蛋白质的提取纯化及定量
蛋白表达纯化的实验原理
蛋白表达纯化的实验原理蛋白表达与纯化是生物学实验中常用的技术，可以用来研究和生产各种蛋白质。
本文将一步一步回答关于蛋白表达纯化实验的原理和步骤。
第一步：蛋白表达系统的选择蛋白表达系统是指用来制备和表达目标蛋白质的细胞或病毒载体。
常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等。
选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质、需求量和表达效率等因素。
第二步：构建表达载体表达载体是将目标蛋白的基因序列插入到细胞或病毒载体中，以实现蛋白表达的工具。
通常采用的方法是将目标基因通过限制性内切酶切割，然后与适当的载体连接。
第三步：细胞转染或感染将构建好的表达载体转染到细胞中，使目标蛋白基因在细胞内进行表达。
对于真核细胞（如哺乳动物细胞）可以通过转染的方式传递质粒DNA，而对于原核细胞（如大肠杆菌）可以通过热激转化或电穿孔等方法进行具体的转染。
第四步：培养表达细胞转染或感染后，需要将细胞培养到合适的条件下，以促进目标蛋白表达。
培养条件包括适宜的培养基、温度、氧气供应和营养物等。
此外，可以考虑添加特定的诱导剂或抑制剂，以调控蛋白表达的级别。
对于细菌目标蛋白表达，通常将细胞培养在含有抗生素的培养基上以选择表达带有目标基因的细菌。
第五步：蛋白表达检测为了确定目标蛋白是否在细胞中表达，可以使用多种方法进行检测。
常用的方法包括Western blot、ELISA、原位杂交、荧光染色等。
同时，可以通过调整培养条件或表达载体的构建来提高蛋白表达的水平。
第六步：蛋白纯化蛋白纯化是从表达系统中提取和纯化目标蛋白的过程。
纯化步骤的选择取决于目标蛋白的性质和所需的纯度。
常见的纯化方法包括亲和纯化、凝胶过滤、离子交换、大小排除层析、亲水性层析等。
此外，还可以使用亲和标签（如His标签、GST标签等）来辅助蛋白质的纯化。
第七步：蛋白质的鉴定和定量通过蛋白纯化后，需要对目标蛋白进行鉴定和定量。
可以使用SDS-PAGE、Western blot、质谱分析等方法来确定蛋白质的分子量和纯度。
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
蛋白质的分离、纯化和鉴定
三、蛋白质的胶体性质与蛋பைடு நூலகம்质沉淀
蛋白质是亲水胶体。 1. 蛋白质是亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。
球状的水溶性蛋白疏水基团借疏水作用聚合在分 子内部， 子内部，而亲水基团则分布于表面与周围水分子 结合形成水化层； 结合形成水化层； 水化层 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 双电层
影响盐析的因素有： 影响盐析的因素有： 温度 pH值 值 蛋白质浓度 常用的中性盐主要有硫酸铵， 常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶 解度大 。
※ 有机溶剂沉淀反应
：用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取 用与水互溶的乙醇、
水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用， 水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用，使 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、作 用时间和沉淀温度有关。 用时间和沉淀温度有关。 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在 ～ ℃ 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温 下进行，丙酮用量一般 倍于蛋白质溶液体积 倍于蛋白质溶液体积。 下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外， 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙 醇沉淀。 醇沉淀。
（2）不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可 能再重新溶解于水。 能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
提取蛋白质步骤
提取蛋白质步骤蛋白质是生物体内最重要的官能分子之一，是组成生物体的重要基础。
在生物学领域，蛋白质的提取方法是非常重要的。
下面，我们将介绍蛋白质的提取步骤。
1. 细胞破碎蛋白质存在于细胞内，因此需要将细胞破碎，以释放蛋白质。
破碎细胞的方法有多种，如超声波破碎、高压破碎、玻璃珠破碎等。
2. 去除杂质细胞破碎后，需要去除杂质。
