CRISPRCas9基因敲除原理及其应用培训课件
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crispr-cas基因编辑技术原理与应用PPT精选文档
力因子测试和MLST 基因型明显相关。
31
进展
2 在斑马鱼研究方面，通过注射两个 简单的体外合成的组件(即使用一个密 码子优化的Cas9 和单链向导 sgＲNA) 到单细胞期胚胎中，使目标基因突变。 这种灵活的基因失活的方法为斑马鱼 基因功能和基因相互作用提供了一个 有效的方式。
32
进展
3 干细胞中的定点突变，包括引进或疾病患者特异性突变模 型的修正。然而，在人类胚胎干细胞中将一个报告基因整合成一 种内源性基因还需要漫长艰苦的两步:首先要正确识别目标然后 要排除耐药性。研究发现，tracrＲNA 和crＲNA 分开单独表达， 还能够提高切割的效率。这个发现让大家意识到:可以通过进一 步修改 sgＲNA 的设计方案，让它与双 ＲNA 复合体的结构更加 相近，就能够进一步提高 Cas9 系统的基因组编辑效率。
缺陷
成本高,应用的物种有限,操纵的基因亦有限。
16
基因编辑功能应用
CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能主要应用于在不同物种 的基因组产生需要的等位基因突变,来研究基因功能或建立疾病模 型。
如果CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能如果真如研究者 报道那样强大的话，那该技术在先天性突变或获得突变所致疾病 的修复治疗中将有巨大的潜在价值。这一点还有待研究。
33
进展
4 在拟南芥研究方面，利用C ＲISPＲ/Cas 系统对分裂组织有 针对性地定点诱变产生遗传突变， 结果表明，在拟南芥中使用 CＲ ISPＲ/Cas系统为 RNA 引导的核 酸内切酶(RGEN)定点突变分裂组 织提供了一种有效的遗传基因工 程的方法。
34
进展
5 CRISPR/Cas 的 打 靶 效 率 比 较 高，最
缺陷：1、不能预期引入的ZFN蛋白是
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进展
2 在斑马鱼研究方面，通过注射两个 简单的体外合成的组件(即使用一个密 码子优化的Cas9 和单链向导 sgＲNA) 到单细胞期胚胎中，使目标基因突变。 这种灵活的基因失活的方法为斑马鱼 基因功能和基因相互作用提供了一个 有效的方式。
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进展
3 干细胞中的定点突变，包括引进或疾病患者特异性突变模 型的修正。然而，在人类胚胎干细胞中将一个报告基因整合成一 种内源性基因还需要漫长艰苦的两步:首先要正确识别目标然后 要排除耐药性。研究发现，tracrＲNA 和crＲNA 分开单独表达， 还能够提高切割的效率。这个发现让大家意识到:可以通过进一 步修改 sgＲNA 的设计方案，让它与双 ＲNA 复合体的结构更加 相近，就能够进一步提高 Cas9 系统的基因组编辑效率。
缺陷
成本高,应用的物种有限,操纵的基因亦有限。
16
基因编辑功能应用
CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能主要应用于在不同物种 的基因组产生需要的等位基因突变,来研究基因功能或建立疾病模 型。
如果CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能如果真如研究者 报道那样强大的话，那该技术在先天性突变或获得突变所致疾病 的修复治疗中将有巨大的潜在价值。这一点还有待研究。
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进展
4 在拟南芥研究方面，利用C ＲISPＲ/Cas 系统对分裂组织有 针对性地定点诱变产生遗传突变， 结果表明，在拟南芥中使用 CＲ ISPＲ/Cas系统为 RNA 引导的核 酸内切酶(RGEN)定点突变分裂组 织提供了一种有效的遗传基因工 程的方法。
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进展
5 CRISPR/Cas 的 打 靶 效 率 比 较 高，最
缺陷：1、不能预期引入的ZFN蛋白是
最详细：CRISPR-Cas9系统原理应用及发展.39页PPT
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
最详细：CRISPR-Cas9系统原理应用 及发展.
