S_rDNA鉴定细菌的方法

16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。

3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。

6.BLAST比对获取相似片段。

7.构建系统进化树试剂：1.1 培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。

）。

1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。

冷却到室温后调pH，每升高约下降0.03个单位。

(Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml 0.1mol/LTris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。

Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g N a2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。

(配置方法1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。

2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌。

3. 用NaOH调节pH值值8.0（约20g NaOH）。

注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。

4. 加去离子水将溶液定容至1L。

5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。

6. 室温保存。

）1.4 10×TE Buffer(缓冲液）(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。

1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。

高温高压灭菌，室温保存。

1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。

1.5 10%SDS（W/V）：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。

室温保存。

用之前在65℃溶解。

配置时要戴口罩。

6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。

7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。

用之前在65℃溶解。

8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。

9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl 平衡苯酚与氯仿/异戊醇。

10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。

浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。

11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。

12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。

13、EB：10 mg/ml。

称取1g溴化乙锭定容至100ml。

棕色瓶室温避光保存。

EB 的工作浓度为0.5ug/ml。

当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。

（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等）14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。

无需预处理。

15、RNase A：10 mg/ml。

25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。

）1.1细菌基因组DNA提取基本步骤：材料准备核算分离、纯化沉淀或吸附核酸，并去除杂质基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。

不同的方法所选择的试剂会有所不同。

1 快速微量提取法取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。

加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37o C水浴1hr。

然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。

取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

2 蛋白酶/SDS法制备用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次。

将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h-5h。

用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次。

（取上清液。

乙醇沉淀DNA。

用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。

3细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。

细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。

菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。

再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。

（此时菌液应为透明粘稠液体）。

抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。

12000rpm离心10min。

抽提两次。

（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）。

沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。

1 2000rpm离心10。

洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。

抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。

作PCR模板用。

5 CTAB/NaCl裂解法接两环菌（0.75ml甘油管菌液）于25ml LB培养基中，37℃、200r/min培养24h。

取1.5ml菌液于1.5ml Eppendorf 离心管中，8000r/min离心5分钟,弃去上清。

加入1.5ml TE离心洗涤后,用567 ul TE溶解菌体,混匀。

加入30μl 10%SDS和3 ul 20 mg/ml的蛋白酶K（100 ug/ml），混匀，于37℃温育1h。

加入100μl 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。

加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)（0.8ml）,混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。

上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)(0.8ml),混匀,12000r/min 离心5分钟,保留上清。

加入0.6倍的异丙醇（0.48ml）,轻轻混合直到DNA沉淀下来（0.5h）,12000r/min离心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min 离心5分钟洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5h。

用50 ul双蒸水溶解DNA, 加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃保存。

用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA , 每孔点样6μl (4μl样品+ 2μl loading buffer) , 80 V , 电泳1.5小时。

2.设计选择引物进行16S rDNA的PCR扩增一般细菌鉴定选择通用引物，最常用的通用引物为27F/1492R。

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'2.1 实验原理2.1.1 PCR多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。

此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。

ＰＣＲ技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。

反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。

PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理2.1.2 16SrDNA的核酸序列分析16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。

16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。

目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，方便快捷。

较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。

其序列包含10个可变区（variable region）和与之相同的11个恒定区（constant region），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。

2.1.3 PCR法的操作过程Step 1: DNA热变性；Step 2: 引物退火；Step 3: 引物延伸2.2 PCR反应标准体系DNA模板引物反应缓冲液dNTPddH2O耐热聚合酶2.2.1 PCR反应体系各组分的作用和使用量及反应条件ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。