可以采用离心的方法，将混合液放入离心管中，通过高速离心，使得蛋白质与其他杂质分离出来。
此外，还可以使用滤纸、膜过滤等方法去除杂质。
3. 溶解蛋白质在溶液中存在，因此需要将其溶解。
常用的溶解液有生理盐水、PBS缓冲液等。
在溶解时，需要控制溶液的pH值和温度，以避免对蛋白质的影响。
4. 蛋白质分离蛋白质的分离方法有多种，如电泳、层析、免疫亲和等。
其中，电泳是常用的方法之一，可以根据蛋白质的大小、电荷等性质进行分离。
层析法根据分子量、亲和性等原理进行分离。
免疫亲和法则是针对特定蛋白质，利用抗体对其进行识别和分离。
5. 蛋白质纯化蛋白质分离后，还需要进行纯化，以去除杂质。
纯化方法有多种，如柱层析、凝胶过滤、亲和层析等。
不同的纯化方法适用于不同类型的蛋白质。
6. 蛋白质定量蛋白质定量是一个重要的步骤，可以确定提取的蛋白质含量。
常用的定量方法有比色法、Bradford法、BCA法等。
这些方法都可以通过对特定试剂与蛋白质反应，从而测定蛋白质的含量。
7. 蛋白质保存提取的蛋白质需要保存，以便后续实验使用。
常用的保存方法有冰冻保存、干燥保存等。
在保存时，需要注意蛋白质的稳定性，选择合适的保存条件。
总结以上是蛋白质提取的基本步骤，每个步骤都需要仔细操作，以确保提取出的蛋白质纯度和含量的准确性。
在实验过程中，需要根据具体情况灵活运用不同的方法，以提高蛋白质的提取效率和纯度。
蛋白质的分离纯化及亚基分子量测定
一、蛋白质的分离纯化及亚基分子量测定本实验的目的在于学习蛋白质的盐析沉淀、分子筛层析、离子交换层析等生物化学实验技术，实现系统、完整的蛋白质提取、分离、纯化及亚基分子量测定的基本实验技术和技能的综合训练。
本实验的内容主要两个部分：1)通过盐析沉淀和分离筛柱层析获得可用于分离纯化的蛋白质提取液；2)用离子交换柱层析进行蛋白质提取液的分离纯化。
每部分实验计划12课时完成，24课时(3天)完成全部实验内容。
实验技术原理1.蛋白质的盐析沉淀2.蛋白质的分子筛柱层析3.蛋白质的离子交换柱层析实验步骤一、蛋白质的提取及分离1.藻胆蛋白提取取红藻样品5－8 g，加25ml 50 mmol/L NaH2PO4－K2HPO4 pH 7.0缓冲液(内含NaN3 4 mmol/L，EDTA-Na 2 mmol/L，十六烷基三甲基溴化胺(CTAB) 0.1% (W/V))，研磨提取藻胆蛋白。
然后，用50 ml离心管，将提取液在4C︒、12000转/min离心30 min，保留上清液。
对沉淀再做两次相同的藻胆蛋白提取，合并三次提取的上清液，并量出总体积。
2.硫铵沉淀按每100 ml溶液36.1g硫酸铵，称取所需的硫酸铵。
研细后在搅拌条件下缓慢加入提取液(约1－2小时)，使硫酸铵饱和度达到60％，置4C︒冰箱中过夜。
用50 ml离心管，在4C︒、12000转/min 离心30 min，小心弃去上清液。
红色沉淀用20 ml 50 mmol/L NaH2PO4－K2HPO4缓冲液充分溶解。
红色溶解液用50 ml离心管，在4C︒、16,000转/min离心30 min。
小心取出上清液，此藻胆蛋白提取液用作后续实验的样品。
3.分子筛柱层析取约60-70 ml溶涨好的Sephadex G-25葡聚糖凝胶，装一柱床体积约为2.6 cm⨯10 cm的分子筛柱。
用50 mmol/L的NaH2PO4－K2HPO4 pH 7.0缓冲液(内含NaN3 4 mmol/L，EDTA-Na 2 mmol/L)过柱平衡柱床，流速～20－30 ml/hr。
试述蛋白质分离纯化的主要步骤及方法
试述蛋白质分离纯化的主要步骤及方法下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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实验一 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定1
实验三蛋白质的提取、分离纯化及定量实验目的1.学习蛋白质的提取方法。
2.掌握凝胶过滤法使蛋白质脱盐。
3.掌握紫外分光光度法或考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。
实验原理（一）蛋白质的提取：盐析法或等电点法。
蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态与解离程度受溶液的酸碱度影响，当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其特异的等电点，在等电点时，蛋白质的溶解度最低，可用于提取蛋白质。
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）浓溶液能析出蛋白质。
盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。
如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵中析出。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆沉淀反应，可用于提取蛋白质。
