Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗的试制及质量评价

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鸡源血清4_型禽腺病毒的分离鉴定与组织灭活苗免疫效果研究

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报鸡源血清4型禽腺病毒的分离鉴定与组织灭活苗免疫效果研究摘要：山东某养殖场肉鸡发生以心包积液、出血性肝炎为特征的疾病，临床初步诊断为心包积液综合征，为确诊该病，我们通过病毒鸡胚培养、PCR 扩增测序、Hexon 基因序列比对与同源性分析及动物回归试验等对病毒培养物进行鉴定，确定分离株为血清4型禽腺病毒，毒株Hexon 基因序列与公开发表的FAdV-4型代表株处于同一分支上，动物回归试验能完全复制出与自然感染鸡相同的症状与病变。

取病死鸡肝组织制备组织灭活苗，免疫后测定琼扩抗体并进行免疫保护试验，结果显示：免疫后14 d 可检测到琼扩抗体（40%），至21 d 抗体阳性率达100%；接种后4 d 开始产生保护（25%），21 d 可产生完全保护；对发病鸡群进行紧急接种，可在6 d 左右完全控制本病。

该研究结果为探究我国FAdV 的分子流行情况与防控提供了基础材料和理论依据。

关键词：血清4型禽腺病毒；分离鉴定；组织灭活苗；免疫效果中图分类号： S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）03-0062-05I solation and Identiﬁ cation of a Fowl Adenovirus Serotype 4 Strain from C hickenBroilers and Efﬁ cacy of I nactivated Tissue VaccineLI Jing 1, GE Chunyan 2, LI Jianuan 1(1. Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College, Weifang 261061, China; 2. Wendeng district Animal Husbandry andVeterinary Technical Service Centre, Weihai 264400, China)收稿日期：2020-12-15基金项目：潍坊市科学技术发展计划项目（2017GX057）；潍坊市科学技术发展计划项目（2020GX047）作者简介：李婧，女，硕士，副教授，主要从事禽病教学与研究通信作者：靖吉强，E-mail：*****************Abstract: A disease characterized as sudden death, hydropericardium and liver necrosis emerged on a chicken farm in Shandong province. In order to diagnose this case, the liver samples were collected from dead chickens for virus isolation by embryo inoculation and the isolated virus were characterized by PCR, Hexon gene sequencing, homology analysis and animal inoculation. The results showed that the isolated virus belonged to F owl adenovirus type 4 (FAdV-4). The hexon gene sequence of this isolate was grouped in the same branch as the published FADV-4 representative strain. Animal experiment reproduced the same clinical signs and pathological changes as naturally infected chickens. In order to prevent and control the disease, an inactivated tissue vaccine was prepared using livers of dead chickens and tested for its immunoprotective effect. Blood samples were collected at 4, 7, 14 and 21 days post immunization to detect their antibodies by AGP detection. At the same time, the vaccinated chickens were challenged to observe the protective effect. The results showed that the antibody was detected 14 days post immunization (40%), and the antibody positive rate reached 100% at 21 days. The onset of protection was observed in 25% chickens at 4 days post immunization (25%), and then protection rates increased to 40%, 80% and 100% at 7, 14 and 21 days. In addition, the emergency vaccination for other chickens completely stopped the disease in 6 days.Key words: Fowl adenovirus; isolation and identiﬁcation; tissue vaccine; efﬁ cacy 2023,31(3):62-66李婧1，葛春艳2，李佳暖1（1.山东畜牧兽医职业学院，潍坊261061；2.威海市文登区畜牧兽医技术服务中心，威海264400）· 63 ·李婧等：鸡源血清4型禽腺病毒的分离鉴定与组织灭活苗免疫效果研究第31卷第3期禽腺病毒（Fowl adenovirus, FAdV）属于腺病毒科禽腺病毒属，是鸡、鸭、鹅等禽类体内的常见病毒。

Ⅰ群禽腺病毒（4_型）Fiber-2_蛋白亚单位疫苗与全病毒灭活疫苗的免疫效果比较

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：为了比较不同抗原含量的Ⅰ群禽腺病毒（4型）Fiber-2蛋白亚单位疫苗与全病毒灭活疫苗的免疫效力差异，本研究制备不同抗原含量的亚单位疫苗和全病毒灭活疫苗，采用超低免疫剂量20 μL/只免疫SPF 鸡，免疫21 d 后攻毒，通过死亡率、临床症状、大体剖检病变、免疫组化和泄殖腔拭子排毒等进行免疫效力比较。

