积分一般明显下降， 无继发性感染者 积分一般明显下降 积分常＜ 分 甚至为零分；类白血病反应时则显著增高， 积分常＜13分，甚至为零分；类白血病反应时则显著增高，积 分常＞ 分常＞200分。 分 2. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高， 阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高，病 情好转时， 积分则可逐渐下降。 情好转时，NAP积分则可逐渐下降。 积分则可逐渐下降 3. 急性白血病的细胞类型：ALL增高，AML下降。 急性白血病的细胞类型： 增高， 下降。 增高 下降
方法步骤
新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s 流水轻轻冲洗30 10%甲醛甲醇固定液固定30s， 30～ 1. 新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水轻轻冲洗30～ 60s，待干。 60s，待干。 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10 15min。 10～ 2. 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10～15min。 3. 流水冲洗1 ～ 2min，加苏木素染色液中复染5～8min，流水冲洗，待 流水冲洗1 2min，加苏木素染色液中复染5 8min，流水冲洗， 干，镜检。 镜检。 胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判断标准如下： 4. 结果判断 胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判断标准如下： 0分：胞质中无阳性染色颗粒。 胞质中无阳性染色颗粒。 1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 5 计算阳性率和积分值。 计算阳性率和积分值。
中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色偶氮偶联法
中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色偶氮偶联法[原理]中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在碱性环境中，能水解磷酸萘酚钠，释放的萘酚与重氮盐作用生成不溶性有色的偶氮染料，定位于胞浆中。
[试剂](1)固定剂，为40％甲醛25m1，加无水乙醇至100m1。
(2)丙二醇缓冲液。
①贮备液(0．2mol/L 2—氨基-2-甲基-1，3-丙二醇液)为2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇10．5g，蒸馏水加至500ml。
②应用液(0.05mol/L pH9.75)，为0．2mol/L贮备液25m1， o.1mol/L盐酸 5m1，蒸馏水加至100m1。
(3)基质孵育液pH9.5-9．6(用前临时配制)，α—磷酸萘酚钠20mg溶于0.05mol/L丙二醇缓冲液20m1，再加坚牢蓝RR(或坚牢紫酱)20mg，混合后用滤纸过滤，立即应用。
(4)10g/l亮绿。
[操作](1)新鲜血片或骨髓片用4-10℃的固定剂固定30秒。
(2)、在涂片上滴加新配过滤的孵育液，在室温下作用10-15分钟。
(3)水洗，10g/L亮绿复染2分钟。
(4)水洗，晾干镜检。
[结果观察](-)：阴性反应。
(+)：胞浆中含少量紫黑色，无紫黑色颗粒或红色物质。
(++)：胞浆中含有中等量紫黑色颗粒或呈弥漫红色。
(+++)：胞浆中有丰富的紫黑色颗粒或弥漫较深红色。
(++++)：有极丰富的大紫黑色颗粒或弥漫深红色。
[参考值]中性粒细胞碱性磷酸酶活性积分值为10—50分。
[临床意义]基本同改良Gomor；氏钙钻法。
编写：谢平制定日期：2011.12.1[附注](1)若涂片不能及时测定，可固定干燥后放冰箱4℃保存。
(2)在甘油磷酸钠和巴比妥钠应临用前称取，分别为0．38和0．28，再加蒸馏水20m1即配成。
配制后的β-甘油磷酸钠不宜久放。
(3)涂片从孵育液拿出可不用水洗，直接加硝酸钻，但与硝酸钴作用后，应反复水洗，以免残留的硝酸钻与硫化胺作用后使整个涂片变黑，造成假阳性。
血细胞化学染色的临床应用考点总结
血细胞化学染色的临床应用一、过氧化酶染色二、过碘酸-雪夫反应三、碱性磷酸酶染色四、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色五、α-醋酸萘酚酯酶染色六、醋酸AS-D萘酚酯酶染色和氟化钠抑制试验七、碱性α-丁酸萘酚酯酶染色八、酸性磷酸酶染色九、铁染色细胞化学染色是以细胞形态学为基础，运用化学、生物化学等技术对细胞内的各种化学物质（酶类、脂类、糖类、蛋白质、铁、核酸）进行染色观察，做定性、定位、半定量分析的方法。