（二）蛋白质的分离纯化蛋白质溶液中如含有无机盐离子，用葡聚糖凝胶过滤法可使蛋白质与无机盐分离，效果理想。
葡聚糖凝胶（商品名SepHadex），又称右旋糖苷，它是葡萄糖通过α－1,6－糖苷键形成的长链，与交联剂环氧氯丙烷交联生成（见图）。
在合成凝胶时，控制交联剂环氧氯丙烷的用量，可以制成网孔大小不同的葡聚糖凝胶（见图），即不同规格凝胶。
葡聚糖凝胶从G-10到G-200有多种类型，G后的数字由每克干胶充分溶胀后吸水的克数乘以十所得，同时也代表网孔大小，G后的数字越小，其溶胀后的网孔越小，一般G-10到G-50适用于蛋白质与小分子或无机盐的分离，G-75到G-200适用于分子量大于一万的蛋白质的分离。
本实验用G-25使蛋白质与硫酸铵分离，当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的硫酸铵扩散进入G-25的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒（固定相）的外面，加入洗脱液（流动相）洗脱，因大分子蛋白质从凝胶颗粒的缝隙向下洗脱，阻滞力小，可首先被洗脱下来，故洗脱体积小。
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的基本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上（原点），进行展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进行分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA分离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移（rate of flow ,R f）来表示R f= 原点到层析点中心的距离（X）/原点到溶剂前沿的距离(Y) 只要条件（如温度、展层剂的组成）不变，某种物质的R f值是常数。
可根据R f作为定性依据。
R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的R f值相同或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而达到分离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进行混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.已知单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸（14*17）、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸（长17㎝、宽14㎝）一张。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
血清中蛋白提取方法
血清中蛋白提取方法血清中蛋白提取方法引言：血清中蛋白质的提取是生物化学和生物医学研究中非常重要的步骤之一。
血清中蕴含着丰富的信息，包括生物标志物、生长因子和激素等，这些成分对于研究疾病的发生机制以及诊断和治疗具有重要意义。
本文将介绍一些常用的血清中蛋白提取方法，帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
一、盐析法盐析法是一种常用的分离和富集蛋白质的方法。
该方法通过在高盐浓度下使蛋白质发生沉淀，实现了与其他杂质的分离。
具体步骤如下：1. 准备工作：在试管中加入一定量的样品血清，并加入适量的盐溶液（如氯化铵溶液）。
2. 混匀：用试管摇床等设备将样品充分混匀，使盐溶液与血清充分接触。
3. 沉淀：将试管置于低温环境（如冰浴或低温离心机中）进行沉淀。
此时，沉淀的是蛋白质，而其他大部分成分仍溶于上清液中。
4. 离心：使用高速离心机将试管进行离心，离心速度和时间可根据样品的具体情况进行调整。
5. 分离：将上清液倒入新的试管中，留下的沉淀即为富含蛋白质的组分。
二、电泳方法电泳方法是一种常用的蛋白质分离和富集技术。
通过在电场的作用下，根据蛋白质的大小和电荷差异将其分离。
以下是一种常见的电泳方法：1. 准备样品：将一定量的血清样品进行处理，如去除脂肪和其他杂质。
2. 电泳凝胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，并根据需要选择合适的凝胶浓度和孔径大小。
3. 样品加载：将样品血清溶液加载到凝胶孔中。
4. 电泳操作：将电泳装置连接到电源，并设定适当的电场强度和时间。
5. 分析和分离：在电泳运行后，通过染色或质谱等方法对蛋白带进行观察和分析，以确定所需蛋白质的位置。
三、亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与特定配体的亲和作用进行分离和富集的方法。
