用16S rDNA方法鉴定细菌种属

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16SrDNA对四种常见细菌中的鉴定与应用

文献标志码：ＡＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９— ０５６８．２０１３．０４．００２中图分类号：￥８５２．６５
ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＦｏｕｒＫｉｎｄｓｏｆＣｏｍｍｏｎＢａｃｔｅｒｉａｂｙ１６ＳｒＤＮＡ
ＰＣＲ．ａｍｐｌｉｉｆｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｌ５００ｂｐｂｙ１６ＳｒＤＮＡｕｎｉｖｅｒｓｌａｐｉｒｍｅｓ．ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｂｌａｓｔｅｄｗｉｔｈＧｅｎｅＢａｎｋ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：ｔｈｅＡｂａｃｔｅｉａｒＷｓａｔｈｅＥｎｔｅｏｂｒａｃｔｅｒｓｐ，ｔｈｅＢｂａｃｔｅｉａｒｗａｓｔｈｅＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓｓｔｒａｉｎ，ｔｈｅＣｂａｃｔｅｉａｒＷｓａｔｈｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｔｈｅＤｂａｃｔｅｉａｒｗａｓｔｈｅＰｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ，ｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｒａｔｉｏｗａｓｒｅａｃｈｅｄ９９％．ｉｎｉｔｉａｌｌｙｔｈａｔｔｈｅＡｂａｃｔｅｉａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｅＥｎｔｅｒ — ｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ｔｈｅＢｂａｃｔｅｉｒａｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄｔｈｅＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓｓｔｒａｉｎ。ｔｈｅＣｂａｃｔｅｉｒａｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄｔｈｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｔｈｅＤｂａｃｔｅｉａｒｉｄｅｎ — ｔｉｆｅｄｔｈｅＰｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ．Ｔｈｅｅｘｐｅｉｍｅｒｎｔａｉｍｅｄｔｏｐｏｖｒｉｄｅｄｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃｌａｂａｓｉｓｏｆｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｌｉｎｉｃｌａｂａｃｔｅｉａｒｂｙ１６ＳｒＤＮＡ．

16S鉴定细菌的种属

16S rDNA在原核生物中普遍存在。
16 S rDNA的相对分子量大小适中，约1500 bp，便于序列分析。在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保
守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类
生物亲缘关系的研究。 bp=base pair
图 16S rDNA基因组成（灰色为保守区，绿色为可变区）
16S rDNA基因全长1542 bp，由9个可变区和10个保守区组成。其中保守区反映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则表明物种间的差异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。
DNA的提取
挑取单菌落,然后置于装有100 μLPrepMan Ultra的离心管中, 涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心 3min ，取 10μL 上清液与 490μL ddH2O （即稀释50 倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。提取的DNA 于-20℃保存。
利用16S rDNA鉴定细菌的种属
1.什么是 16S rDNA？ 16SrRNA 为原核生物核糖体 RNA 的一个亚基， 16SrDNA 就是编
码该亚基的基因。原核生物的rRNA含有3种类型：23S、16S、5S rRNA，它们分别
含有2900、1540和120个核苷酸。
2.用16S rDNA进行细菌鉴定的原因
检测：核酸蛋白仪/琼脂糖凝胶电泳
525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3'
试剂使用量（ 20μL体系）
模板DNA （10ng~100ng） 2μL
PCR 反应条件
Taq 酶(5U/μL)
10×Taq Buffer(Mg2+) dNTPs(2.5mM) 引物F(10 μM) 引物R(10 μM) ddH2O

16SrDNA鉴定菌株地实用标准操作规程

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。

本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。

2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法。

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。

16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。

16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。

针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well ThermalCycler ；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130 3.2 试剂DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra ；琼脂糖；PCR 试剂：Taq 酶，10×Taq Buffer(Mg 2+)，dNTPs ，ddH 2O 等； ExoSAP-IT ；测序试剂：BigDye Terminator ，5×Sequencing Buffer ；BigDye XTerminator Purification Kit ； 3.3 耗材移液器吸头：1000μL 、200μL 、10μL ；离心管：1.5mL 、200μL ；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate ；Micro Amp TM Optical Adhesive Film ； 3.4 引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 500 bp 左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 第2部分正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分正向引物926F 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 560 bp 左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'4. 操作流程5. 实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。