常规染色中使用较多的是酶类、糖类和铁染色。
1.过氧化酶（peroxidase，POX）染色（1）原理：（2）结果判断：阳性结果为胞质内出现棕黑色颗粒。
①（-）无颗粒；②（±）颗粒细小、弥散分布；③（+）颗粒较粗、局灶分布；④（++）颗粒粗大、密集、分布较广，占胞质的1/2～2/3；⑤（+++）颗粒粗大、成团块，几乎布满胞质；⑥（++++）颗粒成团块状，充满胞质，并覆盖胞核。
图A呈阳性反应的嗜酸性粒细胞，颗粒粗大（POX染色）图B、C呈不同阳性反应强度的细胞（POX染色）（3）正常血细胞的染色反应1）粒细胞系统：（分化差-，分化好+）（细胞衰老阳性减弱）嗜酸性粒细胞阳性反应的程度最强（颗粒）嗜碱性粒细胞呈阴性反应2）单核细胞系统：原始单核细胞呈阴性反应，幼单核细胞和单核细胞呈弱阳性反应，阳性颗粒少而细小，弥散分布，有的也可呈阴性反应。
3）其他细胞：淋巴细胞、巨核细胞、血小板、幼红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。
有的吞噬细胞可呈阳性反应。
（4）临床意义1）帮助鉴别急性白血病的类型：POX在鉴别急性白血病类型中的应用急粒急单急淋原始细胞反应（＋）～（＋＋＋）（－）～（＋）（－）阳性颗粒外观一般较多，较粗大少而细小，常弥散分布备注阴性不能排除本病小型原始粒细胞2）成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化①活性增高：可见于再生障碍性贫血、感染（特别是化脓菌感染）、急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病。
②活性减低：可见于急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征、放射病及退化性中性粒细胞。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP)
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液（NAP）预期用途：供骨髓细胞图片及血液细胞图片染色检查检验原理：本染色方法为偶氮偶联法，在PH9.2-9.8的碱性环境下，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸萘酚AS-BI水解，生成α-萘酚，再以稳定的重氮盐与萘酚偶联生成不溶性有色偶氮染料沉淀，定位于细胞浆中主要组成成分：储存条件：本试剂盒应储存于2℃-8℃低温环境。
样本要求：新鲜骨髓细胞涂片及血液细胞涂片（切勿使用抗凝血）检验方法：一、工作液配制（一）、浸染工作液配制（一份浸染工作量是43ml,至少可同时放置8-10张涂片）1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟；2、染缸（自备染液缸）内加入蒸馏水40ml；3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀4、再加D液1ml入染缸内，轻轻混匀（二）滴染工作液配制（一份滴染工作液是2.15ml）使用器材：一次性塑料试管、微量移液器，一次性吸嘴，滴管。
操作：取B液50μl,C液50μL混匀，静置2分钟，再加蒸馏水2ml，D液50μl,混匀，二、染色步骤1、干燥涂片，滴加A液固定剂（用前恢复室温，并充分摇匀）固定约30-60秒，蒸馏水冲洗，甩干；2、滴加或浸入工作液15分钟，蒸馏水冲洗2-3分钟，甩干3、E液(使用前务必摇匀！)复染1-2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检4、计算积分：反应结果以积分值报告，油镜下计数100个中性杆状核、分叶核粒细胞，分别记录其分级情况，所有阳性细胞积分相加即为积分。
如：参考范围：阳性反应主要见于成熟中性粒细胞（杆状及分叶核粒细胞）中，健康成人一般的中性粒细胞碱性磷酸酶积分值为13-130，但各个实验室条件各异，实验室应有自己的参考值。
检验结果的解释NAP阳性颗粒为蓝色检验方法的局限性仅限于形态学染色观察使用注意事项1、5Tests只限滴染使用2、使用前应恢复室温，用前请摇匀试剂；B,C液请充分混匀，所用容器必须洁净，工作液颜色为金黄色3、应采用新鲜涂片作NAP染色,放置过久则酶的活性会降低；使用抗凝血涂片染色阳性结果不稳定4、工作液配制以后应在十分钟以内使用5、需用感染发热病人或正常人外周血涂片作为阳性对照6、每次试剂使用后，请迅速盖好密封保存，以免挥发及影响效果7、本品应由专业人士使用及进行结果的判读7、使用前应详细阅读使用说明书及产品包装标识，在有效期内使用，并做好个人卫生防护8、生产批号、效期见外包装9、用后应按医院或环保部门要求处置废弃物。
碱性磷酸酶染色
临床意义
1. 鉴别细菌性感染(增高)与病毒性感染(减低) ； 2. 鉴别慢粒(减低)和类白血病反应(显著增高)； 3.慢粒经治疗病情缓解时活性恢复正常，急变
时活性增强，有助于对病情判断； 4. 急粒时活性减低，急淋时活性增高； 5. 再障时活性增强，PNH时活性减低。
其他细胞基本呈阴性反应。
结果判断