试验结果表明，亚单位疫苗抗原含量AGP 效价不低于1∶8，全病毒灭活疫苗抗原含量为107.0 TCID 50/0.1 mL 时，可抵抗Ⅰ群禽腺病毒（4型）强毒株的攻击，提供100%的免疫攻毒保护，攻毒后3、5、7 d 泄殖腔拭子均未见排毒，且免疫组化均为阴性。

亚单位疫苗抗原含量AGP 效价为1∶4，全病毒灭活疫苗抗原含量为106.5 TCID 50/0.1 mL 时，在超低免疫剂量情况下，仍可提供至少80%的免疫攻毒保护，且攻毒后3、5、7 d 泄殖腔拭子排毒率仅为2/10～3/10，免疫组化阳性率仅为1/10。

但全病毒灭活疫苗抗原含量为106.0 TCID 50/0.1 mL 时，免疫攻毒保护效果不理想。

综合以上结果表明，Fiber-2蛋白具有良好的免疫原性，抗原含量AGP 效价不低于1∶4，与全病毒灭活疫苗抗原含量为106.5 TCID 50/0.1 mL 免疫效力相当，可用于疫苗研制开发。

关键词：禽腺病毒；Fiber-2蛋白；亚单位疫苗；全病毒灭活疫苗；免疫攻毒保护中图分类号：S859.797 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）03-0067-07Comparison of Immune Effect with Subunit Vaccine for Fiber-2 Protein Fowl Adenovirus Serotype 4 of Group I and Whole Virus Inactivated VaccineDU Dongying, HUO Huanyan, TIAN Hui, WANG Lulu, WANG Mengyue, HONG Sumei,GAO Xiaojing, TIAN Kegong(National Research Center for Veterinary Medicine, Luoyang 471000, China)收稿日期：2023-03-10基金项目：河洛创新人才（224100510007）作者简介：杜东颖，女，硕士，兽医师，主要从事禽病毒病疫苗研究；霍环艳，女，本科，主要从事禽病毒病疫苗研究通信作者：高晓静，E-mail：**********************.cn；田克恭，E-mail：**************Ⅰ群禽腺病毒（4型）Fiber-2蛋白亚单位疫苗与全病毒灭活疫苗的免疫效果比较杜东颖，霍环艳，田辉，王璐璐，王孟月，洪素梅，高晓静，田克恭（国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳471000）2023,31(3):67-73Abstract: In order to compare the difference of immune efficacy between Group I Avian adenovirus (type 4) Fibre-2 protein subunit vaccine and whole virus inactivated vaccine with different antigen content, this study prepared subunit vaccine and whole virus inactivated vaccine with different antigen content, immunized SPF chicken with ultra-low immune dose of 20 μL/bird, and challenged for 21 days after immunization. The immune efficacy was compared by mortality, clinical symptoms, gross biopsy, immunohistochemistry and cloacal swab detoxification. The results showed that when the subunit vaccine antigen content AGP titer was no less than 1∶8 and the whole virus inactivated vaccine antigen content was 107.0 TCID 50/0.1mL, it could resist the attack of Group I avian adenovirus (type 4) strong strain and provide 100% immune challenge protection. No detoxification was observed in cloacal swabs 3, 5, 7 days after challenge. The results of immunohistochemistry were negative. When the subunit vaccine antigen content AGP was 1∶4 and the whole virus inactivated vaccine antigen content was 106.5 TCID 50/0.1mL, it could still provide at least 80% immune challenge protection中国动物传染病学报· 68 ·2023年6月鸡肝炎-心包积液综合征（h e p a t i t i s-hydropericardium syndrome, HHS）是由血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4）引起的高致病性传染病[1]，近几年来，该病在我国广泛流行，给我国养禽业造成了巨大的经济损失，目前已成为危害养禽业的主要疫病之一[2-4]。

