细菌的接种分离与鉴定
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细菌的接种、分离与鉴定思路
邵阳市第一人民医院检验科 罗甫花
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1
常用细菌培养方法
• 需氧培养法（一般培养）
适用于需氧菌和兼性厌氧菌培养。 培养温度：37℃（采用恒温培养箱）。 培养时间：18～24h。
• 二氧化碳培养法
适用于奈瑟菌属和布鲁菌属等苛养菌培养。 可采用烛缸法、二氧化碳培养箱。
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5
接种方法
平板划线法
原则和目的：通过划线稀释细菌 获得单个菌落
• 要领：
G 划线均匀而细密，不重复。 A 充分的利用培养基的面积。 B 培养基不能划破。
GB 培养时培养皿倒置。
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6
培养时培养皿倒置的原因
一 防止培养基的水分蒸发 二 防止形成的冷凝水滴落在培养基上造成染菌 三 倒放可以在某种程度上防止菌落蔓延，好形 成单个菌落，利于计数 四 防止外来的污染
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7
平板划线法
（1）连续划线法
此法多用于含菌量相对少，无菌部位 来源的如血液，胸腹水，脑脊液等标本的 细菌分离培养。
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8
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9
（2）分区划线法（可分二区，三区和四区）
此法多用于含菌量较多的粪便、脓汁 等标本的细菌的分离培养。
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10
• 第一区划线 • 灭菌接种环 • 第二区划线 • 灭菌接种环 • 第三区划线
标记
培养。
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16
细菌分离培养
选择适合细菌生长的条件和温度
按无菌操作
选择适合细菌生长的培养基
接种量少
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17
革兰氏染色法步骤
一般包括初染、媒染、脱色、复染
1）涂片干后加热固定。 2）结晶紫染30s，水洗 3）加碘液约30s，水洗 4）加95%酒精数滴，摇动脱色，30秒-1 分钟，至无紫色脱落为止，水洗 5）加复红染色染，染30秒后，水洗。
黄杆菌属莫拉
菌属
一根鞭毛为绿脓
周鞭毛为产碱杆菌
IMVC
+ + - -为大肠
-- + +为产气和肺克
-+ - +为沙门
D + - -为志贺
PD 葡萄糖酸盐
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20
实验安排：
• 每人一个营养琼脂平皿做划线分离，要求分出 单个菌落。（培养时倒置）
• 每人一支营养琼脂斜面做斜面接种。
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21
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4
带菌接种环的正确烧法
• 热导法：从环的根部（靠近柄部）开始烧，通过热传导让 接种环或针上带的菌慢慢受热，直至干燥，最后放在氧化 焰（外层温度高）上彻底灭菌。
• 从还原焰开始法：（内层温度低），带菌的接种环或针直 接置于此不会引起气溶胶喷溅，待完全干燥后再移至氧化 焰部位彻底灭菌。
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新生霉素敏感试验R 腐生葡萄球菌
新生霉素敏感试验S 表皮葡萄球菌
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19
-b鉴定思路
Ox+双糖发酵型 OX+双糖-
乳糖- 弧菌科
S0为/1弧2h菌92R属o为2和+气霍单乱胞弧菌菌
非发酵菌科
Ox-双糖非发酵菌科
动力-NIT-不动杆菌
OX –双糖+ 肠杆菌科
动力+NIT+嗜麦牙单胞菌
鞭毛染色-为 端鞭毛为假单胞
2
• 微需氧培养法
适用于空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等微需氧菌培养。 可采用抽气换气法。
ຫໍສະໝຸດ Baidu• 厌氧培养法
适用于专性厌氧菌培养。 厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸 盐法等。
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3
细菌接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本 沾取标本
接种 灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
干燥，镜检。
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18
h2o2+
触酶+
微球乳菌科糖-
+C鉴定思路
触酶链球菌科
O/F试验氧化型 微球菌属
血浆凝固酶+ 金黄色葡萄球菌
O/F试验发酵型 葡萄球菌属
Mac生长试验阳性 肠链球菌属 α溶血Optochin
血浆凝固酶-
S为肺链 R为甲链
Mac生长试验阴性
β靛溶基血 质-
杆菌肽S为A群链 CAMP试验+为B群链
• 灭菌接种环
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11
（3）密集划线法 此法用于纸片药敏实验培养
用于药敏实验
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12
细菌在固体培养基中生长表现：
1、大小 （ mm表示。1mm以内露滴状；1-2mm小 菌落。2- -4mm中等大菌落；4-6mm以上称大菌落或巨 大菌落）
2、形状 （圆形、不规则形） 3、边缘 （整齐、锯齿状） 4、表面性状（光滑、粗糙、） 5、隆起度（扁平、隆起、中凸） 6、颜色及透明度（黄色、灰白、光泽、透明） 7、硬度（干燥、湿润、粘液） 8、溶血（在血培养基上的表现）