阴性：胞浆内无沉淀物（无色） 阳性：胞浆内出现红色沉淀物
阳性率： 积分计算：观察100个成熟中性粒细胞，将每
个细胞的记分相加，即得积分。
正常人的NAP活性正常值：
中性粒细胞阳性率：68~99.5%（ 84.1% ） 阳性积分为： 30~130分
注意事项
1. 涂片应新鲜，染好片即看； 2. 低温固定，细胞不易破坏； 3. 基质液须新鲜配制； 4. 应作阴、阳性对照。
步 骤(固定、显示、复染)
1. 新鲜涂片滴加固定液（4℃）30秒，待干； 2. 将Ⅰ液置入Ⅱ液混合成为基质液。将涂片
置入，37℃温育45分钟，连缸流水冲洗 数分钟，取出待干； 3. 苏木素复AP主要存在于中性成熟粒细胞（中性 杆状核和分叶核细胞），呈阳性反应， 严重的化脓性感染时，晚幼阶段也可见 有阳性反应。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色
实验要求：
掌握中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原 理、操作、注意事项、结果判断、正常血 细胞染色反应及临床意义。
原 理：
中性粒细胞内的碱性磷酸酶在碱性环 境下，水解α－磷酸萘酚钠，产生α－萘 酚。后者与重氮剂偶联形成有色沉淀物，沉 淀物的显色深浅与碱性磷酸酶活性成正比。
试剂：
1. NAP 固定液：含甲醇、甲醛等 2. NAP Ⅰ液：含固紫B等 3. NAP Ⅱ液：含丙二醇、磷酸萘酚钠盐等 4. 苏木素复染液：
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP)
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP)简介：碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ，简称ALP 或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。
此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。
Leagene 中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP)不是采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在pH9.2～9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI 磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚，后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。
该染液专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色, 碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。
组成：自备材料：1、 载玻片2、 4%多聚甲醛3、 显微镜操作步骤(仅供参考)：(一)、涂片1、制备新鲜血液或骨髓细胞涂片，NAP 固定液固定，充分水洗。
2、滴加配制好的NAP 孵育液，孵育，水洗。
3、滴加核固红染色液或甲基绿染色液复染。
水洗、晾干、镜检。
编号 名称DE0003 4×2ml DE0003 4×10ml Storage 试剂(A): NAP 固定液 2ml 10ml RT 避光 试剂(B): NAP 孵育液B1: AS-BI 染色液 1ml 5ml -20℃ 避光 B2: FBB 染色液1ml5ml4℃ 避光临用前，B1:B2混合，即为NAP 孵育液，即配即用。
试剂(C): 核固红染色液 2ml 10ml RT 避光 试剂(D): 甲基绿染色液 2ml10ml RT 避光使用说明书1份(二) 贴壁培养细胞1、取6孔板或其他容器培养的细胞，弃液，PBS清洗干净。
临床医学检验：造血检验真题
临床医学检验：造血检验真题1、单选中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色最佳pH为()A．8.0～8.4B．8.4～8.8C．8.9～9.3D．9.4～9.8E．9.9～10.3正确答案：D2、名词解释（江南博哥）分选正确答案：流式细胞仪可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞中分离出来，即所谓分选。
3、单选下列哪项描述不符合染色体超微结构中的异染色质()A．主要分布在核周的核膜内缘B．相当于染色体的螺旋部分C．电子密度较低D．随着细胞成熟异染色质不断增多E．原始细胞中异染色质的量一般没有常染色质丰富正确答案：C4、名词解释核内小体正确答案：位于核的中部或靠近边缘部位，没有界膜，四周被环形纤维状染色质包围，它由一丝细丝状物质和少量颗粒组成，电子密度较低。