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
crispr原理解析ppt课件
研究报告微课研究报告随着互联网技术的迅猛发展和教育改革的推进，微课在教育领域逐渐被广泛应用。
本研究准备从微课的定义、特点、优势以及影响因素等方面进行探讨，以期能够全面地了解微课的现状和未来发展趋势。
一、微课的定义微课是一种基于互联网技术的教学模式，通过小型化的课程内容和精确的讲解来实现个性化学习。
微课的特点是时间短、内容精确、形式多样、互动性强。
二、微课的特点1. 时间短：微课通常时间控制在5-15分钟之内，符合学生的注意力持久时间，有利于提高学习效果。
2. 内容精确：微课的内容经过精心筛选和设计，主要针对某一特定知识点进行解释和讲解，能够达到针对性学习的效果。
3. 形式多样：微课可以采用视频、动画、图文等多种形式进行呈现，满足不同学生的学习需求。
4. 互动性强：微课通过强调学生参与和互动，鼓励学生提问和讨论，促进知识的交流与共享。
三、微课的优势1. 个性化学习：学生可以根据自身的学习需求，在自己方便的时间和地点进行学习，实现个性化学习。
2. 时间灵活：微课的时间可以根据学生的学习进度进行调整，不受固定的上课时间限制。
3. 提高效果：微课的精准讲解和多样化的表达方式有助于提高学生的学习效果。
4. 促进互动：微课通过提供学习平台，鼓励学生之间的讨论和互动，促进知识的交流与共享。
5. 教师支持：微课方式可以为教师提供更多的教学资源和支持，提高教学质量。
四、微课的影响因素微课的应用受到多方面的影响，主要包括教育政策支持、师生态度、技术设备和教育资源等因素。
教育政策的支持和推广是微课发展的保障，师生对微课的态度和接受程度也直接影响着微课的应用情况。
此外，技术设备和教育资源的提供与实施也需要充分考虑。
综上所述，微课作为一种新兴的教学模式，具有许多独特的优势和特点。
因此，在教育领域中，推广和应用微课具有重要意义。
然而，在微课的发展过程中，还需关注教育政策的支持、师生态度、技术设备和教育资源等方面的问题，进一步提升微课的应用效果。
crisprcas基因编辑技术原理与应用ppt课件
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
应用
Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞 操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是 CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。
目录
CRISPR/Cas基因编辑技术
发现 原理 应用 优点 缺点 发展 前景
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
发现
在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不 足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现 了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复 核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚 不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在 为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。2000年，相似的重复序列在其 它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列（Short Regularly
What
01
Clustered regularly interspaced
shortpalindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-
associated (Cas) systems
（常间回文重复序列丛集关联蛋白系统）
CRISPR表示成簇的规律间隔的短回文重复序列， 02 而Cas是一种和CRISPR系统相关联的蛋白质、
应用
基因打靶技术在基因功能研究中的应用、研制人类疾病动物 模型、改良动物品系和研制动物反应器等。
基因编辑技术在医学研究中的应用培训课件
全。
拓展应用领域
基因编辑技术有望在更多医学领 域得到应用，如罕见病治疗、器
官移植等。
国际合作与交流
全球范围内的科研机构和企业将 加强合作，共同推动基因编辑技
术的发展和应用。
战略建议提
01
加强技术安全性研究
加大对基因编辑技术安全性研究 的投入，确保技术的安全可控。
03
推动法规政策制定
积极参与国际法规政策的制定和 修订，为基因编辑技术的发展和
经过严格的临床试验和监管审批流程，确 保基因疗法药物的安全性和有效性得到科 学验证和官方认可。
下一代测序技术在药物研发中应用前景
精准医学与个体化治疗
通过下一代测序技术，对患者基因组进 行深度测序和分析，实现精准医学和个
体化治疗策略的制定。
药物基因组学研究
通过测序技术分析药物在基因组水平 上的作用机制和个体差异，为药物研
01
罕见病基因突变分析