22
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13
• 试管培养基接种法
• 琼脂斜面接种法
该法主要用于纯种增菌及保存菌种，也可用 于某些生化鉴定试验如双糖铁培养基的接种。
斜面 培养 基
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14
• 手执塑料杆处
小指夹棉塞
• 试管口离火焰1cm
• 手执试管底露出斜面
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15
操作顺序：
接种环灭菌
勾取细菌
取棉塞 接种
塞棉塞
接种环灭菌
邵阳市第一人民医院检验科 罗甫花
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1
常用细菌培养方法
• 需氧培养法（一般培养）
适用于需氧菌和兼性厌氧菌培养。 培养温度：37℃（采用恒温培养箱）。 培养时间：18～24h。
• 二氧化碳培养法
适用于奈瑟菌属和布鲁菌属等苛养菌培养。 可采用烛缸法、二氧化碳培养箱。
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5
接种方法
平板划线法
原则和目的：通过划线稀释细菌 获得单个菌落
• 要领：
G 划线均匀而细密，不重复。 A 充分的利用培养基的面积。 B 培养基不能划破。
GB 培养时培养皿倒置。
可编辑版
6
培养时培养皿倒置的原因
一 防止培养基的水分蒸发 二 防止形成的冷凝水滴落在培养基上造成染菌 三 倒放可以在某种程度上防止菌落蔓延，好形 成单个菌落，利于计数 四 防止外来的污染
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7
平板划线法
（1）连续划线法
此法多用于含菌量相对少，无菌部位 来源的如血液，胸腹水，脑脊液等标本的 细菌分离培养。
可编辑版
8
可编辑版
9
（2）分区划线法（可分二区，三区和四区）
此法多用于含菌量较多的粪便、脓汁 等标本的细菌的分离培养。
可编辑版
10
• 第一区划线 • 灭菌接种环 • 第二区划线 • 灭菌接种环 • 第三区划线
标记
培养。
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16
细菌分离培养
选择适合细菌生长的条件和温度
按无菌操作
选择适合细菌生长的培养基
接种量少
可编辑版
17
革兰氏染色法步骤
一般包括初染、媒染、脱色、复染
1）涂片干后加热固定。 2）结晶紫染30s，水洗 3）加碘液约30s，水洗 4）加95%酒精数滴，摇动脱色，30秒-1 分钟，至无紫色脱落为止，水洗 5）加复红染色染，染30秒后，水洗。
黄杆菌属莫拉
菌属
一根鞭毛为绿脓
周鞭毛为产碱杆菌
IMVC
+ + - -为大肠
-- + +为产气和肺克
-+ - +为沙门
D + - -为志贺
PD 葡萄糖酸盐
可编辑版
20
实验安排：
• 每人一个营养琼脂平皿做划线分离，要求分出 单个菌落。（培养时倒置）
• 每人一支营养琼脂斜面做斜面接种。
可编辑版
21
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可编辑版
4
带菌接种环的正确烧法
• 热导法：从环的根部（靠近柄部）开始烧，通过热传导让 接种环或针上带的菌慢慢受热，直至干燥，最后放在氧化 焰（外层温度高）上彻底灭菌。
• 从还原焰开始法：（内层温度低），带菌的接种环或针直 接置于此不会引起气溶胶喷溅，待完全干燥后再移至氧化 焰部位彻底灭菌。
可编辑版
新生霉素敏感试验R 腐生葡萄球菌
新生霉素敏感试验S 表皮葡萄球菌
可编辑版
19
-b鉴定思路
Ox+双糖发酵型 OX+双糖-
乳糖- 弧菌科
S0为/1弧2h菌92R属o为2和+气霍单乱胞弧菌菌
非发酵菌科
Ox-双糖非发酵菌科
动力-NIT-不动杆菌
OX –双糖+ 肠杆菌科
动力+NIT+嗜麦牙单胞菌
鞭毛染色-为 端鞭毛为假单胞
2
• 微需氧培养法
适用于空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等微需氧菌培养。 可采用抽气换气法。
ຫໍສະໝຸດ Baidu• 厌氧培养法
适用于专性厌氧菌培养。 厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸 盐法等。
可编辑版
3
细菌接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本 沾取标本
接种 灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
干燥，镜检。
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18
h2o2+
触酶+
微球乳菌科糖-
+C鉴定思路
触酶链球菌科
O/F试验氧化型 微球菌属
血浆凝固酶+ 金黄色葡萄球菌
O/F试验发酵型 葡萄球菌属
Mac生长试验阳性 肠链球菌属 α溶血Optochin
血浆凝固酶-
S为肺链 R为甲链
Mac生长试验阴性
β靛溶基血 质-
杆菌肽S为A群链 CAMP试验+为B群链
• 灭菌接种环
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11
（3）密集划线法 此法用于纸片药敏实验培养
用于药敏实验
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12
细菌在固体培养基中生长表现：
1、大小 （ mm表示。1mm以内露滴状；1-2mm小 菌落。2- -4mm中等大菌落；4-6mm以上称大菌落或巨 大菌落）
2、形状 （圆形、不规则形） 3、边缘 （整齐、锯齿状） 4、表面性状（光滑、粗糙、） 5、隆起度（扁平、隆起、中凸） 6、颜色及透明度（黄色、灰白、光泽、透明） 7、硬度（干燥、湿润、粘液） 8、溶血（在血培养基上的表现）
22
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13
• 试管培养基接种法
• 琼脂斜面接种法
该法主要用于纯种增菌及保存菌种，也可用 于某些生化鉴定试验如双糖铁培养基的接种。
斜面 培养 基
可编辑版
14
• 手执塑料杆处
小指夹棉塞
• 试管口离火焰1cm
• 手执试管底露出斜面
可编辑版
15
操作顺序：
接种环灭菌
勾取细菌
取棉塞 接种
塞棉塞
接种环灭菌