分子克隆PPT课件
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植物生物技术研931-分子克隆PPT课件
质粒小、转化率高 质粒大、拷贝数低 ﹥15kb 转化率成为限制因素
分子大小4363bp，容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在 蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以 产生大量的重组pBR322分子。
component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However,
cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and
.
28
Some of the λ gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells.
Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage λ protein coat can be performed using a mixed lysate of
pGEM-3Z 和 pGEM4Z 的差别在于二者 互换了两个启动子 的位置。
作用：体外转录
.
19
质粒的制备
实验室常采用碱法制备质粒
碱裂解法 将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加NaOH与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分 蛋白质
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
基因克隆简介ppt课件
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
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（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
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PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
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⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
15
16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
分子克隆课件
分子克隆目录（一）.基本概念 (2)1.分子克隆： (2)2. Dalton，bp，nt (2)3.保护碱基 (2)4.T-A克隆： (2)5.RNA酶H活性： (2)6.载体： (2)7.质粒(plasmid) (2)8. F因子 (3)9. 位点偏爱（Site preference） (3)10.星星活性： (3)（二）分子克隆的基本过程 (3)1.概述 (3)2.分子克隆中常用工具酶 (3)3.基因克隆常用载体 (7)4.目的基因的分离与制备 (11)5.目的基因的体外重组 (11)6.重组子导入宿主细胞 (12)7.阳性重组子的筛选和鉴定 (13)（三）.单链丝状噬菌体 (14)1.M13 噬菌体的生物学 (14)2. M13 噬菌体载体 (17)3. M13 噬菌体载体的宿主菌 (18)4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 (17)5. 噬菌粒 (11)6. M13KO7 辅助噬菌体 (12)（一）.基本概念1.分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。
2. Dalton，bp，nt道尔顿（Dalton，Dal，Da，D）：分子量的单位，蛋白质是大分子，所以常用kDa（千道尔顿）来表示。
碱基对（bp）＝base pair，1 kb就是1000个碱基对；nt＝核苷酸nucleotide 。
3.保护碱基在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
4.T-A克隆：利用Taq酶在PCR产物3‘末端有加上一个A的特性，使得Taq酶的PCR 产物或经过Taq酶加A的PCR产物，和一个人工加上一个3’末端具有1个T的载体进行连接，由于突出末端可以互补，这样可以大大提高目的基因和载体的连接效率。
分子克隆载体的选择-PPT课件
5. 合适的克隆位点
单克隆位点和多克隆位点
第九节
分子克隆载体的组建
构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点， 标记基因，载体容量等。
1. 克隆位点的建立
1) 体外重组
i. 减少限制酶识别位点 ii. 增加限制酶识别位点： 人工接头，匹配接头
2) 体内重组或突变
i. 减少限制酶识别位点 体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV系 列载体时，去除Kanr 基因中的indIII位点就采用了以下技 术路线： 培养有pNG35的大肠杆菌细胞 提取质粒DNA 用HindIII 完全酶切 转化大肠杆菌 再提取质粒DNA 再酶切，
2. 标记基因的建立
1）启动子 2）编码区—密码子偏爱性，基因产物适用范围 3）终止子
3. 载体容量
尽可能除去无关的DNA序列。
第二章 练习题
1．当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的HindⅢ克隆位 点后，重组质粒仍可转化E.coli (CmlsTcs) 为CmlrTcr ，为什么? 可设计什么实验证明其假设? 2．当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落， 兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳 检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质 粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白 色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果? 可 设计何种实验证明你的解释是正确的? 3．当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化 E.coli 细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类， 即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样， 从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收 插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却
《分子克隆实验设计》PPT课件
二、特点： 1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量