利用基因编辑技术对罕见病患者进行基因突变分析，为精准治疗提供依
据。
02
基因编辑技术在复杂疾病中的应用
针对复杂疾病的多个致病基因，利用基因编辑技术进行多靶点治疗，提
高治疗效果。
03
个性化治疗方案设计
根据患者基因突变情况，制定个性化的治疗方案，提高治疗的针对性和
有效性。
04
生物制药产业中基因编辑技术创 新发展动态
细胞治疗产品开发流程简介
细胞来源与选择
根据治疗需求，选择合适的细胞类型，如干细胞 、免疫细胞等。
细胞修饰与改造
利用基因编辑技术，对细胞进行基因修饰或改造 ，以增强其治疗效果或降低副作用。
ABCD
细胞培养与扩增
在体外环境下，对细胞进行培养、扩增，以获得 足够数量的治疗用细胞。
拓展应用领域
基因编辑技术有望在更多医学领 域得到应用，如罕见病治疗、器
官移植等。
国际合作与交流
全球范围内的科研机构和企业将 加强合作，共同推动基因编辑技
术的发展和应用。
战略建议提
01
加强技术安全性研究
加大对基因编辑技术安全性研究 的投入，确保技术的安全可控。
03
推动法规政策制定
积极参与国际法规政策的制定和 修订，为基因编辑技术的发展和
经过严格的临床试验和监管审批流程，确 保基因疗法药物的安全性和有效性得到科 学验证和官方认可。
下一代测序技术在药物研发中应用前景
精准医学与个体化治疗
通过下一代测序技术，对患者基因组进 行深度测序和分析，实现精准医学和个
体化治疗策略的制定。
药物基因组学研究
通过测序技术分析药物在基因组水平 上的作用机制和个体差异，为药物研
01
罕见病基因突变分析
利用基因编辑技术对罕见病患者进行基因突变分析，为精准治疗提供依
据。
02
基因编辑技术在复杂疾病中的应用
针对复杂疾病的多个致病基因，利用基因编辑技术进行多靶点治疗，提
高治疗效果。
03
个性化治疗方案设计
根据患者基因突变情况，制定个性化的治疗方案，提高治疗的针对性和
有效性。
04
生物制药产业中基因编辑技术创 新发展动态
细胞治疗产品开发流程简介
细胞来源与选择
根据治疗需求，选择合适的细胞类型，如干细胞 、免疫细胞等。
细胞修饰与改造
利用基因编辑技术，对细胞进行基因修饰或改造 ，以增强其治疗效果或降低副作用。
ABCD
细胞培养与扩增
在体外环境下，对细胞进行培养、扩增，以获得 足够数量的治疗用细胞。
CRISPR-Cas9-基因编辑技术简介ppt课件
CRISPR基因座的表达（包括转录 和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的crRNA 前体，然后逐步加工成小的成 熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
crRNA结合相关的Cas蛋白后，
形成NA-Cas蛋白复合体，
精选版课件ppt
5
2.CRISPR/Cas系统结构
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
沈彬，2015
精选版课件ppt
18
6.降低脱靶效应
添加同源臂(homology arm,HR)
Yu Hisano et al.2014
精选版课件ppt
19
6.降低脱靶效应
FoKI-dCas9
Nicolas Wyvekens et al.2015
精选版课件ppt
20
6.降低脱靶效应
CRISPR/Cpf1系统
精选版课件ppt
11
4.CRISPR/Cas9系统
酿脓链球菌
精选版课件ppt
12
4.CRISPR/Cas9系统
精选版课件ppt
13
4.CRISPR/Cas9系统
gRNA 在线设计工具：
CRISPR Design Tool: / E-CRISPR: ZiFiT: / Cas9 Design: http://cas9 /index.jsp Cas-OFFinder: /cas-offinder/ CCTop: http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/
细胞生物学CRISPR-CAS9 ppt课件
加拿大盖尔德纳奖
►诺奖风向标：在过去收到这个奖项的320位科学家中，有83位紧接着获得诺奖 ►今年获得该奖项的5位科学家全都来自一个领域：CRISPR-Cas9基因组定点编 辑技术。
加拿大盖尔德纳奖
►获奖理由：开发CRISPR-CAS用于真核细胞的基因编辑
Jennifer Doudna 、张锋、Emmanuelle Charpentier
专利之争
►2013年发表在《科学》杂志上的论文，成为CRISPR-Cas9真核细胞基因 编辑领域发表最早、被引用数量最多的论文之一。 ►张锋通过向专利局证明自己的实验记录而第一个得到相关专利。
专利之争
►“面对这项技术，不会有人轻易退出。站在双方背后的，除了各自的研
究所和大学，更有着数十亿的商业投资和运作。这场仍未有定式的专利纠 纷注定会成为一场旷日持久的争论，也许是一两年，也许更久。”
“ZFN提供了基因组编 辑技术的理论基础，但 TALEN做了ZFN的大部 分工作，且更便宜、更 快、更好。”
基因组编辑上的新生力量， 论文数量在5年间增长了5 倍。
CRISPR/Cas系统元件和特征
►CRISPR：成簇的规律间隔的短回文重复序列
►CRISPR/Cas系统由CRISPR序列元件与Cas基因家族组成
►sg-RNA：single guide RNA
CRISPR-Cas9 as a Genome Engineering Tool.