5、单选临床上应用较少的细胞化学染色方法是()A．过氧化物酶染色B．酸性磷酸酶染色C．铁染色D．中性粒细胞碱性磷酸酶染色E．非特异性酯酶染色正确答案：B6、填空题6p23表示_________________________；del(11)(q23)表示_________________________。
正确答案：第6号染色体短臂2区3带；11号染色体长臂2区3带断裂末端缺失7、多选过碘酸-雪夫反应(PAS)呈强阳性的是()A．戈谢细胞B．尼曼-匹克细胞C．巨核细胞D．骨髓转移性腺癌细胞E．Reed-Steinberg细胞正确答案：A, C, D8、单选下列叙述不符合原粒细胞在透射电镜下的结构的是()A．表面平滑，微绒毛很少B．胞核常染色质占优势，异染色质少C．高尔基体较少，发育差D．线粒体少，随细胞成熟其数量越来越多E．胞质少，内有大量的游离核糖体正确答案：D9、填空题脾脏在第3个月时，首先以产生_____为主，以后产生_____，在胎儿第5个月时，产生淋巴细胞和单核细胞，而红细胞和粒细胞的产生开始减少，至出生时已成为产生淋巴细胞的器官。
正确答案：红细胞；粒细胞10、单选下列叙述不符合淋巴细胞在透射电镜下的特点的是()A．细胞表面有少量短小微绒毛B．核内有时可见核仁C．核糖体丰富，线粒体较少D．高尔基复合体发育较差E．核内常染色质多，异染色质少正确答案：E11、单选对慢性粒细胞性白血病的诊断有参考价值的细胞化学染色是() A．糖原染色B．非特异性酯酶染色和NaF抑制试验C．中性粒细胞碱性磷酸酶染色D．氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色E．过氧化物酶染色正确答案：C12、多选下列细胞化学染色原理相同的是()A．苏丹黑(SBB)染色B．过氧化物酶(POX)染色C．中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色D．酸性磷酸酶(ACP)染色E．氯醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNCE)染色正确答案：A, C, E13、填空题通过体外造血细胞半固体培养、甲基纤维素培养以及Dexter培养系统，证实了三种早期的祖细胞，它们是___________、_______________、_____________。
碱性磷酸酶染色试剂盒(偶氮偶联法)
产品组成：
规格
名称
3×10ml 3×20ml
Storage
S0100 (A): ALP 固定液
10ml
20ml
RT 避光
S0100 (B): ALP 孵育液 B1: AS-BI 染色液
5ml
10ml
-20℃ 避光
B2: FBB 染色液
5ml
10ml
4℃ 避光
临用前，按 B1:B2=1:1 比例混合，即为 ALP 孵育液，即配即用。
染色结果：
ALP 活性部位 细胞核
蓝色 红色(核固红)或绿色(甲基绿)
血液、骨髓涂片结果判断：
一般以积分报告结果，根据 100 个中性粒细胞阳性颗粒进行 0～4+计分。
细胞分值
染色特点
0
无颗粒
1
稍有颗粒
2
中等程度颗粒
3
多数颗粒
4
充满颗粒
临床意义： 1. 类白血病反应积分明显增高，未经治疗的慢性粒细胞白血病积分明显减低。 2. 急性细菌性感染积分明显增高，病毒性感染积分多正常或减低。 3. 再生障碍性贫血积分常增高，PNH、MDS 积分常减低。
碱性磷酸酶染色试剂盒(偶氮偶联法) 也称中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色液，不是采 用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在 pH9.2～9.8 的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使 AB-BI 磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚， 后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片、 冰冻切片、梯度入水后的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色,碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于 胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。
碱性磷酸酶染色(NAP)
碱性磷酸酶染色（NAP）碱性磷酸酶染色（NAP）在临床的应用基本属于常规筛查的染色法。
（1）原理（偶氮偶联法）：血细胞内的碱性磷酸酶在pH 9.4～9.6的条件下将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚与重氮盐偶联形成不溶性灰黑色沉淀，定位于酶活性所在之处。
（2）结果判断：阳性结果为胞质内出现灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀①（一）灰褐色沉淀，为0分。
②（+）胞质出现灰褐色沉淀，为1分。
③（++）胞质深褐色沉淀，为2分。