检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
可整理ppt
18
测序验证
一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因
的重组，插入的方向，基因内部的突变 等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
可整理ppt
5
质粒的提取原理－碱裂解法
Protocal:
(1)
初 (2)
(3)
(4)
抽 (5)
(6)
烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
可整理ppt
6
质粒的保存
1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
11
转化
1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h－－Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）－－抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
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酶切电泳筛选(*)
检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
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测序验证
一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因
的重组，插入的方向，基因内部的突变 等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
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质粒的提取原理－碱裂解法
Protocal:
(1)
初 (2)
(3)
(4)
抽 (5)
(6)
烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
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质粒的保存
1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
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转化
1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h－－Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）－－抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
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酶切电泳筛选(*)
ligation independent cloning-分子克隆技术ppt课件
【参考】NusA技术：显著增强大肠杆菌表达可溶、活性蛋白：/experiment/430/465/;2BT Ecoli T7 ColE1-ori LICv1 transfer His6-tev-yORF AMP （全长4876bp）
NUSA标签
NusA融合蛋白表达系统于1999年由Davis发明，并在2000年由Novagen首先进 行商业化设计和开发，特别推荐用于以NusA作为N端标签时提高在大肠杆菌中难 溶的重组表达蛋白的可溶性。
已有充分的证据证明NusA标签系统能显著提高多种不同来源蛋白的可溶性表达， 而这些蛋白在单独表达时往往形成不可溶的包涵体。在一些研究报告中，用蛋白 酶切除NusA标签能使目的蛋白仍保持正确折叠和生物学活性；相反，在另外许多 报道中也指出当目的蛋白与NusA融合而非切除时，融合蛋白也同样具有活性。 NusA标签系统的成功至少部分地是由于其与大肠杆菌分子伴侣系统相互作用的结 果。
Aslanidis和de Jong (1990)在1990年所提出的 不依赖连接反应克隆(ligation-independent cloning, LIC)充分满足了上述要求。这种方式不 仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点，而且 操作简便、方法快捷及连接效率高，应用日益广 泛。
在T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种特
Vector
Tag
2BT 2CT 2GT 2NT 2ST
His6-tev-yORF His6-MBP-N10-tev-yORF His6-GST-tev-yORF His6-NusA-tev-yORF His6-Sumo-tev-yORF
Expression Host
E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7
《分子克隆》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶电泳法筛选第六节重组dna分子的操作过程118限制性内切酶dna连接酶基因载体目的基因染体外包装带重组体的宿主细胞表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达119农业应用获得高产稳产和具有优良品质的农作物向日葵培育具有抗逆性的作物新品种抗虫抗病毒抗除草剂抗盐碱抗高温抗干旱第七节基因工程的应用培育体形巨大品质优良的动物超级小鼠超级绵羊超利用特定的外源基因在哺乳动物体内表达获得人们需要的物质激素抗体酶食品工业开辟新是食品来源鸡蛋白基因导入大肠杆菌和酵母菌中畜牧养殖业120世界上第一只转基因动物能产药的奶牛转基因羊转基因鱼上面121本章结束本章结束此课件下载可自行编辑修改供参考
ppt课件
7
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
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8
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
ppt课件
35
第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
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第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
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第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
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第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
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变性
95˚C