CRISPR-Cas9 as a Genome Engineering Tool.
CRISPR-Cas9 as a Genome Engineering Tool.
Biology of the type II-A CRISPR-Cas system
CRISPR-Cas9系统原理应用及发展ppt课件
CRISPR-Cas系统基因修饰技术
1
1 CRISPR-Cas概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌 编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时， 发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA 片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的 两端还存在一段不太长的特有的序列。
8
2 CRISPR-Cas系统的发现
9
2 CRISPR-Cas系统的发现
10
2 CRISPR-Cas系统的发现
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免 疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主 防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌 进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是 由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔 序列（spacer）来实现的。
15
3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换
2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的 《RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系 统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向 修饰。
5
1.1 CRISPR结构
6
1.2 Cas家族
Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在
guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
1
1 CRISPR-Cas概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌 编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时， 发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA 片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的 两端还存在一段不太长的特有的序列。
8
2 CRISPR-Cas系统的发现
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2 CRISPR-Cas系统的发现
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2 CRISPR-Cas系统的发现
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免 疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主 防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌 进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是 由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔 序列（spacer）来实现的。
15
3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换
2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的 《RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系 统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向 修饰。
5
1.1 CRISPR结构
6
1.2 Cas家族
Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在
guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
《crisprcas9技术》课件
CRISPR-Cas9的应用
基因组编辑及修补
CRISPR-Cas9技术可以精确的定位基因组中特定位点 进行编辑和修补，是医学、农业、工业等领域中重 要的基因体系。
基因靶向表达
利用CRISPR-Cas9技术的靶向控制基因表达可以实现 治疗疾病、生产有用生物制品等应用。
基因调控
CRISPR-Cas9技术可选择性、有 Nhomakorabea地进行基因调控，
应用前景
• CRISPR-Cas9技术未来将 广泛用于医疗、农业、 工业、环保等领域，成 为生物技术创新的重要
• 推基动于C力R。ISPR-Cas9技术的 新产品、新技术、新应 用也将成为未来投资的 热点领域。
2
编辑系统的工作原理
CRISPR-Cas9通过识别、结合、切割目标基因位点，进一步实现对基因组的编辑 和修补，使基因组发生特定改变，达到治疗或改良目的。
3
PAM序列的特点
PAM序列指的是Cas9靶序列的附近序列，是单导RNA结合Cas9蛋白并定位于靶点 上的关键信息之一，其特点包括长度和序列的多样性。
农业遗传改良
利用CRISPR-Cas9技术对商业作物进行精准改良是未
CRISPR-Cas9技术的局限和挑战
1 异源物质的干扰
2 细胞外的嵌合酶
CRISPR-Cas9技术会受到外部异源物质的干扰， 影响其在目标细胞内的有效性。
CRISPR-Cas9技术需要有效的嵌合酶才能达到 预期效果，因此嵌合酶的研究一直是制约该 技术发展的瓶颈之一。
应用领域
CRISPR-Cas9技术已广泛应用于基因组编辑、基因表达调控、疾病治疗和药物筛选等领域，且 应用前景广阔。
CRISPR-Cas9系统的构成和原理
CRISPRCas9系统工作原理 PPT
一、简介
二、作用过程
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
二、作用过程
• 获得CRISPR的间隔区 • 细菌通过将入侵的噬菌体或质粒的一小段
DNA序列整合到自身基因组的重复序列之 间，即CRISPR 5'端的两个重复序列之间， 从而获得高度可变的间隔区域
• 因此，CRISPR基因座中的间隔序列从5'到3'的 排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。
三、应用与前景
虽然CRISPR/Cas的研究还处于初始阶段， 但是其已经被应用在工业、学术和医疗领域。
工业上：利用该系统构建出具有噬菌体抗性的菌株以