鸡腺病毒Ⅰ群血清4型的分离鉴定与防治

病及分子流行病学的研究。 Email：Wangyouling71@163. com 。
鸡出现发热、精神沉郁、嗜睡，羽毛脏乱无光泽症状（图 1）。食欲无明显降低，鸡群普遍腹泻，拉黄绿色稀便、黄疸、冠髯苍白、衰弱等。发病鸡常在 24~48h 内死亡，病程约 10d，死亡率可达 60%。
本病初期，基本无可见临床症状，仅见个别身体状况良好的鸡突然倒地死亡。 2~3d 后可见有些
收稿日期：2016-09-05
*基金项目：山东省科技发展计划项目资助：鸽瘟病毒的
流行病学与防控技术研究（No.2013GNC11026）。
** 通讯作者：王友令，博士，副研究员，主要从事家禽疫
鸡Ⅰ群腺病毒（FAV-Ⅰ ）为腺病毒科，禽腺病毒属病毒，广泛存在于多种家禽的眼睛、上呼吸道及消化道内，大多数呈隐性感染或与其他疾病共同作用引起家禽发病或死亡 [1]。 2015 年以来在我国北方鸡群内流行一种以心包积液、肝脏肿大出血为特征的疾病，发病率呈上升趋势，经研究证实为腺病毒感染，俗称安卡拉病，也称心包积液综合征。本病毒属于禽腺病毒Ⅰ群血清 4 型，与包涵体肝炎都属于Ⅰ亚群禽腺病毒。主要感染 1~3 周龄商品白羽肉鸡、817 肉鸡、麻鸡，青年鸡和产蛋鸡感染后症状较轻，给当前家禽养殖业带来巨大危害。
结果：标准抗原孔与阳性血清孔之间出现 1 条清晰的乳白色沉淀线，与阴性血清孔之间无沉淀线出现，待检孔与阳性血清孔之间出现 1 条清晰的沉淀线，且和标准抗原孔与对照阳性血清孔之间的沉淀线相吻合者。证实为禽Ⅰ群腺病毒血清 4 型感染。 3 防治措施 3.1 加强饲养管理，严格卫生消毒腺病毒广泛存在于鸡群中，一般很少发病，但是在免疫抑制时可能会出现临床症状。因此，养殖者必须做好隔离消毒工作，加强饲养管理，减少忽冷忽热、断喙、突然换料等可控的应激因素[3]。选用有效消毒药搞好环境卫生的消毒，同时减少各种应激因素，使鸡群在良好的饲养条件下处于最佳的生长发育和生产状态，尽量降低损失，才能增加经济效益。 3.2 重视生物安全，控制种源选择鸡场要重视养殖场的生物安全，控制种苗来源，在引种过程中，要避免从疫区引进种蛋和雏鸡，并加强检疫和

Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定与通用PCR检测及FAdV-4油乳剂灭活疫苗的研制

Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定与通用PCR检测及FAdV-4油乳剂灭活疫苗的研制采集山东省、江苏省发病肉鸡、蛋鸡、麻鸭的病料,用SPF鸡胚分离了14株FAdV毒株,病毒均不能凝集鸡红细胞,56℃、65℃处理30 min后病毒失活,pH3与pH9条件下处理60 min不完全失活,能够抵抗4.4%体积的氯仿4℃处理10 min;对Hexon蛋白部分基因进行测序分析与PCR-RELP定位病毒血清型,其中11株为FAdV-4血清型,其它3株分别为FAdV-8a、8b、11血清型;选择FAd V A-E 5个种12个血清型病毒DNA聚合酶基因高度同源序列设计引物,建立了一种理论上可通用检测FAdV的PCR方法,具有敏感、特异、快速等特点,可检测2.8×102拷贝及以上的病毒DNA,对鸡易感的DNA病毒EDSV、MDV、FPV检测均为阴性,检测阳性的新鲜病料均能分离到病毒,SPF鸡感染病毒后心、肝、脾、肺、肾、腺胃与肌肉样品检测均为阳性;克隆了FAdV-4分离株Hexon蛋白基因,其ORF均为2814 bp,编码937个氨基酸,与已发布的4型病毒核苷酸、氨基酸序列高度同源,核苷酸序列同源性在97.1%99.7%之间,氨基酸序列与PK-01株同源性高达99.8%,遗传进化树分析表明,我国流行的FAdV-4毒株分属独立的基因群体。