④（+++）胞质中已基本充满棕黑色颗粒状沉淀，但密度较低，为3分。
⑤（++++）胞质全被深黑色团块沉淀所充满，密度高，甚至遮盖胞核，为4分。
（3）参考值：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）的积分值为7～51。
由于各实验室的实验条件不同，正常值也有差异，应建立本实验室的正常值。
这里的正常值仅供参考。
（4）临床意义1）生理变化：①年龄变化：新生儿NAP活性增高，以后下降。
儿童期各年龄大致相似，成年期较儿童期活性减低，老年期更低。
②应激状态下的变化：紧张、恐惧、激烈运动等NAP活性可增高。
③月经周期中的变化：经前期增高，行经后降低，经后期恢复。
④妊娠期的变化：妊娠2～3个月的NAP积分值轻度增高，以后逐月增高，分娩时达高峰，产后则恢复正常。
2）病理性变化：①感染：细菌性感染时NAP积分值增高。
在细菌性感染中球菌性感染较杆菌性感染为高；在球菌性感染中，急性较慢性为高。
病毒性感染时，NAP积分值一般无明显变化。
因此本染色法有时可帮助鉴别细菌性感染和病毒性感染；②血液病：慢性粒细胞白血病的NAP积分值明显减低，常为“0”，缓解时NAP积分值上升到正常。
类白血病反应时的NAP积分值明显增高，中性杆状核粒细胞的碱性磷酸酶活性增强，甚至中性晚幼粒细胞也呈阳性反应。
因此本法常用来鉴别慢粒和类白血病反应及观察慢粒疗效的指标之一；急性粒细胞白血病时NAP积分值减低，急性淋巴细胞白血病时NAP积分值一般增高，因此本法可作为鉴别急粒和急淋的方法之一；急性单核细胞白血病时NAP积分值一般减低，有时可正常；粒细胞白血病合并细菌性感染时NAP积分值可增高，但不如单纯细菌性感染增高的明显；再生障碍性贫血的NAP积分值增高，当病情好转时，NAP积分值可下降，完全缓解时NAP活性可恢复到正常，因此本法对再障的诊断、疗效观察和估计病情均有一定意义；阵发性睡眠性血红蛋白尿的NAP积分值减低，因此本法可作为鉴别阵发性睡眠性血红蛋白尿和再生障碍性贫血的方法之一；真性红细胞增多症的NAP积分值升高，而继发性红细胞增多症的NAP积分值无明显变化。
骨髓染色
骨髓细胞化学染色(一) 过氧化酶染色（POX）【结果判断】细胞中出现蓝绿色颗粒为阳性反应。
按颗粒大小和密集程度分为强阳性和弱阳性。
【临床意义】过氧气酶主要存在于粒细胞系统，除早期原始粒细胞外，其后各阶段均呈阳性反应。
单核细胞从幼稚单核细胞起呈弱阳性反应。
淋巴细胞各阶段均为阴性。
故对急性粒细胞白血病和急性淋巴细胞、急性粒细胞与急性单核细胞白血病的鉴别诊断有帮助。
急性淋巴细胞白血病全部阴性，急性单核细胞白血病POX颗粒细小、染色浅淡。
(二) 中性粒细胞碱性磷酸酶染色(NAP)碱性磷酸酶主要存在于成熟中性粒细胞中，其他细胞均阴性。
网状细胞及吞噬细胞的酶活性很强。
【结果判断】染色结果，在细胞浆中出现灰色至棕黑色颗粒者为阳性，阴性与阳性程度可表示为：(一) 胞浆呈淡红色，无颗粒。
(＋) 全部胞浆呈淡灰色，无颗粒。
或胞浆中出现棕黑色或黑色颗粒，但不超过整个细胞的1/4。
(十十) 同(＋)，胞浆呈灰色，或颗粒不超过细胞1/2。
(＋十十) 胞浆内充满棕黑色或黑色颗粒，但尚不十分致密，范围可超过整个细胞的3/4。
(十十十十) 颗粒粗大稠密，甚至遮盖细胞核。
以积分值表示：正常人阳性率一般在40%左右，NAP积分值80分左右，以弱阳性为主。
【临床意义】(1) 急性白血病与中性粒细胞类白血病样反应的鉴别。
前者NAP减弱，后者活性明显增强。
(2) 慢性粒细胞性白血病时降低。
阵发性睡眠性血红蛋白尿患者的成熟粒细胞NAP降低。
(3) 急性淋巴细胞白血病、淋巴肉瘤、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、骨髓硬化症患者NAP明显增强。
(4) 再生障碍性贫血时NAP增强，而其他类型贫血多无变化。
(5) 激素的影响，垂体肾上腺皮质功能亢进，或应用皮质激素时NAP增强。
妊娠亦出现 NAP 增强。
(三) 糖原染色 (PAS)糖原存在于细胞浆内，粒系统细胞自早幼粒细胞开始就可呈现阳性，阳性程度随细胞成熟而增强。
成熟中性分叶粒细胞糖原最为丰富。
单核细胞呈弱阳性。
骨髓细胞学检查(3)
M4 (急性粒－单核细胞白血病，AML-M4) ①骨髓中原始细胞占非红系细胞的30%以上，各阶段粒细胞在 30%~<80%； ②各阶段单核细胞>20%； ③当嗜酸性粒细胞占非红系细胞≥5%时，则叫作M4E0； ④较少见。
成熟 小
大多圆、椭圆、卵 圆形，巨核不规则
核小质多 分叶 消失
粗糙(块状) 粉色、多
㈢、血细胞的正常形态学特征
1、红细胞系统 erythrocytes
原红（normoblast） 早幼红（basophilic normoblast） 中幼红（polychromatic normoblast） 晚幼红（orthochromatic normoblast）
各型白血病免疫学鉴别
类型
B- 淋 T- 淋 急非淋
CD10 CD19 CD22 TdT HLA-DR CD3 CD7 CD13 CD33 MPO
+ +/- +/- + +
-- - --