2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法。

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。

16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。

16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。

3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator ddH2Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well ReactionPlate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp左右反向引物519R5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4.操作流程5.实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。

用16S rRNA基因序列鉴定细菌

Ezbiocloud比对，下载同源序列
培养细菌提取基因组DNA PCR扩增16S rRNA基因产物电泳检测，测序 Ezbiocloud比对，下载同源序列 MEGA比对和分析
1. 测序结果的分析和处理一个测序反应结果包括两个文件，序列文件用记事本
打开，图形文件用Chromas软件打开观察。打开图形文件，确认测序结果良好，并去除序列文件中两端不准确的部分，得到最终的测序结果。 2. 同源序列下载
CVV
C
VC V C V
C VC V C V C V C
Prmier 1492R
细胞生物共有，功能重要，多拷贝，保守区和多变区组成，适合扩增和序列相似性分析。 ➢ 研究物种间进化和分类。 ➢ 根据16S rRNA基因序列鉴定待测菌株。 ① 同种细菌序列相似性≥98.7%，但序列相似性≥98.7%≠同种； ② 用待测菌株及相似性较高的菌株16S rRNA基因序列构建系统发育树（Phylogenetic
1. 构建系统发育树系统发育分析后的结果文件，用mega 6软件中的邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。 2. 整理系统发育树，确定待测菌株属名
产物电泳检测，测序
Ezbiocloud比对，下载同源序列 MEGA分析
构建系统发育树，确定种属
用Neighbor-Joining法构建系统发育树
用16S rRNA鉴定细菌流程
培养细菌提取基因组DNA PCR扩增16S rRNA基因产物电泳检测，测序 Ezbiocloud比对，下载同源序列 MEGA比对和分析构建系统发育树，确定种属
PCR扩增16S rRNA基因
1. PCR体系（50 μL）
引物27F （20 mmol/L）引物1492R（20 mmol/L）基因组DNA 双蒸水 2×PCR SuperMax（+dye）

16SrDNA鉴定细菌的方法

16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组 DNA,2.设计/选择引物进行 PCR扩增，电泳检测纯度与大小。

3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。

6.BLAST比对获取相似片段。

7.构建系统进化树试剂：1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA 勺提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。

)。

1.21M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0) (1L): 121.1g Tris，加浓盐酸约(70ml,60ml, 42ml ),高温高盐灭菌后，室温保存。

冷却到室温后调pH,每升高1C, pH大约下降0.03 个单位。

(Tris-HCl 缓冲液(0.05mol/L , 25C) 50ml 0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至 100ml。

Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一 )1.30.5M EDTA (pH8.0) (1L): 186.1g Na2EDTA?2H2O 用NaOH调pH 至8.0约20g ),高温高压灭菌，室温保存。

(配置方法1.称取186.1g Na2EDT?2H2O置于1L烧杯中。

2.加入约800mL的去离子水，充分搅拌。

3.用NaOH调节pH值值8.0 (约20g NaOH。

注意：pH值至8.0 时，EDTA才能溶解。

4.加去离子水将溶液定容至1L。

5.适量分成小份后，高温高压灭菌。

6.室温保存。

)1.410X TE Buffer (缓冲液)(pH7.4，7.6，8.0) (1L):组分：100 mMTris-HCl ，10 mM EDTA 1M Tris-HCl ( pH7.4，7.6，8.0 ) 取100ml，0.5M EDTA(pH8.0) 取20ml。

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。

2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法。

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。

16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。

16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。

3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；页脚内容2Micro Amp TM Optical Adhesive Film ；3.4 引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp 左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp 左右反向引物1492R 5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:14. 操作流程5.实验方法5.1核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min后，以离心机最大转速离心3min，取10μL上清液与490μL ddH2O（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。