以下是该方法的一般步骤：1. 准备亲和层析柱：将具有亲和性的配体固定在柱子内部。
2. 样品准备：将血清样品进行前处理，如去除异物和杂质。
3. 样品加载：将经处理的血清样品加载到亲和层析柱中。
4. 洗脱：通过更改溶液条件或引入特定的试剂，洗脱所需的蛋白质。
生物化学研究进展论文蛋白质提纯
生物化学研究进展论文蛋白质提纯文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-生物化学研究进展作业题目蛋白质的提取、纯化姓名学号班级专业题目：蛋白质的提取、纯化姓名：专业：摘要：本文综述了蛋白质的提取原理及方法，蛋白质纯化的意义、基本原则及方法，蛋白质纯化的前景展望。
关键词：提取原理提取方法水溶液有机溶剂双水相萃纯化意义基本原则方法溶解度带电性质电荷数配体特异性前景正文：1 蛋白质样品的提取1．1蛋白质样品的提取原理提取蛋白质的基本原理主要有两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。
1．2 蛋白质样品的提取方法1．2．1 水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液是提取蛋白质最常用的溶剂。
通常用量是原材料体积的1—5倍，提取时需要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成分性质而定，一般在低温(5℃以下)下操作。
另外，蛋白质和酶是两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH值范围内。
一般来说，在避免极端pH值的前提下，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。
此外，稀浓度可促进蛋白质盐溶，并且盐离子与蛋白质部分结合，能够保护蛋白质不易变性。
因此可在提取液中加少量NaC1等中性盐，一般以0．15 mol／L浓度为宜。
1．2．2 有机溶剂提取法一些和脂质结合牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶都不溶于水、稀盐溶液、稀酸或碱，可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，具有一定的亲水性和较强的亲脂性，并且不会残留在产品中，容易蒸发除去，密度低，与沉淀物质的密度差大，便于离心分离。
但不足的是用有机溶剂来提取蛋白质比用盐析法更容易引起蛋白质变性。
蛋白质提取、纯化、鉴定的方法(一)
蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（一）一、硫酸铵沉淀硫酸铵是用于沉淀蛋白质的最常用的盐。
低浓度硫酸铵使蛋白质的溶解度增大，即所谓的盐溶(salting in)，但当硫酸铵浓度增加到一定浓度后，蛋白质的溶解度开始减小，即所谓的盐析(salting out)。
当硫酸铵达到一定浓度时，蛋白质析出。
不同蛋白质的盐析浓度有差异，了解目的蛋白质析出所需的硫酸铵浓度，就可部分纯化这种蛋白质。
注意，目的蛋白质的浓度与盐析浓度有一定的关系，如1mg／ml与0.01mg ／ml的蛋白质浓度所需的盐析浓度是不一样的，低浓度的蛋白质盐析需要较高浓度的硫酸铵。
硫酸铵沉淀不仅可去除一些杂蛋白，还可去除其他的杂质如脂质等各种小分子。
二、三相分配技术举一个例子来说明该技术的原理：提取E.coli中的绿色荧光蛋白，E.coli与适当浓度的硫酸铵混匀，加入等体积的叔丁醇，振荡混匀，低速离心，分成三相。
上层为有机相，含有细菌的膜脂和脂溶性物质如色素；中层，含有绿色荧光蛋白；下层为相，含有完整细胞壁的E.coli、核酸和大量的蛋白质等。
这个技术的原理是，适当浓度的硫酸铵可沉淀大量的蛋白质但不沉淀绿色荧光蛋白；叔丁醇可溶解细菌的细胞膜，因此可释放绿色荧光蛋白；同时叔丁醇是种有机溶剂，可使蛋白质和核酸等大分子变性，使其在原位沉淀，仍留在细菌的细胞壁内。
该方法的优点是操作简便，省去了消化细胞壁和去除核酸及大多数杂蛋白等烦琐步骤。
但该方法只适用于那些能够耐受有机溶剂的蛋白质。
这样的技术得到的是部分纯化的蛋白质。
三、层析技术1.离子交换层析 这一技术是根据不同的蛋白质有不同的等电点，其吸附在离子交换剂上的强弱有分别，来对蛋白质进行分离。
离子交换剂可分为两种，阳离子交换剂(如羧甲纤维素)和阴离子交换剂(如DEAE-纤维素)。
在某一pH值条件下，当阳(阴)离子交换剂带有负(正)电荷而蛋白质带有正(负)电荷时，蛋白质就可吸附在阳(阴)离子交换剂上。
各种蛋白质的等电点可能不同，因此其吸附在离子交换剂上的强度不同，用不同离子强度的洗脱液可将pI不同的蛋白质洗脱。
蛋白质的提取和纯化
蛋白质的提取与纯化徐卫 10食工（1）班 20100803122一，蛋白质的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。
蛋白质提取纯化的基本流程
