用16S rDNA方法鉴定细菌种属

用16S rDNA 方法鉴定细菌种属

一、实验目的

1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；

2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。

二、实验原理

细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。

16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。

16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：

细菌基因组的提取：

PCR 的基本原理 ：

PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

二、操作步骤

1、细菌基因组DNA提取；

2、PCR扩增；

3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；

4、扩增片段回收；

5、DNA片段测序。

三、结果处理与分析

在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，，则凝胶为400mg，因此加入的Binding Buffer为1200μl。

我们小组选用B1 16S sequence，以下为制作进化树过程：

1、根据B1 16S 基因序列，到NCBI 上比对，确定其种属

（1）NCBI 主页（/）依次点击进入BLAST

（2）选择nucleotide BLAST

（3）将B1 序列复制到文本，框里Choose Search Set 处点复选按钮others，最后点BLAST （4）点击BLAST后，数据进行提交。BLAST 结果如下：

图中“Evalue”指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totle score）都是数值越高相似度越高。

我组将数据按照Query cover从100%开始从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据。

（5）导出数据

数据导出格式选择FASTA：

（6）选择大肠杆菌作为外属，导出大肠杆菌

（7）下载MEG并安装，我组使用的是MEGA5.02，并将B1序列导入MEG

（8）通过Edit中的Copy及Paste将B1序列和大肠杆菌序列导入我们选中的14个序列中

（9）选择W 中Align DNA，然后点击OK

（10）选择Date中的MEGA Format，生成meg文件

（11）打开.meg文件

（12）生成进化树

（13）导出文件，我组导出PDF格式

2、进化树

B1应该属于Proteus（变形杆菌属）

电泳图谱：

从右数第四个

条带为本组电

泳条带，条带清

晰且明亮，无明

显拖尾以及弥

散，表明DNA

提取和PCR扩

增非常顺利，所

得目的片段完

整，数量较多。

四交流与讨论

1.细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此我们选择16S rRNA 进行提纯测序

2.用试剂盒提取RNA，一定要注意盒内药品名称，不要弄错

3.提取DNA过程中，加入GA缓冲液后，一定要小心吹打混匀，但要注意不要产生气泡。

4.制作PCR扩增产物的过程中，第一步要先加水，因为DNA液和其他药品太少，不事先加水，会是使其他样液加到离心管壁上或根本加不进来，造成样液损失。

5.我组的DNA电泳虽然亮度略低，但是PCR产物条带清晰明亮，同时并无拖尾现象，说明我组DNA扩增之后含量很高，而且质量也很好

6.PCR反应五要素：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+作为聚合激活剂）。

通过这次实验我学到了鉴定细菌种属的一种方法，16Sr DNA法，虽然按照试剂盒进行实验操作非常简单，但这次实验的目的并不在于完成一次实验得到实验结果，而在于通过这一次实验学会举一反三，切实地应用到以后的科研实验中去。

关于试剂盒的使用，我们不仅要明白如何使用，更要清楚其原理，明白用代称命名的一些试剂的用途以及可能成分，这非常有利于以后的科研工作。同时，操作过程中严格按照步骤进行，注意试剂的使用不要出错。

电泳图谱中第一块胶是提完DNA之后、进行PCR之前的样品所跑的电泳条带，能看出条带的表明提取到了DNA，第二块胶是PCR胶，条带明亮而集中不弥散的表明PCR扩增顺利。提取到DNA，但PCR胶无条带的可能是由于构建PCR体系时所加试剂有误。

制作进化树时需要用到英文网站以及一些软件，学会浏览英文网站，自学使用不熟悉的软件解决问题将成为将来科研工作道路中的重要技能。