提高奶制品发酵的产量。也能把它的这种特性用于菌株分 类，以及防止某些特殊质粒的扩散，防止基因污染，以保 存菌株。
研究上：CRISPR/Cas系统不仅可以用来进行基因敲
一、简介
• 2、简介：
• 人工核酸酶的原理是一样的，都是由DNA结合蛋白与核酸 内切酶融合而成。
• 2013年初，一种全新的人工核酸内切酶 CRISPR/Cas9 • 它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特
点是制作简单、成本低、作用高效。
一、简介
• CRISPR • 全名：clustered regularly interspaced short palindromic repeats 即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短 重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌胞内起到了一种获得性免 疫（acquired immunity）的作用。 • CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA进行序列特 异性降解。 • 目前已经发现了3种 CRISPR/Cas系统， TypeI，TypeII，TypeⅢ3 ，其中TypeII系统是目前改造最为成功的人工核酸酶，因为其只需一 个Cas9蛋白就能够发挥CRISPR系统的免疫作用
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用PPT精选课件
3. 病毒载体
17
3.1 病毒载体比较
18
3.1 病毒载体比较
19
3.2 病毒载体应用
20 组成型启动子-感染特性决定表达分布
3.2 病毒载体应用
21 特异性启动子-空间和时间精细表达
4 组合应用示例——Cre-loxP与病毒工具结合
22
4.1 Cre-loxP与病毒工具结合应用
23
“条件性基因激活”模式
间发生基因重组。
Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、
环状甚至超螺旋DNA。
loxP位点，是locus of X-over P1的缩写，来自P1噬菌体。间隔序列决定loxP
的方向，如下所示： 13bp
8bp
13bp
ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-
TATACGAAGTTAT
2.4 CRISPR-Cas9技术优势
16
1. CRISPR-Cas9系统的可用位点更多：理论上基因组中每8 个碱基就能找到一个可用CRISPR-Cas9进行编辑的位点，而 TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个 可用位点；
2. CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性：例如可以通过对 Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链， 这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的 染色体变异风险；此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白， 从而在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响；
基因操作技术一览
4
1. Cre-loxP技术简介
5
Cyclization recombinase
Cre蛋白于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。
CreloxP、CRISPRCas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用 ppt课件
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术 与病毒载体在基因敲除中的联用
2016-04-25
2
ppt课件
Content
3
第一节、Cre-loxP技术 第二节、 CRISPR-Cas9技术 第三节、病毒工具简介 第四节、组合应用示例
ppt课件
基因操作技术一览
4
ppt课件
1. Cre-loxP技术简介
工设计这两种 RNA，可以改造形成
具有引导作用的sgRNA （short
guide RNA ）
N代表任意DNA碱基
Cas9:
复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分， Ruvc结构域剪切未配对的链。
ppt课件
2.3 CRISPR-Cas9技术流程
非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ）
ppt课件
新3代基因组编辑工具
12
均由自然界存在的核酸酶系统改造而来 均具有识别核酸碱基特异性的结构域 作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从
而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰
ppt课件
2.1 CRISPR-Cas9技术来源
启动子
Mx1 CMV-tTA CMV-ER
诱导物
IFN tetracycline tamoxifen
Cre表达的靶组织
肝脏、免疫细胞 广泛表达 广泛表达
—MerCreMer重组蛋白
ppt课件
1.3 Cre-loxP技术仍有不足之处
10
ppt课件
2. CRISPR-Cas9技术
传统的基因打靶技术主要依赖于基因同源重组，利用设计的同源臂替 11代靶基因片段，从而达到目的。 但是同源重组在细胞中的发生概率极低，而且步骤比较复杂、耗时间、 费用也比较高。
2016-04-25
2
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Content
3
第一节、Cre-loxP技术 第二节、 CRISPR-Cas9技术 第三节、病毒工具简介 第四节、组合应用示例
ppt课件
基因操作技术一览
4
ppt课件
1. Cre-loxP技术简介
工设计这两种 RNA，可以改造形成
具有引导作用的sgRNA （short
guide RNA ）
N代表任意DNA碱基
Cas9:
复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分， Ruvc结构域剪切未配对的链。
ppt课件
2.3 CRISPR-Cas9技术流程
非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ）
ppt课件
新3代基因组编辑工具
12
均由自然界存在的核酸酶系统改造而来 均具有识别核酸碱基特异性的结构域 作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从
而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰
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2.1 CRISPR-Cas9技术来源
启动子
Mx1 CMV-tTA CMV-ER
诱导物
IFN tetracycline tamoxifen
Cre表达的靶组织
肝脏、免疫细胞 广泛表达 广泛表达
—MerCreMer重组蛋白
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1.3 Cre-loxP技术仍有不足之处