蛋白质是生物体内一类非常重要的大分子有机化合物，承担着多种生物学功能。
为了进行蛋白质的研究、分析或应用，科学家们需要从复杂的生物体系中提取和纯化目标蛋白质。
蛋白质提取纯化的基本流程通常包括样品制备、裂解、离心、层析、电泳等步骤。
下面是关于蛋白质提取纯化的基本流程的详细解释：### **1. 样品制备：**蛋白质提取纯化的第一步是样品的制备。
这涉及到从生物体（细胞、组织等）中获得样品。
样品的制备过程中要注意避免蛋白质的降解和损失。
常见的样品包括细胞总蛋白、细胞膜蛋白、细胞器蛋白等。
制备好的样品需要储存在低温下以防止蛋白质的降解。
### **2. 裂解（细胞破碎）：**样品制备完成后，下一步是裂解，也就是将生物体内的细胞或组织破碎，释放蛋白质。
裂解可以通过机械破碎、超声波破碎、高压破碎等方法实现。
同时，可以添加裂解缓冲液，其中可能包含蛋白酶抑制剂、还原剂等，以维持蛋白质的稳定性。
### **3. 离心：**裂解后的混合物通过离心可以分离成上清液和沉淀。
离心是利用离心机产生的离心力，使样品中的颗粒沉降，从而实现液体和颗粒的分离。
上清液中包含了可溶性的蛋白质，而沉淀中则包含了细胞核、细胞壁等。
### **4. 层析（柱层析或凝胶层析）：**层析是蛋白质提取纯化中的关键步骤之一。
这一步旨在根据蛋白质的性质，通过将混合物在柱上或凝胶中进行分离。
常见的层析方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
层析可以根据蛋白质的大小、电荷、亲和性等特性有选择性地分离目标蛋白质。
### **5. 电泳：**电泳是蛋白质分离和分析的重要手段。
在电场作用下，蛋白质根据其电荷和大小在凝胶中迁移。
蛋白质电泳分离可以用于检测样品的纯度、确定分子量等。
常见的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
### **6. 检测和分析：**在蛋白质提取纯化的过程中，需要对提取得到的蛋白质样品进行检测和分析。
蛋白质的提取纯化和分析
凝胶过滤色谱的洗脱
分析鉴定
定性分析
定量分析
定性分析
分子量
• 凝胶电泳
• 质谱(可同时 鉴定分子量和 纯度)
活性
• 根据蛋白质的 功能选用不同 的活性检测方 法
• 如：磷酸二酯 酶( PDE)法
常用方法
• SDS-PAGE测 定蛋白质的分 子量和纯度
• MALDI-TOFMS测定蛋白 质的分子量和 纯度
缩胶，120V 电压条件下
定量分析
紫外检测 法
简单快速
不破坏样品
准确度低
考马斯亮 蓝染色法
简单迅速
干扰少
灵敏度高(1μg)
Folin-酚试 剂法
灵敏度高
常用
Folin-酚试剂法
step1
step2
在碱性条件下蛋白质 和铜作用生成蛋白质 -铜络合物
此络合物将Folin 试剂还原，产生 深蓝色，颜色深 浅与蛋白质含量 成正比。
蛋白质的提取纯化和分析
目录
题目分析 材料选择和预处理
细胞破碎 蛋白质的粗提 蛋白质的纯化
分析检测
1
题目解析
已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点3.9~4.1，它 能耐一定的高温，在90 °C加热3~4 min后仍然能够保 持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+ 结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生 物体内酶的激活剂。
然
结
一
构
般
蛋
白
%
钙 调 蛋 白
100℃
其他方法
盐析法
等电点法
有机溶剂法
3
作用机理 配体
亲和色谱
蛋白质
耦联
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生命科学学院
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验原理
1、蛋白质的提取：盐析法或等电点法。 2、蛋白质的分离纯化---
生 物 化 学 实 验
凝胶过滤法（分子排阻层 析法）:它是以各种凝胶 做固定相,利用流动相中所 含各物质的相对分子质量 不同而达到物质分离的目 的。葡聚糖凝胶 （Sephadex）是最常用 的凝胶,又称右旋糖苷,它 是葡萄糖通过α－1,6－糖 苷键形成的长链—葡聚糖 在交联剂表氯醇（环氧氯 丙烷）作用下形成的三维 空间网状结构（见图）,具 有分子筛效应及水不溶性。 Exit
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蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验步骤
生 物 化 学 实 验
一、蛋白质的提取
二、蛋白质的脱盐——凝胶过滤
三.蛋白质的定量
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蛋白质的提取、分离纯化及定量
一.蛋白质的提取
生 物 化 学 实 验
