《城市水体净化》PPT课件

③有些菌株在生长前期、中期及后期菌落形态稍有 变化，这需要经过多次重复平板培养才能鉴定。
④菌株筛选出后要尽快测功能，防止由于 传代次数过多导致菌株性能衰退。如若时 间来不及，则必须进行试管斜面短期保藏， 不能在室温下放置时间过长。再次拿出来 使用菌株时，必须先进行平板复壮，以恢 复菌株活力。
• 理论上认为，不能用同一因子长时间对同一种子 进行诱变，这样会减低诱变效率，增强负突变发 生，减少正突变，建议实验室诱变育种采用物理 突变和化学突变相结合。
• 首先给挑选出的单菌落命名 • 每种菌株5支斜面保藏，备用。 注意：
本实验的目的是找出除有机磷和 除无机磷的菌株，以上操作只针对其 中一种的菌株来说。所以实际操作时 所用试剂、仪器和器材都是加倍的。
• 原理：水中总磷的测定可以根据水质分析规定方 法进行。水中的含磷化合物,在过硫酸钾的作用下, 转变为正磷酸盐。正磷酸盐在酸性介质中可同钼 酸铵和酒石酸氧锑钾反应,生成磷钼杂多酸。磷钼 酸能被抗坏血酸还原,生成深蓝色的磷钼蓝。在 700nm波长测定样品的吸光度。从用同样方法处理 的校准曲线上,查出水样含磷量,计算总磷浓度除磷体系主要通过除磷微生物利用水中 可溶性磷酸盐来降低水中的磷含量,因此筛选高效 的磷降解菌可以降解水体中的磷,使水体中的磷在 有氧阶段被微生物本身代谢,进而改善水体环境, 同时也能够提高污水除磷体系中的生物除磷效率。
• 又由于水体中的有机磷酸盐不能被微生物所利用, 会引起水体发臭。进而加剧水体环境恶化，因此 降解水体中的有机磷酸盐是治理水体污染必要的 步骤。有机磷解磷菌能够把有机磷酸盐降解成可 溶性磷酸盐,从而减少水体中有机磷酸盐的含量。
• 利用富集培养的方式，对自然界的样品进行处级 筛选，初步挑出有聚磷效果的聚磷菌。
• 钼锑抗法测试菌株除磷效率，挑选出除磷效率高 的菌株。
• 对挑出的菌株人工诱变育种，培育新的高产菌株， 使其除磷率高于90%。
• 在除磷效果比较理想的基础上培养基优化，优化 菌株的生长环境，以便生产应用。
1、样品采集 2、样品预处理 3、富集筛选 4、稀释涂布平板法初筛 5、平板划线分离纯化 7、钼锑抗法测除磷率 8、紫外诱变 9、高效菌株培养基优化培养 10、扩大培养，应用生产实际
未来展望
• 有氧反硝化细菌、自养反硝化细菌和脱氮 除磷细菌的发现丰富了反硝化细菌的研究 内容,也增加了对反硝化过程新的认识,同 时也为有效控制反硝化活性及污水脱氮开 拓了新的途径。通过研究反硝化细菌的生 态及生物学特性,改变环境条件,使反硝化 细菌充分发挥作用,将对于提高污水脱氮 水平发挥重要作用。
• 目前，测水中总磷有很多方法，钼锑抗法是最为精准 的和简便的，本标准适用于地面水、污水和工业废水。 取25mL试料，本标准的最低检出浓度为0.01mg/L，测 定上限为0.6mg/L。在酸性条件下，砷、铬、硫干扰测 定。
• 实验时，注意不要超过检出限，如若水中磷含量较高， 则应先稀释再加试剂。
• 聚磷菌的功能曲线为倒“U”，这是因为菌株在生长高 峰期利用磷用于自身代谢，使数据下降，在其衰亡后， 微生物有机体裂解，释放磷，又使水中总磷升高。
• 诱变方法：诱变在暗箱中进行。先将一 定数量的种子用紫外线照射一段时间， 然后再将种子培育出来，观察种子生长 状况，发现产生了需要的性状后将该菌 株保留。注意：前期进行诱变的种子数 量一定要多，因为种子发生突变的概率 很小。
培养基优化：培养基优化，是指面对特定 的微生物，通过实验手段配比和筛选找到 一种最适合其生长及发酵的培养基，在原 来的基础上提高发酵产物的产量，以期达 到生产最大发酵产物的目的。 对于本科研筛选出的菌株采用正交试验 的方法优化培养基。
• 聚磷菌：也叫做摄磷菌，是传统活性污泥工艺中 一类特殊的兼性细菌，在好氧或缺氧状态下能超 量地将污水中的磷吸人体内，使体内的含磷量超 过一般细菌体内的含磷量的数倍，这类细菌被广 泛地用于生物除磷。
• 解磷菌：能够将植物难以吸收利用的磷转化为可 吸收利用的形态，具有这种能力的微生物叫做解 磷菌或溶磷菌（phosphate-solubilizing microorganisms）。
以磷酸三钙为富集因子，三次富集时，磷酸 三钙的量逐次递增，三次富集量分别为第一次1%、 第二次1.5%、第三次2%
除有机磷方向：
卵磷脂为富集因子，三次富集时，卵磷脂的量逐 次递增， 分别为第一次0.02%、第二次0.03%、 第三次0.04%
• 将富集后的菌液稀释涂布平板，稀释梯度为105,10-6,10-7，每个梯度三个平行涂平皿。
• 由于菌株分为除有机磷和除无机磷两种，所以测水中 磷含量变化时也分无机磷和有机磷。实验时注意区别。
• 有机磷培养基以卵磷脂为变量，卵磷脂时脂 溶性物质，80℃变性，不溶于水，常温下， 将卵磷脂加入水中后，半个小时后就可以乳 化于水。
• 磷酸三钙是不溶于水的无机物，化学性质稳定， 长时间浸泡水中仍不分解，但是聚磷菌可以将 固体的磷酸三钙分解为可溶于水的磷酸盐，供 自己或者水中其他微生物植物利用。
净水除磷小组2011年度 总结报告
• 城市景观水体作为城市生态系统的重要组成 部分在城市生态化建设中日益显示出其不可 替代的功能和意义。但一般自净能力弱，容 易成为居民生活污水雨水和垃圾的接纳体， 导致不同程度的污染，乃至富营养化。