16S rDNA

中国人兽共患病学报
２Ｏ１５，３１（１１）
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｎｏｓｅｓ１Ｏ１７
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ，ｉｓｓｎ１００２ —２６９４．２０１５．１１００６
２．ＳｔａｔＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＪｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．
ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＣｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０６，Ｃｈｉｎａ３．ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｏｕｔｈＣｈｉｎａ，Ｈｅｎｇｙａｎｇ４２１００１，Ｃｈｉｎａ）
Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｗｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ４９Ｎｏｃａｒｄｉａｓｔｒａｉｎｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＤｒｏｄｕｃｔｗｅｒｅ
１６ＳｒＤＮＡ序列中，１６ＳｒＤＮＡ能将诺卡菌大致可分为１１群，除了不能将亚种分离外，诺卡菌其他种属均能得到很好的分离。诺卡菌１６ＳｒＤＮＡ种内及亚种内相似性为９９．１～１００；种间相似性在９５．７～９８．８之间。结论１６ＳｒＤＮＡ序列分

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。

2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法。

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。

16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。

16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。

16S鉴定细菌的种属精品PPT课件

5
特异引物扩增１６ＳｒDNA序列：这个过程一般先用Primer Premier 来设计引物，接下来在利用PCR进行特征序列的扩增。如果是乳酸菌可以用通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1495r： 5′- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。以下是我已Enterococcus KLDS 6.0610的16SrDNA为例设计的引物
验证ＰＣＲ产物扩增是否成功
选取近似菌种序列构建系统发育树
与数据库中已知细菌比较获得样品
种属信息
ＤＮＡ测序获得１６ＳｒＤＮＡ序列
4
1.弃尽培养液，向培养皿中加入650 μl的Solution A，室温静置1分钟。 2. 用移液枪的取650 μl的细胞悬浮液转移至Collection Tube中。 3.加入0.8 μl的RNase A1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟。 4. 弃去上层有机相，再加入1 ml的4℃预冷的Solution C充分混匀后12,000 rpm离心2分钟 5. 弃去上层有机相，然后将水相溶液转移至置于Collection Tube上的Filter Cup中 6. 弃Filter Cup，在滤液中加入400 μl的DB Buffer，混合均匀。 7. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作6混合溶液转移至 Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 8. 将500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 9. 将700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 10. 重复操作步骤9。 11. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入 50～200 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 12. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA。

16SrDNA序列在微生物的分类鉴定上的应用

16SrDNA序列在微生物的分类鉴定上的应用摘要随着生物技术的迅速发展，16SrDNA分析技术在微生物分类鉴定及分子检测中得到广泛应用。

根据16SrDNA的保守域和高变域，可以进行种属的鉴定。

16SrDNA分析技术克服了传统生物培养法的限制，操作方便，检测快，准确度高且灵敏度高，已被广泛应用到菌种鉴定、群落对比分析、群落中系统发育及种群多样性的评估，是一种客观且可信度高的分类方法。

关键词16SrDNA 微生物分类鉴定传统的微生物分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征及免疫学特性加以鉴定。

但近几十年来，传统微生物分类鉴定得到了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定。

1.微生物形态比较分类法的局限性1.1 不能正确反映微生物形态由于微生物菌群在进行纯培养时，不可避免地会造成菌株的富集或衰减，人为地改变了原始菌群的微生物生态构成，对研究结果造成了较大的偏差①。

这样在应用上就只能局限于对简单环境下的微生物的研究，而对复杂环境下的微生物不能加以有效分析，严重影响了微生物基因组的研究。

1.2微生物资源大量丢失许多研究研究表明，在自然环境中有相当多的菌种（约90%～99%）用纯培养方法无法培养出来。

同时，纯培养分离方法采用配制简单的营养基质和固定的培养温度，忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少，仅占环境微生物总数的0.1%～1%②。