取鸡蛋一只，取蛋清加无离子水至 50ml，搅拌成均匀的胶体溶液。用六层纱 布过滤，取2ml蛋清溶液于试管中，加入 硫酸铵至饱和状态，2000r/min离心 10min,去上清液，加入水至沉淀刚好溶解， 测量体积。
回归方程式及相关系数的推导。 （y=ax+b R2=)
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蛋白质的提取、分离纯化及定量 752分光光度计
生 物 化 学 实 验
y 1.81.5577x + 0.0901 = 1.6 R 2 = 0.9883 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.5 1 1.5
Exit
系列1 线性 (系列 1)
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U2100分光光度计
生 物 化 学 实 验
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
y = 1.7317x + 0.0725 R 2 = 0.9941
0.5
1
1.5
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蛋白质的提取、分离纯化及定量
2.凝胶装柱 安装层析装置，将层析柱固 定在铁架台上，两端分别连接乳 胶管。上段与洗脱液连通，下端 装一螺旋夹调控洗脱速度，先用 少量洗脱液洗柱并排除乳胶管中 的气泡，待柱中洗脱液维持1cm 高度时，拧紧螺旋夹。将溶胀好 的G-25依次倒入层析柱中,使其 自然沉降,沉降后凝胶柱的高度 为层析柱的3/4~4/5且柱床面平 整比较理想。拧松螺旋夹排除多 余的洗脱液,床面上维持1cm高 的洗脱液,拧紧螺旋夹。
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蛋白质的提取、分离纯化及定量
合成凝胶时,控制交联剂用量,可制成网孔大小不同的葡聚 糖凝胶--不同规格凝胶.葡聚糖凝胶从G-10到G-200有多种 类型,G表示交联度,G后的数字由每g干胶充分溶胀后吸水 的g数乘以十所得,同时也代表网孔大小,G后的数字越小, 交联度越大,其溶胀后的网孔越小,持水量越少,反之亦然. 一般G-10到G-50适用于蛋白质与小分子或无机盐的分 离,G-75到G-200适用于分子量大于一万的蛋白质的分离。 本实验用G-25使蛋白质与硫酸铵分离 当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时,小分子的硫酸铵 扩散进入G-25的网孔中,而大分子的蛋白质因颗粒直径大, 不能进入网孔中,被排阻在凝胶颗粒(固定相)的外面,加入 洗脱液(流动相)洗脱,因大分子蛋白质从凝胶颗粒的缝隙向 下洗脱,阻滞力小,可首先被洗脱下来。而小分子的硫酸铵 因扩散进入凝胶颗粒的网孔中,阻滞力大，后从柱中洗出, 这样可使蛋白质与硫酸铵很容易分离开。 Exit
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主要实验仪器 生 物 化 学 实 验
层析装置
分光光度计 离 心 机
离 心 机
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层析柱的使用方法 生 物 化 学 实 验
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分光光度计：752分光光度计 生 物 化 学 实 验
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蛋白质的提取、分离纯化及定量 三.蛋白质的定量--考马斯亮蓝法测蛋白质含量
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1、蛋白质标准曲线的制作：
1mg/ml蛋白质标准液(ml） 0 蒸馏水（ml） 考马斯亮蓝 （ml） A595 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
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二.蛋白质的脱盐——凝胶过滤
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1.溶胀凝胶 用无离子水 浸泡Sephadex G-25 24小时以 上（中间换一 次水）或用无 离子水沸水溶 胀2小时左右。
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生 物 化 学 实 验生源自科学学院蛋白质的提取、分离纯化及定量
3.加样洗脱 用刻度吸管吸取 1ml样品(蛋白质－硫酸 铵溶液),其尖头小心沿 层析柱内壁伸到床面之 上,慢慢将样品加到凝胶 床面上(不可搅动床面), 此时能看到床面上样品 与洗脱液之间有一清晰 界面。拧松螺旋夹,使样 品全部进入凝胶柱中,接 通洗脱液,开始洗脱并收 集洗脱液。 4.收集检查 用刻度离心管收集 洗脱液，每管收集1ml。