延伸 70-75˚C
退火
Tm-5˚C
13
P1 第 一 次 循 环
94℃ 72℃
Taq DNApol.
P2
（35-65℃）
94℃
第 二 次 循 环
14
PCR技术最关键的两步
• 引物的设计 引物必须相应于模板分子相邻的序列，引 物序列于对应的模板连应该是互补而不是 相同的，这样杂交才会发生且杂交后的引 物的3‘末端应该对着另一条引物的3’末 端。最重要的是引物的长度，因为引物的 长度影响其杂交到模板DNA上去的效率，引 物越长杂交所需的时间越长；引物太短可 能与目标位点以外的位点相杂交，而扩增 出我们并不需要的产物
7
噬菌体载体
λ噬菌体 一种典型的头-尾结构，双链线状DNA分子，全长50kb，含66个基 因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末 端，被称为COS位点
M13噬菌体
一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长度 仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA
8
λ噬菌体结构
15
2019/9/19
16
• 退火温度 温度太高，不会有杂交发生引物与模板仍 然相互分离；温度太低，又会有稳定的错 误配对发生。退火温度有引物-模板杂交结 构的解链温度(Tm)决定，Tm是指正确的碱 基配对杂交结构相互分开的温度 Tm={(4*[G+C])+(2*[A+T])}˚C
17
DNA操作酶
21
重组DNA导入宿主细胞的类型
转化：以质粒作载体构建的重组体 导入受体细胞的过程
类 转染：以病毒作载体构建的重组体 型 导入受体细胞的过程
转导：以噬菌体作载体构建的重组 体导入受体细胞的过程
22
• 感受态细胞 受 体 细 胞 经 过 一 些 特 殊 方 法 （ 如 CaCl 、 RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的 通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的细胞
dNTP为原料，按碱基配对方式，从 杂交链中的RNA ⑶ 以DNA为模板，
5’-3’ 方 向 合 成 新 的 DNA 链 。 催化合成cDNA双链
TaqDNA聚合酶在70～75℃时具有最
18
佳的生物活性
DNA重组技术
分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选与鉴定
4
有时还要求载体要能启动外源 基因进行转录及表达，并且尽 可能是高效的表达
载体的特性
5
从安全角度考虑，要求载体不 能随便转移，仅限于在某些实 验室内特殊菌种内才可复制
6 有适合的标记，易于选择
5
克隆载体
1 质粒载体 2 噬菌体载体 3 酵母菌质粒载体 4 动植物病毒载体
6
质粒载体
• 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一 般大小约为数千碱基对，可自身复制和表达，有 的质粒还带有可做 为选择性标记的抗 药性基因，所以质 粒经过适当改选后 便可成为良好的载 体
分子克隆
报告人：
LOGO
1
C
o
克隆载体
n
t
PCR技术
e
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DNA操作酶 LOGO
t
s
DNA重组技术
2
分子克隆
• 分子克隆（基因克隆、DNA重组技术） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、 连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩 增形成大量子代分子的过程。分子克隆的 核心是：体外重组即人工将一段目的DNA插 入一个载体的过程
A 限制性内切酶
是一类由细菌产生的能专一识别和 切割双链DNA中的特定碱基序列的 核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据限制酶作用特性，一般分为Ⅰ、 Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制 酶
B T4DNA连接酶
催化双链DNA中一条链的3ˊ－OH与 另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二 酯键，从而构成完整的DNA长链
• 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有 一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬 菌体的DNA注入细菌内
9
cos位点的作用
• cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截 然不同的作用
使已经注入细胞的线性DNA分子闭合成环，这是使噬菌体 DNA分子插入细菌基因组的必要先决条件
当前噬菌体被从宿主细胞中切除后，此时其作为一个限制性 内切核酸酶的识别序列
10
λ噬菌体的侵染模式
11
M13噬菌体的侵染过程
• M13以纤毛吸附大肠杆菌，并向其注入自身DNA
单链DNA注入宿主细胞后，合成第二条链(双链复 制模式 RF)
RFDNA拷贝数达到100～200个后 ,通过滚环复制机 制产生线状单链DNA
包装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢出
。
12
PCR的基本反应步骤
3
分子克隆的路线
载体DNA （vector）
重组DNA （recombinant DNA ）
目的DNA DNA 重组
（target fragment）
转化
宿主（host）
筛选、扩增
克隆（clone）
4
载体的特性
1
分子较小，可携带比较大的DNA片段
2
能独立于染色体而进行自主 复制并且是高效的复制
3 要有尽可能多种限制酶的切 割位点，但每一种限制酶又 要最少的切割位点
C TaqDNA聚合酶
D 逆转录酶
TaqDNA聚合酶是一种依赖DNA的单 逆转录酶是一个多功能性酶，至少
亚基耐热DNA聚合酶， 主要用于聚 具 有以下 3种酶 活性： ⑴ 以单 链
合酶链式反应中，能以DNA为模板， RNA为模板，催化合成cDNA单链 ⑵
从 结 合 在 模 板 上 的 引 物 出 发 ， 以 具有 RNaseH活性 ，能水解 RNA:DNA
19
目的基因的来源
Con 制备基因组DNA ten ts
聚合酶链反应
目的基因 来源
Con 制备cDNA ten ts
人工合成基因
.
20
目的基因与载体的连接
粘性 末端 连接
平头 末端 连接
人工 接头
法
同源多 聚尾连 接法
将目的基因和 载体用同一种 限制酶酶切， 产生相同粘性 末端，再通过 DNA连接酶作 用将两者连接 起来，构成重 组DNA分子
有些限制酶 只能将目的 基因和载体 DNA切割成平 端，此时在 T4DNA连接 酶的作用下 同样能连起 来。
合成连接子 →与DNA平 头末端连接 →限制酶切 割,产生粘 性末端→连 接，构建重 组DNA。
2019/9/19
可编辑
要求DNA分子内 部必须完整， 即两个DNA链间 不存在缺口； 否则末端脱氧 核苷酸转移酶 也会在3’-OH 上加入多聚尾 巴，破坏了DNA 分子活性
95˚C
延伸 70-75˚C
退火
Tm-5˚C
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P1 第 一 次 循 环
94℃ 72℃
Taq DNApol.