-
--+-
+/- +/- - - -
-
--- +
- - +/- +/- +
白血病常见的染色体和基因特异改变
类型
染色体改变
缺铁性贫血骨髓象
以中晚幼红增生为主，核小而浓染，胞浆嗜碱，呈“浆幼核老” 现象。
铁染色
细胞内铁：储存于幼红细胞内的铁颗粒 铁粒幼红细胞：I 型(1~2) II (3~5) III(6~10) 环形铁粒幼细胞 ( >6, 绕核半圈以上）
细胞外铁：储存于幼红细胞外骨髓基质中的铁
一般以含铁血黄素的形式存在
杆状核>分叶核
骨髓涂片的显微镜检查
血细胞NAP染色测定
血细胞NAP染色测定
一、原理
血细胞内的碱性磷酸酶（NAP）在碱性环境下，水解a-磷酸萘酚钠，产生a-萘酚。
后者与重氮剂偶联形成有色沉淀物，沉淀物的显色深浅与NAP活性成正比。
二、试剂组成
1、NAP固定液：1瓶×5
2、NAPⅠ液：1瓶×5
3、NAPⅡ液：1瓶×5
4、苏木素复染液：1瓶×5
三、操作步骤
1、新鲜涂片滴加固定液（4℃）30秒，水洗待干。
2、将Ⅰ液置入Ⅱ液混合成基质液。
将涂片置入后37℃30分钟，连缸流水冲洗
数分钟，取出待干。
3、苏木素复染1-2分钟，水洗，待干，镜检。
4、结果提示
阳性：细胞内出现暗红色沉淀物，定位于胞质。
阴性：细胞内无红色沉淀物。
四、注意事项
1、标本宜新鲜，若不能及时测定可先用固定液处理后，可保存数天。
2、基质液配制后及时应用，以免失效或降低阳性强度。
3、基质液为一次性使用，可同时放置8张涂片（即8份标本），配制后不能反
复应用。
五、临床意义
1、各种急、慢性粒细胞性白血病其NAP积分可降低甚至为零。
2、各种炎症（细菌性）、手术后等NAP积分均可增高。
NAP染色SOP
责任部门：检验科程审核：肖启国批准：卿文衡实施：2011-01-011.目的规范NAP染色的操作，保证操作安全可靠运行，为临床提供准确可靠的结果。
2.SOP程序编写依据依据ISO15189：2003《医学实验室—质量和能力的专用要求》《碱性磷酸酶（NAP）染色液使用说明书》《全国临床检验操作规程》（第3版）3.SOP变动程序本操作程序的变动，可由其使用的工作人员提出，报经专业主管和科主任签字批准，方可变更。
4.适用范围适用血细胞内碱性磷酸酶染色测定，用于辅助诊断。
5.实验原理:血细胞内的碱性磷酸酶在碱性（PH9.2-9.8的缓冲溶液）环境下，水解α-磷酸萘酚钠，产生α-萘酚。
后者与重氮剂偶联形成有色沉淀物，沉淀物的显色深浅与NAP成正比。
6.标本采集6.1 病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史，凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠的妇女作骨穿时要慎重。
6.2 标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液。
6.3 标本采集要求：6.3.1 高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。
6.3.2 临床上首选穿刺部位为髂后上棘，翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部位。
小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。
7. 标本储存：滴加95％乙醇盖满血膜10分钟，水洗待干，室温避光保存。
8. 标本运输：室温运输。
9. 标本要求：1）新鲜涂片.2）溶血，稀释标本不能作测定。
3）样本不宜采用抗凝剂和沾上酸，碱类物质，以免产生假阴性。
10. 试剂：10.1 试剂名称：中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂。
10.2 试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司10.3 试剂组成：试剂1. 固定剂：甲醛10ml加甲醇90ml混合，2℃~8℃避光保存，有效期1年。
责任部门：检验科程审核：肖启国批准：卿文衡实施：2011-01-01试剂2. NAPⅠ液：含固紫B等。
2℃~8℃避光保存，有效期1年。
人中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)酶联免疫分析
人中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中NAP含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中NAP水平。
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入NAP抗原、生物素化的抗人NAP抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的NAP呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为2,000pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释1,000 pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml，15.6pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0pg/ml，临用前15分钟内配制。