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2、蛋白质的定量 取两只试管，按下表操作
空白管 待测管 蛋白质待测液(ml) 水(ml) 考马斯亮蓝(ml)
1 1
3
3
A595
3、计算
Exit
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作
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业
预习下一个实验
维生素C的定量 第12周（11.16-11.22）
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Exit Exit
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生 物 化 学 实 验
（三）蛋白质的定量：考马斯亮蓝法（Bradford法） 测定蛋白质含量 考马斯亮蓝G-250是一种能使蛋白质染色的染料， 在酸性溶液中，考马斯亮蓝本身呈红褐色，在465nm处 有最大光吸收。加入蛋白质后，该染料能与蛋白质快速 结合，生成染料－蛋白质复合物，该复合物的最大光吸 收峰移向595nm处，消光系数更大。蛋白质浓度在一定 范围内（1——1000ul/ml）与考马斯亮蓝反应的复合物 在595nm处的吸光度与蛋白质的浓度呈直线关系，故可 用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约 2min即反应完全，其复合物在1h内保持稳定，
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生物化学实验
蛋白质的提取、分离纯化及定量
主讲：刘连芬 聊城生命科学学院 E-Mail：liulianfen@
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蛋白质的提取、分离纯化及定量
生 物 化 学 实 验
一、相关知识背景 二、实 验 原 理
三、主要实验仪器 四、实 验 步 骤 五、实 验 小 结
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蛋白质的提取、分离纯化及定量
分光光度计：U2100
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蛋白质的提取、分离纯化及定量
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冷冻离心机
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离心机
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⑴将字心机置于平坦结实的地面或实验台上。 ⑵检查离心机调速旋钮是否处在0置 ⑶装入待离心液体后，把离心机转头对称位 置上的离心管（包括外套管）放在天平上平 衡，装入液体量以距管口1--2cm为宜
⑷电源接好，插头插牢，使用接地，盖上盖上锁 ⑸打开开关，顺时针缓慢转动调速杆，达到所需转速 。 ⑹离心完毕，将调速杆置于0位，关闭电源，待惯性转停后，按动开锁钮， Exit 开盖取样。
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相关知识背景
生 物 化 学 实 验
蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质 分子的解离状态与解离程度受溶液的酸碱度影响，当溶液的pH达到 一定数值时，蛋白质 颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中既不向 阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称此种蛋白质的等电 点。不同蛋白质各有其特异的等电点，在等电点时，蛋白质的溶解度 最低，可用于提取蛋白质。 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为 稳定的亲水胶体颗粒，在一定理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去 电荷和脱水而沉淀。无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）浓溶液能 析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半 饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵中析出。由盐析获 得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐 析作用是可逆沉淀反应，可用于提取蛋白质。 Exit