溶血全套实验操作规程

溶血全套实验操作规程

一, 抗碱血红蛋白（HbF）测定

1.取抗凝血1-2ml, 用等渗盐水离心沉淀, 洗涤红细胞3-4次, 将洗涤后的红细胞按沉淀体

积加1.5倍蒸馏水和半量四氯碳, 用力震荡混合5-6分钟, 使红细胞完全溶解后离心20分钟, 上层即为100g/lHb液.

2.对照管: 100g/lHb液0.02ml, 再加5ml蒸馏水, 混匀.

3.测定管: 100g/lHb液0.1ml, 加入预温至25℃的0.083M的KOH1.6ml，同时开动秒表，

混匀数秒钟，至1min整，立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3.4ml，倒转混匀，过滤取上清夜。

4.分光光度计540nm，蒸馏水调零，分别测两管光密度。

HbF%=测定管光密度/（对照管光密度X5）X100

5.正常人1.0-3.1%，新生儿55-85%，一岁后接近正常人。

二，异丙醇试验

1ml7%异丙醇溶液，置有塞试管中，37℃水溶液预热数分钟后，加入0.1mlHb(10%)溶液，加塞混匀，计时观察，同时做正常对照。若放在37℃水溶液中，5min出现浑浊，40min 之内出现沉淀，则为阳性。

三，血浆游离血红蛋白测定

试剂（ml）标准管测定管空白管

1. 10g/L联苯胺0.5 0.5 0.5

2. 被检血浆（血清）——0.02 ——

3. 标准血红蛋白0.02 ————

4．1%HO 0.5 0.5 0.5

5．10%醋酸液 5 5 5

（注：1-4试剂混合后，于室温下静置20min, 再加5试剂）

10min后，用比色剂（0.5cm）测定各管的光密度，波长530nm空白管为比色对照。结果按下列计算：

血浆游离Hb(mg/L)=测定管光密度/标准管光密度（0.025）X100）

正常值：〈40mg/L

四，高铁血红蛋白还原实验

1，静脉采血1.5-2mL，加入含有38g/L枸橼酸钠抗凝剂的小瓶内，再加葡萄糖20mg.血液与抗凝剂按9：1混合，亦可用ACD抗凝。

2，将此血标本离心沉淀5分钟（1000R/M），或置于4℃冰箱24小时，待红细胞下沉后，吸取部分血浆，使血液与血浆之比约为1：1（相当于红细胞压积30-40%）

3，摇匀后，取此血液1.0毫升，加12.5%g/l亚硝酸钠-葡萄糖溶液和0.0004mol/L美兰液各

0.05ml,颠倒混合15次，使与空气中的氧气充分接触，加塞，37℃水浴（孵箱）保温3

小时（血不足用半量）。

4，取出后摇匀，吸取此血液0.1 ml,加于10ml0.02mmol/L磷酸盐缓冲液中，2分钟后，634nm 处（或红色滤光板）比色，用蒸馏水做空白，测定其光密度为A。

5，量取未加上述试剂，但同样孵育的血液0.1ml,按上述进行比色，测光密度为B，再于此液中加亚硝酸钠-葡萄糖溶液1滴，摇匀，5分钟后测定光密度为S。

结果：高铁血红蛋白还原率%=（1—A-B/S-B）X100%

正常值：〉75%

74-31%为杂合子，〈30%为纯合子

五，微量血红蛋白电泳

1，浸膜：将薄膜毛面朝下先漂浮于PH8.5TEB缓冲液中，待全部浸润后，用小镊子将其按入缓冲液中，至少15-20分钟。

2，点样：取出已浸透的薄膜，以滤纸吸取多余的水分。取被检者及正常人（比较用）5%的Hb液，点样要求匀，直，细。

3，电泳: 槽内PH8.5硼酸缓冲液,用两层纱布搭桥。毛面朝下置于桥上，点样端在负极约1cm 左右，150V，40-60分钟。

4，染色：将电泳槽内取出薄膜浸入染色液内，并不时翻动，约10分钟，取出放入漂洗液内直至薄膜底色度变白为止，取出晾干。

5，透明：将已干燥标本置透明液中浸泡15-20分钟，然后贴于玻板上阴干。（气温过高易失败）

六，HbA2定量

将漂洗的膜取出，剪下HbA2和HbA（包括HbF）带，分别浸于2毫升和10毫升浸出液中约20分钟，其间振摇数次，使色带完全洗脱。

（注意：在气温过高时，洗脱时间不可太长，否则洗脱液兰色减退，并逐步变为紫色）。用分光光度计，于620nm波长，用浸出液调零，测两者的光密度。

HbA2%=HbA2光密度/（HbA2光密度+5XhbA光密度）X100

正常值：（1.05-3.12）%

七，PH6.5电泳

将醋纤膜浸于PH6.5缓冲液中至少20分钟，取出醋纤膜，用滤纸吸取多余液体，点样于中线，同时用正常Hb液对照。用100V，电泳45分钟，用丽春红S染色。

结果：HbH移向阳极，HbBart’s在点样线上，其余各种Hb均移向阴极。

八，溶血试验（简易法）酸

洗涤两次的红细胞配成50%浓度

管别AB型血清50%RBC 0.2M（HCL）37℃水浴

—————

患者对照

测定管(ml) 0.5 0.025 ——0.05 1小时对照管（ml）0.5 ——0.025 ————

溶血为阳性

实验室试剂配制

1，0.083MKOH：0.1MKOH稀释12倍（PH必须大于12）

2，酸性半饱和硫酸铵：取硫酸铵（（NH3）2SO4）400g加蒸馏水500ml,置于37℃水浴24小时不断搅拌，使达饱和，再冷至25℃，搅拌一次，使过量的（NH4）2SO4析出，上清液为饱和液，取上清液400ml加1MHCL20ml。蒸馏水加至800ml，混匀室温保存（PH 必须大于3）

3，17%异丙醇溶液：17ML异丙醇加0.1mol/Ltris缓冲液（7.4）至100ml.PH大于7.2方可。4，10g/L（1%）联苯胺：10g联苯胺溶于90ml冰醋酸内，然后加蒸馏水至100ml，贮存棕