因此，由于绝大多数微生物无法培养得到，丢失了大量微生物资源，对微生物多样性的认识较片面。

1.3不能保证分类的准确性和科学性对形态特征、理化特征、菌体某些化学成分等特征完全相同时，可较准确的分类，但是对某特性中有某些差异的，往往难以判断。

而且，方法繁琐耗时。

2. 16SrDNA及其鉴定依据2.1 16SrDNA简介16SrDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因,长度约1500bp,是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”, 其序列包含10 个可变区( variable region ) 和与之相间的11 个恒定区( constantregion) ,可变区因细菌而异,且变异程度与细菌的系统发育密切相关。

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。

2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法。

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。

16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列。

16SrDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

在 16SrRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全页脚内容1长序列分成3部分进行测序。

3.设备和材料1.1器材移液器（1000μL、200μL、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppend orfMixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti96WellThermalCycl er；凝胶成像仪：VersaDocMP4000；基因分析仪：AB3500、AB31301.2试剂DNA快速提取试剂：PrepManUltra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×TaqBuffer(Mg2+)，dNTPs，d dH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDyeTerminator，5×SequencingBuffer；BigDyeXTerminatorPurificationKit；1.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管： 1.5mL、200μL；页脚内容2MicroAmp TM Optical96-WellReactionPlate；MicroAmp TM OpticalAdhesiveFilm；1.4引物16 SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'500bp左右反向引物519R5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'第2部分正向引物357F5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGGGTTGCGCTCGTTGC-3'第3部分正向引物926F5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3'560bp左右反向引物1492R5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'其中M=C:A,Y=C:T.K=G:T,R=A:G,S=G:C.W=A:T;all1:1页脚内容3页脚内容44. 操作流程1.5核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepManUltra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL d dH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。

16S鉴定细菌的种属

检测：核酸蛋白仪/琼脂糖凝胶电泳
1525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3'
试剂使用量（ 20μL体系）
模板DNA （10ng~100ng） 2μL Taq 酶(5U/μL) μL 10×Taq Buffer(Mg2+) dNTPs(2.5mM) μL 引物F(10 μM) μL 引物R(10 μM) μL
DNA的提取
挑取单菌落,然后置于装有100 μLPrepMan Ultra的离心管中,涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min，取10μL上清液与490μL ddH2O （即稀释50 倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。提取的DNA 于-20℃保存。
PCR 反应条件
0.2 2 μL
1 0.5 0.5
1min30s
判断16Sr DNA序列扩增是否成功:经琼脂糖凝胶电泳在1500 bp附近出现条带，说明16s rDNA已经扩增成功。
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利用16S rDNA鉴定细菌的种属
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1.什么是 16S rDNA？ ➢ 16SrRNA为原核生物核糖体RNA的一个亚基，16SrDNA就是
编码该亚基的基因。 ➢ 原核生物的rRNA含有3种类型：23S、16S、5S rRNA，它们分
别含有2900、1540和120个核苷酸。
2.用16S rDNA进行细菌鉴定的原因 ➢ 16S rDNA在原核生物中普遍存在。 ➢ 16 S rDNA的相对分子量大小适中，约1500 bp，便于序列分
析。 ➢ 在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度

细菌种属的分子鉴定

用16S rDNA方法鉴定细菌种属一、目的1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。

二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。

16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。

5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。

而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线：三、操作步骤（一）细菌基因组DNA提取1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。

2. 取2 mL培养液到2 mLEppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。

3. 加140 μL TE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。

37℃放置10分钟。

4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。

再加入3 μL Protein K，混匀，55℃温育5分钟。

5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。

10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。

7. 重复第六步。

8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。

吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。

菌种鉴定的分子生物学方法

菌种鉴定的分子生物学方法——16S rDNA 测序鉴定菌种一．原理细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。

5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。

而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。

在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。

因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。

随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。

二．技术路线该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。

具体技术路线如下：三．方法步骤（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。

细菌培养液基因组DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定测序2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速取得细菌种属信息的操作规程。