如配制1,000pg/ml标准品：取0.5ml2,000pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3.样品稀释液：1×20ml/瓶。
4.检测稀释液A：1×10ml/瓶。
5.检测稀释液B：1×10ml/瓶。
6.检测溶液A：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7.检测溶液B：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100稀释。
中性粒细胞碱性磷酸酶
中性粒细胞碱性磷酸酶中性粒细胞碱性磷酸酶（Neutrophil alkaline phosphatase，NAP）是一种酶，存在于中性粒细胞的细胞膜和细胞浆中。
它是一种重要的生物标志物，具有许多生理和病理过程中的关键作用。
本文将介绍中性粒细胞碱性磷酸酶的生物学功能、检测方法以及其在疾病诊断和预后评估中的临床应用。
中性粒细胞碱性磷酸酶是一种磷酸酶，具有催化磷酸酯水解的活性。
它由碱性磷酸酶家族的成员之一组成，与骨骼生长和骨重建等过程有关。
这种酶在中性粒细胞中的活性与细胞的发育状态和功能密切相关。
中性粒细胞碱性磷酸酶水平的变化可以反映细胞功能的改变，对于疾病的诊断和预后评估具有重要意义。
中性粒细胞碱性磷酸酶的检测主要通过染色法进行。
染色法将中性粒细胞与碱性磷酸酶底物结合，在底物的作用下产生有色产物。
根据产生的有色产物的数量，可以定量测定中性粒细胞碱性磷酸酶的活性。
目前，常用的染色方法有道格拉斯-多布因染色法和Kervran 染色法。
这些方法具有灵敏度高、重复性好的优点，已成为临床上常用的中性粒细胞碱性磷酸酶测定方法。
中性粒细胞碱性磷酸酶在疾病的诊断和预后评估中具有重要作用。
研究表明，中性粒细胞碱性磷酸酶水平的改变与多种疾病的发生和发展密切相关。
例如，在急性白血病和某些骨髓增生异常综合征中，中性粒细胞碱性磷酸酶活性明显降低；而在慢性髓样白血病等疾病中，中性粒细胞碱性磷酸酶活性明显升高。
因此，通过检测中性粒细胞碱性磷酸酶水平的变化，可以对疾病进行早期诊断和预后评估。
此外，中性粒细胞碱性磷酸酶还在炎症和感染过程中发挥重要作用。
炎症和感染会导致中性粒细胞复制增加和激活，从而增加中性粒细胞碱性磷酸酶的合成和释放。
因此，通过监测中性粒细胞碱性磷酸酶水平，可以评估炎症和感染的活动程度，指导临床治疗。
综上所述，中性粒细胞碱性磷酸酶是中性粒细胞中的一种重要酶类，对细胞功能的调节具有关键作用。
通过检测中性粒细胞碱性磷酸酶水平的改变，可以实现疾病的早期诊断和预后评估。
碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)[发明专利]
![碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/31db71a66aec0975f46527d3240c844769eaa09c.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510631201.6(22)申请日 2015.09.29G01N 1/30(2006.01)(71)申请人上海太阳生物技术有限公司地址201108 上海市闵行区金都路3419号(72)发明人谢永华 朱美萍 许付(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人赵青朵(54)发明名称碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)(57)摘要本发明涉及生物技术领域，公开了一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法。
本发明所述试剂盒包括pH 值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。
本发明以碱性磷酸酶底物替代现有萘酚AS-BI 磷酸钠盐、萘酚AS-MX 磷酸钠盐等进行NAP染色，该底物化学结构中通过引入发色基团联苯基，增强碱性磷酸酶水解底物产生的萘酚与偶氮盐反应的显色强度，从而大大提高了碱性磷酸酶的显色灵敏度和阳性染色。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图2页CN 105181423 A 2015.12.23C N 105181423A1.一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒，其特征在于，包括pH值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶底物溶液中还包括基质缓冲液、稳定剂、防腐剂和无机盐。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述基质缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇缓冲液、巴比妥缓冲液、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种。
