第一节层析技术

剂再次展开，进一步改善分离效果。 • 试样一般不需要经过预处理即可分离。
应用：平板色谱法在染料、农药、医药、 有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸 、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析 中经常被使用。也可以用于无机离子的分
离。还经常作为高效液相色谱的一种预试
方法。
4.显色、检测
有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下
用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显
色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。
特点及应用
• 平板色谱简单、方便、及操作费用低，
•
•
可以在一块层析板上同时展开多个试样及
采用方形薄层板还可以方便的进行二维展
将多条滤纸同时展开。
开，即按一般方法展开后，改变方向和展开
• 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小
• 洗脱体积 • 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，
为洗脱体积
Ve Vm K dVs
• 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗
脱体积也有所差异

• 色谱柱的理论塔板数、塔板高度 • 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与 •
最大限度地满足疏水的要求
• 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）
来增大蛋白质和多肽的疏水性
• 载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20 μm ）
• •
Hypersil Spherosil XOB075 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基 流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和 四氢呋喃
薄层色谱法
• 将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离
的方法 • 常用的固定相有： 硅胶和氧化铝 • 优点：
– – – – – 设备简单、操作方便 快速 显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色 灵敏度高（较纸层析） 可以大量制备
操作技术
1.层析纸和层析板
特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层
• 缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在
10~20m mol
• 层析方案的确定，需要视试验情况作适当调
整
• 洗脱方式：pH梯度
离子强度梯度
纸层析
• 是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定
性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量 分析
• 介质：滤纸 • 操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤
纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现 象从点样的一端向另一端流动，展开结束后， 取下滤纸，晾干，染色显迹
– 硅胶
– 硅藻土
– 纤维素 – 葡聚糖凝胶
• 固定相：通常选取各组分溶解度大的溶
剂作为固定相
• 流动相可以是极性的（反相色谱法），
也可以是非极性的（正相色谱） *反相色谱固定相是非极性的, 流动相是 极性的
HPLC
HPLC 色谱
反相液相色谱
• 反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质
的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相 作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应
展开剂的选择
• 展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂 • 常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：
正丁醇-甲酸-水（15：3：2）
• 展开方式：
– 上行色谱 – 下行色谱 – 径向色谱
纸层析和薄层层析分离过程
纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱 方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。 纸层析和薄层层析 流动相的移动是依靠毛 细作用。 将试样点在色谱滤纸 或层析板的一端，并将 该端浸在作为流动相的 溶剂（常称之为展开剂 ）中，随着溶剂向上的 移动，经过试样点时， 带动试样向上运动。
蛋白质分离常用的色谱方法
• 免疫亲和层析
属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高 度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的 分离 免疫亲和层析介质的获得：
（1）获得抗体
（2）抗体连接到载体上
• 疏水层析
在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水 基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团 相互作用，从而实现多组分的分离。
操作要点 蛋白质的局部变性 洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行
• 离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段
操作要点：
– 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离 程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以 用阴离子交换，可视具体情况而定 – 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通 常采用弱阳或弱阴离子交换剂 – 适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常 采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）
• 制备层析与分析层析的差异比较P126
• 二、层析的基本理论
色谱系统的基本组成
色谱分离的基本概念
• 分配系数 • 可由Langmuir（朗穆尔）方程得出
Kd
q c
• Kd---分配系数 • q、c---溶质在固相和液相中的浓度 • 吸附速率与吸附质气体分压和吸附剂表面 上吸附位置数成正比。
洗脱、检测、收集、层析剂再生和保存等步骤。 （一）介质的选择和准备 （二）装柱 （三）加样 （四）洗脱 （五）样品的检测与收集 （六）介质的清洗、再生和储存
四、分配色谱
• 原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系
数不同而分离的方法
• 要素：固定相、载体、流动相
• 载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 • 载体种类：
保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程 的基本热力学参数之一
• 阻滞因子Rt • 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与
固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比
Rf 溶质的迁移距离 流动相在色谱系统中的迁移距离
Rf
Am Am K d As
第一节层析技术
层析技术（色谱技术）
• 概念：色谱（层析）技术是一组相关分离方法的
总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）
和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同
（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解
吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。
• 分为制备型和分析型两种技术
色谱分离方法的分类
色谱分离方法很多，种类有四、五十种 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分， 有以下几种： 吸附（层析） 分配（层析） 离子交换（层析） 凝胶（层析）又叫分子筛层析技术 亲和层析 疏水层析
柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法：
N 5.54( tR W1/ 2 )
2
N 16(
tR Wb
)
2
• N---理论塔板数 tR---保留时间 • W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度 L H • 理论塔板高度：L---柱长
N
三、柱层析操作技术
• 操作流程主要包括：层析剂的选择、装柱、上样、
析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝 ，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.15 ～0.5mm）。干燥后即可使用。
2.展开剂
由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离
氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：
水=4：1：1。
3. 点样
用微量注射器或玻璃毛细管吸取 一定量试样点在原点上。试样点的直 径一般应小于5mm。可并排点多个试 样同时展开。