选择分离的4个血清型病毒回归感染SPF鸡,发病症状、剖检病变与临床病例一致,即表现为羽毛蓬乱、呆滞、鸡冠苍白,有的在24天后耐过恢复,剖检病死鸡可见典型心包积水、包涵体肝炎、肾脏肿胀,部分呈现腺胃出血、肌胃溃疡糜烂。

将分离的FAdV-4病毒肌肉注射攻击SPF鸡,并测定病毒ELD50,结果表明,毒株致死率差异大,自40%到100%不等,ELD50同样差异较大,高的达10-7.84ELD50/0.2 mL,低的仅为10-5.0ELD50/0.2 mL,根据SPF鸡攻毒与ELD50测定结果,选择FAdV-4-sdbc-1作为制备灭活疫苗的候选毒株。

Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗的试制及质量评价

Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗的试制及质量评价1987年,一种由禽腺病毒(Fowl aviadenoviruses,FAdVs)引起的心包积水肝炎综合征(Hydropericardial hepatitis syndrome,HHS)为典型病理变化的疾病在巴基斯坦靠近卡拉奇的安卡拉地区被发现,故该病又称为安卡拉病、安哥拉病(Angola’s disease,ADV)、荔枝病,经鉴定病原为禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)。

2015年6月以来,该病在我国安徽、河南、辽宁、山东、吉林、河北等部分地区暴发,死亡率高达20%~30%,给我国的养禽业带来了较大的损失。

近几年,在国内报道的主要流行株是血清4型和8b型禽腺病毒,其中血清4型毒株占据主导地位,而目前市场上没有正规商品化疫苗进行针对性预防。

因此,血清4型的疫苗研制对防控该病就显得尤为重要。

1.禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype-4,FAV-4)的培养方式选择:为了能够加快试制进度,避免中间试制过程出现阻碍,在试制开始之前,需要对FAdV-4进行初步的培养特性研究,以选择一种最佳的培养扩毒载体。

当前疫苗企业在大生产过程中培养禽病毒的主要方式有两种,一是鸡胚扩毒,二是细胞扩毒,两种方式各有其优缺点。

但是,FAdV-4究竟适合哪种方式培养扩毒,需要通过试验来获悉。

本试验通过接种无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)鸡胚与鸡肝癌细胞(LMH细胞)两种方式培养FAdV-4,结果发现从培养的效果来看,接种SPF鸡胚培养FAdV-4,会随着传代次数的增多,病毒的效价会逐渐降低,通过接种卵黄囊能获得较高的效价,通过尿囊腔接种培养获得的FAdV-4病毒液效价并不高。

但,实际的大生产,通过卵黄囊接种的方式比通过尿囊腔接种的方式效率低,不利于后期大生产。

通过LMH细胞培养扩毒,不仅可以连续培养,传代次数的增多对病毒效价的影响不大,而且LMH细胞培养扩毒,能够获得较高的病毒效价。

Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体实验室产品制备

Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体实验室产品制备于洪涛;赵丽;王昊【摘要】试验应用自行分离鉴定的Ⅰ群4型禽腺病毒HY株,制备了3批Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体,并进行了性状、装量、无菌、支原体、外源病毒、安全、效力、甲醛和辛酸残留量检测.试验结果表明,试制的3批卵黄抗体呈淡黄色澄明液体;装量符合规定标准要求;无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染,安全性好,预防效果好.【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】5页(P36-40)【关键词】卵黄抗体;实验室产品【作者】于洪涛;赵丽;王昊【作者单位】哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨150069【正文语种】中文【中图分类】S852.65;S83腺病毒是全球家禽和野禽常见的传染病原之一[1-3]。

多数腺病毒可在健康禽体内存在并复制，不表现临床症状或临床症状非常轻微，但可成为混合感染时的条件性病原；腺病毒有时也可作为原发性病原，引起禽类的多种病症[4-6]。

腺病毒可分为A、B、C、D、E 5个种12个血清型，我国主要流行A、B、C 3种基因型，共6个血清型（火鸡1型、1型、4型、5型、8a/b型），但是近期在豫南、皖北、苏北、鲁西北和胶东地区流行的禽腺病毒主要是血清4型和8a/b型，造成鸡群的死亡率较高，并且发病急，有蔓延的趋势。