P2
（35-65℃）
94℃
第 二 次 循 环
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PCR技术最关键的两步
• 引物的设计 引物必须相应于模板分子相邻的序列，引 物序列于对应的模板连应该是互补而不是 相同的，这样杂交才会发生且杂交后的引 物的3‘末端应该对着另一条引物的3’末 端。最重要的是引物的长度，因为引物的 长度影响其杂交到模板DNA上去的效率，引 物越长杂交所需的时间越长；引物太短可 能与目标位点以外的位点相杂交，而扩增 出我们并不需要的产物
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噬菌体载体
λ噬菌体 一种典型的头-尾结构，双链线状DNA分子，全长50kb，含66个基 因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末 端，被称为COS位点
M13噬菌体
一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长度 仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA
8
λ噬菌体结构
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• 退火温度 温度太高，不会有杂交发生引物与模板仍 然相互分离；温度太低，又会有稳定的错 误配对发生。退火温度有引物-模板杂交结 构的解链温度(Tm)决定，Tm是指正确的碱 基配对杂交结构相互分开的温度 Tm={(4*[G+C])+(2*[A+T])}˚C
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DNA操作酶
21
重组DNA导入宿主细胞的类型
转化：以质粒作载体构建的重组体 导入受体细胞的过程
类 转染：以病毒作载体构建的重组体 型 导入受体细胞的过程
转导：以噬菌体作载体构建的重组 体导入受体细胞的过程
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• 感受态细胞 受 体 细 胞 经 过 一 些 特 殊 方 法 （ 如 CaCl 、 RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的 通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的细胞
dNTP为原料，按碱基配对方式，从 杂交链中的RNA ⑶ 以DNA为模板，
5’-3’ 方 向 合 成 新 的 DNA 链 。 催化合成cDNA双链
TaqDNA聚合酶在70～75℃时具有最
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佳的生物活性
DNA重组技术
分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选与鉴定
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有时还要求载体要能启动外源 基因进行转录及表达，并且尽 可能是高效的表达
载体的特性
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从安全角度考虑，要求载体不 能随便转移，仅限于在某些实 验室内特殊菌种内才可复制
6 有适合的标记，易于选择
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克隆载体
1 质粒载体 2 噬菌体载体 3 酵母菌质粒载体 4 动植物病毒载体
6
质粒载体
• 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一 般大小约为数千碱基对，可自身复制和表达，有 的质粒还带有可做 为选择性标记的抗 药性基因，所以质 粒经过适当改选后 便可成为良好的载 体
分子克隆
报告人：
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1
C
o
克隆载体
n
t
PCR技术
e
n
DNA操作酶 LOGO
t
s
DNA重组技术
2
分子克隆
• 分子克隆（基因克隆、DNA重组技术） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、 连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩 增形成大量子代分子的过程。分子克隆的 核心是：体外重组即人工将一段目的DNA插 入一个载体的过程
A 限制性内切酶
是一类由细菌产生的能专一识别和 切割双链DNA中的特定碱基序列的 核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据限制酶作用特性，一般分为Ⅰ、 Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制 酶
B T4DNA连接酶
催化双链DNA中一条链的3ˊ－OH与 另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二 酯键，从而构成完整的DNA长链
• 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有 一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬 菌体的DNA注入细菌内
9
cos位点的作用
• cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截 然不同的作用
使已经注入细胞的线性DNA分子闭合成环，这是使噬菌体 DNA分子插入细菌基因组的必要先决条件
当前噬菌体被从宿主细胞中切除后，此时其作为一个限制性 内切核酸酶的识别序列
10
λ噬菌体的侵染模式
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M13噬菌体的侵染过程
• M13以纤毛吸附大肠杆菌，并向其注入自身DNA
单链DNA注入宿主细胞后，合成第二条链(双链复 制模式 RF)
RFDNA拷贝数达到100～200个后 ,通过滚环复制机 制产生线状单链DNA
包装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢出
。
12
PCR的基本反应步骤
3
分子克隆的路线
载体DNA （vector）
重组DNA （recombinant DNA ）
目的DNA DNA 重组
（target fragment）
转化
宿主（host）
筛选、扩增
克隆（clone）
4
载体的特性
1
分子较小，可携带比较大的DNA片段
2
能独立于染色体而进行自主 复制并且是高效的复制
3 要有尽可能多种限制酶的切 割位点，但每一种限制酶又 要最少的切割位点
C TaqDNA聚合酶
D 逆转录酶
TaqDNA聚合酶是一种依赖DNA的单 逆转录酶是一个多功能性酶，至少
亚基耐热DNA聚合酶， 主要用于聚 具 有以下 3种酶 活性： ⑴ 以单 链
合酶链式反应中，能以DNA为模板， RNA为模板，催化合成cDNA单链 ⑵
从 结 合 在 模 板 上 的 引 物 出 发 ， 以 具有 RNaseH活性 ，能水解 RNA:DNA
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目的基因的来源
Con 制备基因组DNA ten ts
聚合酶链反应
目的基因 来源
Con 制备cDNA ten ts
人工合成基因
.
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目的基因与载体的连接
粘性 末端 连接
平头 末端 连接
人工 接头
法
同源多 聚尾连 接法
将目的基因和 载体用同一种 限制酶酶切， 产生相同粘性 末端，再通过 DNA连接酶作 用将两者连接 起来，构成重 组DNA分子
有些限制酶 只能将目的 基因和载体 DNA切割成平 端，此时在 T4DNA连接 酶的作用下 同样能连起 来。
合成连接子 →与DNA平 头末端连接 →限制酶切 割,产生粘 性末端→连 接，构建重 组DNA。
2019/9/19
可编辑
要求DNA分子内 部必须完整， 即两个DNA链间 不存在缺口； 否则末端脱氧 核苷酸转移酶 也会在3’-OH 上加入多聚尾 巴，破坏了DNA 分子活性