4.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述无机盐为氯化钠或氯化镁。
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碱性磷酸酶染色（NAP）
碱性磷酸酶染色（NAP）在临床的应用基本属于常规筛查的染色法。
（1）原理（偶氮偶联法）：血细胞内的碱性磷酸酶在pH 9.4～9.6的条件下将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚与重氮盐偶联形成不溶性灰黑色沉淀，定位于酶活性所在之处。
（2）结果判断：阳性结果为胞质内出现灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀
①（一）灰褐色沉淀，为0分。
②（+）胞质出现灰褐色沉淀，为1分。
③（++）胞质深褐色沉淀，为2分。
④（+++）胞质中已基本充满棕黑色颗粒状沉淀，但密度较低，为3分。
⑤（++++）胞质全被深黑色团块沉淀所充满，密度高，甚至遮盖胞核，为4分。
（3）参考值：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）的积分值为7～51。
由于各实验室的实验条件不同，正常值也有差异，应建立本实验室的正常值。
这里的正常值仅供参考。
（4）临床意义:
①生理变化：
①年龄变化：新生儿NAP活性增高，以后下降。
儿童期各年龄大致相似，成年期较儿童期活性减低，老年期更低。
②应激状态下的变化：紧张、恐惧、激烈运动等NAP活性可增高。
③月经周期中的变化：经前期增高，行经后降低，经后期恢复。
④妊娠期的变化：妊娠2～3个月的NAP积分值轻度增高，以后逐月增高，分娩时达高峰，产后则恢复正常。
②病理性变化：
①感染：细菌性感染时NAP积分值增高。
在细菌性感染中球菌性感染较杆菌性感染为高；在球菌性感染中，急性较慢性为高。
病毒性感染时，NAP积分值一般无明显变化。
因此本染色法有时可帮助鉴别细菌性感染和病毒性感染；
②血液病：慢性粒细胞白血病的NAP积分值明显减低，常为“0”，缓解时NAP
积分值上升到正常。
类白血病反应时的NAP积分值明显增高，中性杆状核粒细胞的碱性磷酸酶活性增强，甚至中性晚幼粒细胞也呈阳性反应。
因此本法常用来鉴别慢粒和类白血病反应及观察慢粒疗效的指标之一；急性粒细胞白血病时NAP 积分值减低，急性淋巴细胞白血病时NAP积分值一般增高，因此本法可作为鉴别急粒和急淋的方法之一；急性单核细胞白血病时NAP积分值一般减低，有时可正常；粒细胞白血病合并细菌性感染时NAP积分值可增高，但不如单纯细菌性感染增高的明显；再生障碍性贫血的NAP积分值增高，当病情好转时，NAP积分值可下降，完全缓解时NAP活性可恢复到正常，因此本法对再障的诊断、疗效观察和估计病情均有一定意义；阵发性睡眠性血红蛋白尿的NAP积分值减低，因此本法可作为鉴别阵发性睡眠性血红蛋白尿和再生障碍性贫血的方法之一；真性红细胞增多症的NAP积分值升高，而继发性红细胞增多症的NAP积分值无明显变化。
因此本法可用来鉴别真性红细胞增多症和继发性红细胞增多症；骨髓增生异常综合征的NAP积分值减低；
③其他
其他应用肾上腺皮质激素、雌激素和ACTH后NAP积分值增高。
3 在碱性磷酸酶（NAP）积分可以用来区别再生障碍性贫血和PNH，再障的时候NAP增高、PNH时NAP积分降低。
这个谁都知道。
但是百思不得其解。
碱性磷酸酶染色的原理是几乎只在成熟的中性粒细胞中才能是阳性的，
中性粒细胞碱性磷酸酶
临床意义:
（1）慢粒细胞白血病（慢粒）的诊断及其与类白血病的鉴别：慢粒时，NAP 积分值一般常为0分，个别可正常。
在类白血病则积分显著增高。
如慢粒合并感染或急变时可增高。
（2）急性白血病细胞类型的鉴别：急性淋巴细胞白血病，NAP积分增高或正常，急性粒细胞白血病则降低，急性单核细胞白血病不定。
（3）再生障碍性贫血（再障）与阵发性睡眠性血红蛋白尿的鉴别：急、慢性再障，积分增高，后者可明显降低。
（4）白血病前期（白前）与再障鉴别：白前积分降低，而后者增高。
（5）细菌性肺炎与病毒性肺炎鉴别：细菌性肺炎增高，后者降低。
（6）真性与继发性红细胞增多症的鉴别：前者增高，后者若无感染则正常。
（7）绿色瘤与神经母细胞瘤的鉴别：前者积分降低，后者则增高。
参考值: NAP染色只在中性分叶核、杆状核粒细胞中，偶在中性晚幼粒细胞中出现阳性，其他细胞一般阴性。
NAP的正常值与实验室的
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