安卡拉病（心包积水-肝炎综合征）就是由Ⅰ群腺病毒，血清4型引起来的。

该病多发于肉鸡，近期也开始感染麻鸡以及产蛋鸡的育成鸡，并且育成鸡发病死亡率还非常高。

Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型交叉保护性较差，因此在防控上必须选用与流行株匹配的疫苗株和卵黄抗体才能有效遏制疫情的蔓延。

并目前市场上没有商品化的疫苗或卵黄抗体，我公司通过自行分离的Ⅰ群4型禽腺病毒HY株，制备免疫原免疫蛋鸡，制备了3批Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体实验室制品，并且经过检验，该3批制品有较好的安全性及效力，为公司下一步申报该产品的新兽药注册证书奠定基础。

禽Ⅰ群腺病毒血清4型感染的诊断与防治

图1 病死鸡心包积液、肝色浅质脆、肿大充血二、病理剖检病变IBH 特征性病理剖检变化表现在肝脏和骨髓。

肝脏肿大，边缘钝圆，表面有不同程度的出血点或条索状出血斑，质脆，褪色，呈淡黄色，胆囊充盈，内有大量胆汁淤积。

偶尔可见肝脏有大小不一的坏死灶，并伴随血细胞浸润，使肝脏触之有凹凸不平的感觉。

骨髓呈灰白色或黄色胶冻样病变、体积变小，法氏囊萎缩，内膜有出血点或出血斑，且切面无光泽。

胸腺点状出血、萎缩、且颜色变深。

脾脏体积变化不大，偶见个别病例脾脏肿大、出血。

肾脏呈灰白色、肿大，表面有癖斑和疲点。

肺充血、水肿，除此之外，可见大腿部肌肉、胸肌以及皮下组织图2 病死鸡的心、肝、法氏囊、肾、脾、肺病理切片四、实验室诊断1.引物的设计合成。

根据 GenBank 中已发表的Ⅰ群禽腺病毒 Hexon 基因核酸序列设计完成两对引物，预计扩增片段为500 bp。

上游引物为P1: 5'CGAGGTCTATACCAACACG-AGCA-3';下游引物为P2: 5'-CGGCGCAGG TTAA-TGAAGTTATC-3'。

引物由吉林库美生物工程技术有限公司合成。

2.病毒分离与鉴定。

取疑似鸡包涵体肝炎病鸡的肝脏剪碎，按 1∶5（W/V）比例加入灭菌PBS进行匀浆处理，将匀浆液反复冻融 3次，4 000 r/min离心30 min，取上清液备用。

上清液中加双抗（青霉素、链霉素）各3 000 U/ml，置4℃过夜，以8 000 r/min离心10 min，取制备的上清液以卵黄囊途径接种5日龄SPF 鸡胚，0.2 ml/胚，于 37℃孵育，每日观察2次，收获 24～144 h内死亡的鸡胚尿囊液，收集死胚尿囊液，进行HA试验及PCR鉴定。

3.病毒DNA的提取及PCR扩增。

病毒液采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA DNA Extraction Kit Ver.5.0 提取试剂盒，按说明书进行病毒DNA的提取。

Ⅰ群禽腺病毒FAdV-4 SN2016株的分离与鉴定

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：本研究对疑似禽腺病毒感染的鸡病料进行了病毒分离、PCR 扩增基因与序列分析以及动物回归试验。

结果显示：分离的病毒为球形、无囊膜，直径在70～80 nm ，不具有凝集红细胞能力；毒株基因组全长43 634 bp ，与Ⅰ群禽腺病毒同源性介于95.8%~99.7%，与Ⅱ群和Ⅲ群禽腺病毒同源性为34.4%~37.3%；毒株对3周龄SPF 鸡的致死率为100%，死亡鸡可见典型的心包积液与包涵体肝炎症状，肝细胞染色可见嗜碱性包涵体。