• 大量的研究表明,磷是湖泊富营养化的主要 限制因子。水体中有机磷的污染主要来自农 药、生物代谢的植磷酸和生物体腐烂的有机 质等
一方面，本研究分别从河南城建学院月牙湖污水中和 平顶山污水处理场活性污泥中两处分别富集和分离菌株。其 中河南城建学院污水中分离出11株菌，只有 5 株解磷效果 比较好。在平顶山污水处理厂活性污泥中暂时筛选出5株有 除无机磷功能的菌株，11株除有机磷菌株，它们的除磷功能 待定。
另一方面，经一年的探究工作，本小组又对08年筛出 的P13和P24菌株进行了功能测试和紫外诱变育种，其中P13 除磷率为83%，最佳诱变时间为15s；P24除磷率为34%，最佳 诱变时间为20s。本实验将在筛选新菌株的同时，继续探究 这两株菌的生理生化特性及合适的诱变育种方式。
• 将培养基放入培养箱中30℃培养48h，期间每隔一 段时间观察并记录菌株生长状况。
• 挑选形态不同的单菌落进行平板划线，观察菌株 有无分离。如果分离，则需挑分离后的菌落再次 平板划线纯化。如果没有分离现象，则需再次划 平皿进行平板保藏。
• 对每个平皿均进行以上处理和重复分离纯化，直 至菌种没有分离现象。最后对平皿上的纯种聚磷 菌先进行试管斜面保藏。
• 方法与步骤：分别取0h、4h、8h、12h、 16h、20h、24h、36h、48h、72h样 品离心取上清5ml，加过硫酸钾0.8ml， 121℃消解30min，冷却后先加入钼酸盐， 30s后再加入抗坏血酸，静置15分钟，测 OD值。根据磷标准曲线找出OD值对应的 磷含量，计算结果。
• 除磷率 = (初始磷浓度 − 最低磷浓度)/初始磷 浓度
第一次驯化：
样品：培养基=1:2混匀（接种量大是为了富集出数量多质量 好的菌株），分装3瓶各100ml于三角瓶中，30℃150r/min摇 床培养24h。
第二次驯化：
将上述菌液以10%接种量加入第二次富集驯化培养基中。培 养条件及时间不变
第三次驯化：
操作同第二次，但培养基变成第三次驯化所用量
除无机磷方向：
感谢下 载
采集地点：
河南城建学院月牙湖和平顶山市污水处理厂
取样方式：
用塑料瓶从藻类生长旺盛或污染严重的水域取样， 但是在污水处理厂取活性污泥即可（此样品无需预处理）。
样品预处理：
用漏斗和滤纸将样品过滤除去样品中的沙石和漂浮 的细小垃圾，将过滤后的样品分装于250ml锥形瓶中，每瓶 100ml。样品采集后应该立即进行处理，防止由于放置时间 防止过长导致微生物代谢凋亡，影响实验。
• 紫外线诱变机理：紫外线诱变处理的有效波长 200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。 dna和rna的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，dna分子形成嘧啶 二聚体，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，引起双链 结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，还会妨碍双链的 解开，影响dna的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基 转换、颠换、移码突变或缺失，即所谓的诱变。
• 诱变育种（mutation breeding）：指用物理、化学因素 诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符 合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种 质的育种方法。它是继选择育种和杂交育种之后发展起来 的一项现代育种技术。实验室中常采用物理诱变和化学诱 变的方法育种，其中物理诱变中紫外线诱变最为常见。
• 实验室诱变用的紫外灯功率为15w，照射距离30cm， 种子液密度数量级应达到108。
• 因为DNA光修复的存在，所以诱变后的种子不能见 光，实验操作需要在红外线下进行。（可以紫外 线照射与见光相互交替，增大突变率。
• 突变率一般以75%～80%为宜，高于这个数值活菌 太少，低于这个数值突变率较低，都不利于种子 筛选。
未来展望
• 目前国内污水处理厂的污泥大都没有得到充分利用, 因此从污泥中筛选出具有较强聚磷能力的聚磷菌具有 一定的实践意义。
• 近年来,虽然发现了不同类型的聚磷菌,但这些聚磷细 菌如何成为反应体系中的优势种群而发挥作聚磷用以 及如何根据这些新的聚磷细菌的生物学和生态学特性 建立新的工艺是问题的关键所在。因此,开展聚磷细 菌进行聚磷作用的分子机理、生物学特性和生态学研 究,可为使其成为污水处理系统中的优势种群而奠定 理论基础。
①筛选菌株时应尽量加大关键因子的量，这样才可 能筛出目的菌较好的菌株。
②平板划线纯化菌株时，一般至少经过三次纯化才 可能获得纯种的目的菌，又由于很多菌株菌落形态 在初始培养时相同，往往需培养三天以上才能有明 显的变化，而菌株在30℃培养两天就已基本停止生 长，所以在分离时需要耐心等待，不能过早下结论。