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2. CRISPR-Cas9技术
传统的基因打靶技术主要依赖于基因同源重组，利用设计的同源臂替 11代靶基因片段，从而达到目的。 但是同源重组在细胞中的发生概率极低，而且步骤比较复杂、耗时间、 费用也比较高。
CRISPRCas基因编辑技术简介 ppt课件
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座 上游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与 crRNA的加工，这个 工程亦需要RNaseIII 的参与；
tracrRNA会与crRNA形 成二聚体指导Cas对 双链DNA的切割。
4.CRISPR/Cas9系统
Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能 力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。
4.CRISPR/Cas9系统
4.CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas 作用： 基因 脱靶效应
2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9 目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消 除。
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座 上游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与 crRNA的加工，这个 工程亦需要RNaseIII 的参与；
tracrRNA会与crRNA形 成二聚体指导Cas对 双链DNA的切割。
4.CRISPR/Cas9系统
Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能 力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。
4.CRISPR/Cas9系统
4.CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas 作用： 基因 脱靶效应
2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9 目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消 除。
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
高考生物一轮复习课件—CRISPRCas9技术
跟踪训练
CRISPR/Cas9 基 因 编 辑 技 术 中 ， sgRNA(单向导RNA)是根据靶基因 设 计 的 引 导 RNA ， 准 确 引 导 Cas9 切 割 与 sgRNA 配 对 的 靶 基 因 DNA 序列，CRISPR/Cas9系统进行基因 编辑时，对DNA序列中的原型间 隔序列相邻基序具有较高的编辑 效率，如图所示。回答下列问题：
跟踪训练
基因表达包括转录和翻译两个过 程，因此细菌Cas2基因表达Cas2 的过程需要细菌提供核糖核苷酸 和氨基酸等原料。由题意可知， Cas2和Cas9都能切割DNA，属于 限制性内切核酸酶(或限制酶)。 限制酶能切割DNA分子，催化磷 酸二酯键水解。
跟踪训练
(2)CRISPR/Cas9系统中的sgRNA与 细菌体内的__cr_R_N__A__ 功能相同， 都可以与相应靶基因序列发生碱 基互补配对。细菌利用该防御机 制可以有效抵抗噬菌体的二次入 侵，但是仍然会有部分噬菌体能 够继续侵染已经获得免疫能力的 宿主菌，原因可能是__噬__菌__体__D_N__A_中__的__原__型__间__隔__序__列__发__生__基__因__突__变__，__导___ _致__C_R_I_S_P_R__位__点__形__成__的__cr_R_N__A_无__法__对__其__进__行__识__别___。
跟踪训练
CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA 是根据靶基因设计的向导RNA，能准 确 引 导 Cas9 切 割 与 sgRNA 配 对 的 靶 基 因DNA序列。 Cas9能借助向导RNA与 目标DNA进行精确定位的原因在于向导RNA上的碱基序列与目标DNA分 子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现向导RNA与目标DNA分 子特定序列的特定识别，进而定位；对目标位点的切割则依赖于Cas9蛋白 的专一识别，Cas9蛋白能识别特定核苷酸序列并在特定位点剪切特定的碱 基序列，使磷酸二酯键断裂。
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CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用
CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。
在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。
目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。
Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。
CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。
融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。
通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：
Cas9质粒构建
pGK1.1
设计2条单链oligo序列；退火形成双链DNA
将双链DNA连接到载体中
转化G10competentcell筛选阳性克隆；测序验证序列；质粒大提；电转染靶细胞在细胞内crRNA识别靶位点，Cas9对靶位点进行随机剪切
CruiserTM酶切细胞池，计算突变率；CruiserTM酶切初筛阳性克隆；将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。
目前常见的CAS9普通质粒有（汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）：
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。
病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（lentiCRISPRv2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供CRISPR/cas9慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。
同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。
（汉恒生物提供CRISPR/cas9腺病毒包装）。