结果表明，本研究成功分离到1株Ⅰ群禽腺病毒C 基因型血清4型病毒，命名为FAdV-4 SN2016，为下一步疫苗研制提供了坚实的物质基础。

关键词：分离与鉴定；Ⅰ群禽腺病毒；同源性；回归试验中图分类号：S852.659.1文献标志码： A文章编号：1674-6422（2021）06-0028-07Isolation and Identiﬁ cation of Ⅰ Group Fowl Adenovirus FADV-4 SN2016 StrainREN Shifei 1, CHI Lan 1, ZHANG Linji 1, LI Xinhai 1, W ANG Y uyan 1, WU Yantao 2, HU Maozhi 3(1. Xuzhou Vocational College Of Bioengineering, Xuzhou 221006, China; 2. College of Vaterinary Medicine, Yangzhou University,Yangzhou 225009, China; 3. Analysis and Test Center of Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)收稿日期：2019-06-15基金项目：徐州市科技局农业科技农业高技术攻关项目（KC16NG062）作者简介：任士飞，男，硕士，主要从事畜禽传染病研究；迟兰，女，硕士，主要从事畜禽传染病研究通信作者：Ⅰ群禽腺病毒FAdV-4 SN2016株的分离与鉴定任士飞1，迟兰1，张林吉1，李心海1，王玉燕1，吴艳涛2，胡茂志3（1.徐州生物工程职业技术学院，徐州221006；2.扬州大学兽医学院，扬州225009；3.扬州大学分析测试中心，扬州225009）2021,29(6): 28-34Abstract: Viral isolation and identiﬁ cation was performed using the materials collected from sick chicken suspect with the infection of Fowl adenoviruses. A serotype 4 Fowl adenovirus designated as FAdV-4 SN2016 was isolated through inoculation of the liver homogenate from a dead chicken into embryo and identiﬁ ed by electronic microscopy, PCR and sequencing. The virus particles were observed as spherical shape, icosahedral symmetry and non-enveloped with about 70~80 nm in diameter. The virus did not agglutinate red blood cells. The full-length genome of the SN2016 strain was 43634 bp by gene sequencing. It belonged to an evolutionary branch with reference strains of FAdV-4 as their nucleotide homology ranged from 95.8% to 99.7%. The isolated virus FAdV-4 SN2016 had nucleotide homology of 34.4% and 37.3% with group Ⅱ and group Ⅲ Fowl adenovirus. Animal experiment demonstrated that the infection of SN2016 virus via muscle inoculation into 3-week-age chickens result in typical inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome with 100% mortality. The basophilic inclusion bodies were found in liver cells from the sick chickens through HE staining. The study indicated that this highly pathogenic serotype 4 fowl adenovirus belonged to FAdV-C. The availability of the isolated virus FAdV-4 SN2016 would provide useful materials for further studies on the vaccine research.Key words: Isolation and Identiﬁ cation; Ⅰ group Fowl adenovirus; the nucleotide homology; animal experiment· 29 ·第29卷第6期任士飞等：Ⅰ群禽腺病毒FAdV-4 SN2016株的分离与鉴定禽腺病毒（Fowl adenovirus, FAdV）根据群特异性抗原的不同分为三个群：Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群。

Ⅰ群禽腺病毒血清4型的分离鉴定及不同代次细胞毒的序列分析

Ⅰ群禽腺病毒血清4型的分离鉴定及不同代次细胞毒的序列分析禽腺病毒（Fowl Adenovirus,FAdV）属于腺病毒科、禽腺病毒属。

以限制性酶切图谱以及血清学交叉中和反应性为依据,目前FAdV可以分成5个种（A-E）,12个血清型（血清型1-7,8a、8b、9-11）。

流行病学的研究发现,FAdV广泛分布于世界范围内,并易感于不同日龄的家禽。

其中,Ⅰ群血清4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus serotype 4,FAdV-4）主要能引起鸡的“心包积液-肝炎综合征”（Hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）,该病最早于1963年在美国被发现,随后便流行至全球各个国家。

自2013年起,我国的多个省份也相继爆发由FAdV-4感染所引起的HHS,对国内鸡类养殖造成了严重的经济损失。

为了解FAdV-4在山东省的流行情况及其演变进化规律,本研究对自山东多个鸡场分离到的FAdV-4毒株开展了相关研究,主要内容如下:1.FAdV-4的分离鉴定和全基因组测序分析本研究收集了山东省内不同来源的19份疑似感染FAdV-4病鸡的肝脏,首先通过聚合酶链式反应（PCR）扩增Hexon基因,并对扩增产物进行测序分析。