本标准适用于未知细菌的快速种属分析，和为细菌的生化鉴定提供指导信息。

2.方式和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方式对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。

是一种快速取得细菌种属信息的方式。

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，别离为5S、16S和23S rRNA。

16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。

16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能表现不同菌属之间的不同，又能利用测序技术较容易地取得其序列，故被细菌学家和分类学家同意。

在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列大体保守，因此可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的不同来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

16SrDNA序列的前500bp序列转变较大，包括有丰硕的细菌种属的特异性信息，因此关于绝大多数菌株来讲，只需要第一对引物测前500bp序列即可辨别出细菌的菌属。

针对科学论文发表或是前500bp无法辨别的情形，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，取得较为全面的16SrDNA 的序列信息。

由于测序仪一次反映最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的靠得住性，通常将16SrDNA 全长序列分成3部份进行测序。

3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；EppendorfMixMate ；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR 仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler ；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130 3.2 试剂DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra ；琼脂糖；PCR 试剂：Taq 酶，10×Taq Buffer(Mg 2+)，dNTPs ，ddH 2O 等； ExoSAP-IT ；测序试剂：BigDye Terminator ，5×Sequencing Buffer ；BigDye XTerminator Purification Kit ； 3.3 耗材移液器吸头：1000μL 、200μL 、10μL ；离心管：1.5mL 、200μL ；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate ；Micro Amp TM Optical Adhesive Film ； 3.4 引物16SrDNA 名称序列第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 500 bp 左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 第2部分正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分正向引物926F 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 560 bp 左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G , S=G:C. W=A:T; all 1:14. 操作流程5. 实验方式5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。

16srdna菌种鉴定原理

16srdna菌种鉴定原理宝子！今天咱来唠唠16S rDNA菌种鉴定原理，这可超级有趣呢！在微生物这个超级微小又超级神秘的世界里，要想知道一个小细菌到底是啥种类，就像在一个超级大的人群里找到一个人的身份一样难。

不过呢，微生物们有它们自己独特的“身份证”，这个“身份证”就是16S rDNA啦。

16S rDNA是啥呢？它其实是细菌的核糖体RNA（rRNA）的一个亚基的基因序列哦。

你可以把细菌想象成一个小小的工厂，那核糖体就是这个小工厂里生产蛋白质的超级重要的“机器”。

16S rDNA就像是这个“机器”的一部分的设计蓝图，而且这个蓝图在不同种类的细菌里是有区别的呢。

就好比不同品牌的手机，它们内部的一些小零件的设计是不一样的。

16S rDNA在不同细菌里长度大概在1500个碱基对左右，这里面有一些区域是非常保守的，就像手机都有屏幕这个基本的部件一样。

而还有一些区域呢是可变的，就像不同手机品牌的屏幕可能在分辨率、色彩显示等方面有差别。

这些保守区和可变区组合起来，就成了细菌独一无二的特征啦。

那科学家们怎么利用16S rDNA来鉴定菌种呢？他们就像侦探一样哦。

首先得把细菌的16S rDNA这个基因序列从细菌里提取出来。

这就有点像从一个神秘的小盒子里找出特定的小纸条一样。

提取出来之后呢，就要对这个基因序列进行测序啦。

测序就像是把小纸条上的字一个一个读出来，然后记录下来。

得到这个基因序列之后，就可以和数据库里已经知道的各种细菌的16S rDNA序列进行比对啦。

数据库里有超级多不同细菌的“身份证信息”呢。

这就好比是拿着我们刚得到的小纸条，去一个巨大的图书馆里找有没有一样或者相似的纸条。

如果找到很相似的，那就可以大概率判断这个细菌是属于哪一类啦。

而且呀，16S rDNA鉴定菌种有好多优点呢。

它在细菌里广泛存在，几乎所有的细菌都有这个“身份证”。

这就像每个人都有自己的身份证一样普遍。

而且这个方法相对来说比较简单，不需要特别复杂的仪器设备就能做初步的鉴定。