测序结果显示,19份病料均可检测到FAdV-4的存在。

随后,选取其中一份病料,研磨过滤后通过卵黄囊途径接种SPF鸡胚,分离到一株Ⅰ群血清4型禽腺病毒并将其命名为SDTA1512株。

通过不同引物的设计对不同基因区域进行了扩增和克隆测序,对得到的基因片段进行拼接获得了其全基因组。

将该序列与不同参考毒株进行序列对比,结果显示本次分离株与HB1510和JSJ13全基因组同源性最高,而与其它国家分离株同源性较低。

最后,将分离株SDTA1512通过腹腔接种1日龄SPF雏鸡,同时设对照组,研究了该病毒的致病性。

结果显示,攻毒组鸡只在接种病毒后,出现精神沉郁,翅膀下垂,羽毛蓬乱等临床症状。

一株禽腺病毒4_型病毒分离与鉴定

1.2
试剂和试剂盒
DL-2 000 DNA Marker、Premix Taq 和 pMD18-T
病毒 1~7 型（FAV1~7）、禽腺病毒 8a 型（FAV8a）、禽
载体，购自宝生物工程（大连）有限公司；Simply P
等 12 个不同血清型[ 2 ]，其中 FAV4、FAV11、FAV8a
限公司；质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA
离，成功分离到一株 FAV4 病毒，扩增所分离病毒 hexon 基因部分序列，测序结果与 GenBank 上的 FAV4 hexon 基因
（登录号：EF554403）相似性为 100%。分离病毒盲传 3 代，测定的 ELD50 为 104.5/0.2 mL，以 0.2 mL·只-1 的剂量胸部
肌肉注射 30 日龄 SPF 鸡 5 只，4 d 内鸡只全部死亡，病变与临床剖检病死鸡相似。取病死鸡肝脏制备组织灭活疫
positive, and a strain of FAV4 virus was successfully isolated using the treatment solution. The partial sequence of
the isolated virus hexon gene was amplified, and the sequencing results showed 100% similarity with the FAV4
长情况。
2.3
[7]
征既能水平传播又能垂直传播，鸡感染后可长期
带毒，并不定期排毒，是危害养禽业健康发展的
[8]
重要疾病之一，该病无明显的季节性，全年均可
发病。
2022 年 8 月份，滨州市滨城区周边某肉鸡场暴

禽腺病毒I群4型疫苗研究态势分析

禽腺病毒I群4型疫苗研究态势分析作者：周明月马鹤毓袁超来源：《农业与技术》2019年第16期摘要：禽腺病毒是家禽养殖的一项重大疾病，对禽腺病毒I群4型系列疫苗的研发，将极大提升科技供给质量，对产业发展和保障畜禽产品安全具有重要意义。

本文依托江苏省专利信息检索分云平台、中国兽药信息网国家兽药基础数据库等权威数据平台，运用专利布局的理念和方法，对主题技术专利授权和产品开发情况进行检索分析。

研究得出主要竞争主体、总体研发进度、当前研究空白和后期可开发、具备较高开发价值领域，为禽腺病毒I群4型技术研发和产品开发提供精准依据。

关键词：专利布局;禽腺病毒;亚单位疫苗;多联疫苗中图分类号：S-3文献标识码：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20190830003禽腺病毒是家禽养殖面临的一项重大疾病。

该病1987年在巴基斯坦首次爆发，随后在全世界主要养鸡国家流行。

2013年，该病在我国首发，主要侵害3～5周龄肉鸡和蛋雏鸡，感染率高达90%以上，死亡率20%～80%，对养殖业造成巨大损失。

对该病的防控成为家禽养殖和临床预防领域关注的重点。

国外一些公司对禽腺病毒疫苗进行了研发工作，MSD动物保健（默克）已研发成功专用疫苗但尚未进入国内市场。

按照2017年商品鸡饲养量、鸡新城疫-禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（La Sota株+L株/SS株/HP株/WD株/HN106株等）、鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗（La Sota株+M41株+L株/SS株/HP株/WD 株/HN106株等）免疫接种量和产品售价测算，该系列产品的市场价值将突破亿元。

对禽腺病毒I群系列疫苗的研发，不仅有利于抢占科技创新制高点，提高供给质量，也对提升产业价值和畜禽产品质量安全保障水平具有重要意义。

专利布局是知识产权运营的新兴热点领域。

有学者将专利布局视为权利人以增强商业竞争力为目的的专利组合过程[1];有学者认为专利布局是一种构建专利组合的顶层规划和指导思想[2]。

Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体效价与鸡攻毒保护相关性试验

材料与方法Ｊ．试验材料
Ｉ群４型禽腺病毒卵黄抗体：批号是２０１７０１、２０１７０２、２０１７０３，由哈药集团生物疫苗有限公司制备。
Ｉ群４型禽腺病毒检验用强毒：批号是ＦＡＶ— ＨＹ－ＱＳ一０３—２，病毒含量为１０ＴＣＩＤｄｏ．１ｍＬ，规格为２．０ｍＬ·瓶～；Ｉ群４型禽腺病毒琼扩抗原：批号是ＦＡＶ—ＨＹ—Ｋ一０１；效价：１：２；规格：２．０ｍＬ·瓶一；Ｉ群４型禽腺病毒阳性血清：批号是ＦＡＶ—ＨＹ—Ｙ一０１；效价：１：６４；规格：２．０ｍＬ·瓶～；Ｉ群４型禽腺病毒阴性血清：批号是ＨＹ—Ｙ一０１，规格：２．０ｍＬ·瓶～，由哈药集团生物疫苗有限公司制备、鉴定、保管和供应。
ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓａｎｄＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｈｉｃｋｅｎＡｔｔａｃｋｅｄ
ＹＵＨｏｎｇｔａｏ．ＺＨＡ０Ｌｉ．ＬＶＲｉｈｕｉ
（ＨａｒｂｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＧｒｏｕｐＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＶａｃｃｉｎｅＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｈａｒｂｉｎ１５００６９，Ｃｈｉｎａ）
ＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＤｉｓｅａｓｅ营养与疾病
一
国家级生物疫苗研发企业科技动保健康未来
哈药集团生物疫苗有限公司电话：０４５１～８６６６４９９６
ＨａｒｂｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＧｒｏｕｐＢｉｏ—ｖａｃｃｉｎｅＣｏ．．Ｌｔｄ．
Ｉ群４型பைடு நூலகம்腺病毒卵黄抗体效价与鸡攻毒保护相关性试验
关键词：卵黄抗体；相关性；效价中图分类号：￥８５２．６５９．１；￥８３１文献标志码：Ａ文章编号：１００１—００８４（２０１８）０２—００４５—０３

血清4型和8b型禽Ⅰ群腺病毒二价油乳剂灭活疫苗的研制

血清4型和8b型禽Ⅰ群腺病毒二价油乳剂灭活疫苗的研制鸡的心包积液综合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)和包涵体肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)均是由禽Ⅰ群腺病毒引起的急性传染病。

近年来,这两种疾病在我国的发病率呈上升趋势,给养鸡业造成很大的经济损失。

禽Ⅰ群腺病毒分为A、B、C、D、E等5个基因型,按照血清型分为1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11型;基因型和血清型的对应关系为A(1)、B(5)、C(4、10)、D(2、3、9、11)、E(6、7、8a、8b)。

当前我国HHS和IBH的主要病原分别是禽Ⅰ群腺病毒血清4型(FAdV-4)和血清8b型(FAdV-8b)。

因此,研制FAdV-4和FAdV-8b二价油乳剂灭活疫苗具有重要的应用价值。

1 FAdV-8b QD2016株的分离与鉴定本研究从山东某鸡场疑似发生IBH的病例中分离到1株禽腺病毒(命名为QD2016株)。

设计了 33对引物,对QD2016株全基因组序列进行扩增、测定和生物信息学分析。

(QD2016株基因组全长为43632bp,与禽Ⅰ群腺病毒E基因型CR119株、YR36株、TR59株、764株、HG株、UPM04217株、HLJ/151129株同属一个大的进化分支,核苷酸序列同源性介于93.4%～98.4%之间;QD2016株与UPM04217株亲缘关系最近,同属于FAdV-8b。

2 FAdV-4和FAdV-8b二价油乳剂灭活疫苗的研制本研究以FAdV-8b QD2016株和实验室先前分离鉴定的FAdV-4 GX2013株研制二价油乳剂灭活疫苗。

根据《中华人民共和国兽药典》的要求建立了两个毒株的种子库,经检验无禽白血病病毒(ALV)和网状内皮组织增生症病毒(REV)等外源病毒的污染。

利用细胞工厂培养LMH细胞,用于扩增FAdV-4 GX2013株和FAdV-8b QD2016株。