尿激酶原的研究概况

2、当血栓纤维蛋白暴露出E-片段，单链proUK能直接激活结合在该片段C-端两个赖氨酸残 基上的纤溶酶原，其活性增加500倍，产生大 量纤溶酶，使血栓纤维蛋白迅速溶解，因此 pro-UK是特异性的纤溶酶原激活剂。单链proUK被纤溶酶、嗜热杆菌金属蛋白酶完全激活后， 其比活性与尿激酶相同（1-1.2105 IU/mg，天 然尿激酶或尿激酶原的比活性的国际标准为
小鼠致畸胎试验结果表明，小鼠妊娠后 第615天，每天静注pro-UK 1、5、15、 45mg/kg，连续10天，5、15、45 mg/kg 各剂量组均有流产和母鼠死亡，1mg/kg 和 15mg/kg 组 存 活 的 胎 鼠 各 发 现 一 个 足 外翻畸形，畸形率为 0.9%和0.7%，均在 正 常 范 围 ， 5mg/kg 和 45mg/kg 组 及 溶 剂 对照组存活胎鼠未发现畸形。
三批pro-UK电泳结果
九、重组人尿激酶原的 临床前安全试验
1 急性毒性试验：
小鼠急性毒性试验结果显示，proUK 的 半 数 致 死 量 （ LD50 ） 97.5 mg/kg。在14天观察期内，小鼠体重 增加正常，未见任何异常，死亡率 为零。
2 pro-UK的长期毒性试验
Beagle狗的长期毒性研究结果表明，pro-UK 28mg/kg和8mg/kg组每次静脉滴注后可见牙 龈不同程度充血，给药后半小时明显减轻， 4 小时内恢复正常。用药后注射部位容易出 血，需要适当延长压迫止血时间。2mg/kg组 未观察到上述症状。28mg/kg 组动物的Tchol、 TP和Alb含量有升高趋势，凝血时间明显延 长，病理学检查未观察到药物造成直接的脏 器损伤。
五、pro-UK的化学结构
pro-UK由411个氨基酸残基组成的 单 链 多 肽 （ 简 称 pro-UK ） ， 分 子 量 约 为49KD左右，在302位天冬酰胺残基有 一 个 糖 链 ， 分 子 量 约 2320Da ， 由 岩 藻 糖、甘露糖、半乳糖和N-乙酰-葡萄糖 胺组成，在第18位苏氨酸残基上有一 个糖基岩藻糖，分子量180Da。其一 级结构如下图所示：
用沙门氏菌诱变性实验平皿掺入法检测 pro-UK对测试菌株TA97、TA98、TA100 和 TA102 的 致 突 变 作 用 。 结 果 表 明 ， pro-UK 在0.12000g/皿浓度范围内, 在活化和非 活化条件下，诱发四菌株产生的回变菌落 数与相应的自发突变率和 S9对照组相比无 明显增加，表明pro-UK对沙门氏菌无致基 因突变作用。
（4）连接区(第136-143位氨基酸残基)。
六、pro-UK的理化性质
pro-UK分子有四个酶切位点：
（1）第一个酶切位点在158位赖氨酸与 159位异亮氨酸之间，纤溶酶、激肽释 放酶、胰蛋白酶和半胱氨酸内肽酶及因 子Ⅻ可水解该酶切位点之间的肽键。 该位点被切开后，148位与279位的二硫 键将A链和B链相连接，A链C末端的赖氨 酸自动脱落，pro-UK即变成具有高度催 化活性的双链尿激酶(UK)；
子pro-UK相似；
（4）第四个酶切位点在156位的精氨酸与157 位的苯丙氨酸之间，凝血酶可水解该位点的肽 键，生成双链pro-UK，由148位与279位的二硫 键将A、B两条链相连接起来，其活性只有双链 UK的1/500，但其催化活性与生化特性与单链 pro-UK 相 似 。 纤 溶 酶 可 水 解 B 链 N- 端 第 157 和 158 两 个 氨 基 酸 ， 生 成 双 链 UK 。 pro-UK在溶液中不稳定，容易逐渐水解成小分 子尿激酶原或变成双链尿激酶，但其冻干品在
3). pro-UK的CHL细胞染色体畸变试验
pro-UK100、200、400g/ml分别 与 CHL 细胞接触培养 24、48小时(加 S96h) 收 获 细 胞 ， 三 个 剂 量 pro-UK 对 CHL细胞染色体畸变率均无明显影响， 也未见诱发CHL细胞染色体畸变及数 目改变。
4). pro-UK的生殖毒性研究
1mg/kg剂量组未见母鼠流产、死亡， 但个别母鼠仍见宫内轻度出血。 15mg/kg和45mg/kg组腭裂畸形率明显 增高，5mg/kg及1mg/kg组的腭裂畸形 率与空白对照组相当。实验结果提示， 该药与其它溶栓药一样，孕妇患者要 慎用。
十、pro-UK的一般药理学试验
通过小鼠(剂量：5.2、10.4、20.8mg /kg)， 大 鼠 ( 剂 量 :3.6 、 6.0 、 12.0mg/kg) ， 犬 ( 剂 量 : 0.6、1.2、2.4mg/kg)和豚鼠回肠 (剂量:110-6 和110-5g/ml)的一般药理学试验的结果表明， pro-UK对受试动物的一般行为、状态及中枢 神经系统、心血管系统、呼吸系统、消化系 统等均无明显影响。对出血时间和血小板凝 结功能也无明显影响。仅发现犬实验中手ຫໍສະໝຸດ Baidu 创面有渗血现象，实验结束后全身血液有类 似肝素化状态。
1985 国际血栓形成和止血委员会正式命名尿激 酶原为单链尿激酶型纤溶酶原激活剂。
1986 欧美开始小规模的临床研究，到1994年以 后开始大规模的临床试验，德国用大肠杆 菌表达的尿激酶原(Saruplase) 先后完成 了6775例心肌梗塞病人的临床试验。
1994 美国Abotte公司研制的尿激酶原(Prolyse) 做了400多例心肌梗塞和脑梗塞病人的临 床试验，现正在做第Ⅲ期临床试验。
2、细胞的微载体灌流培养
将工程细胞CL-11G细胞株从生产种子库取出，复 苏依次在方瓶、搅拌瓶、转瓶内培养，基础培养基为 DMEM/F12，再转入5升罐培养，细胞密度达到1×107细 胞/ml 后转入20L罐培养，采用多孔微载体无血清灌 流培养。待细胞密度达到1×107/ml左右时，采用间隙 更换部分微载体的工艺，即每隔10～15天更换约1/4 微载体，每天收集培养上清11.2个体积。我们用20L 罐连续培养91天，细胞密度最高达2.6×107/ml，共获 培 养 上 清 1909L, 平 均 活 性 为 6280IU/ml, 最 高 达 11200IU/ml，总产量达到113g。
二、尿激酶原的研究历史
1973 年Bernik从组织培养液中发现尿激酶原。 1970 年代末到1980年代初人们先后从新鲜人
尿、人和动物的正常细胞、肿瘤细胞中 纯化出单链尿激酶并命名为尿激酶原。 1980 年代中期开始，欧美日等发达国家用基 因重组技术克隆表达尿激酶原的工程菌 或工程细胞株纯化制备尿激酶原。
104,000IU/mg）。
尿激酶原作用机理示意图
UK，t-PA，SK
Pro-UK
plasminogen D-domain
E-domain
plasmin
plasminogen
E
plasmin
D E EAB E D CDF
E E A B E FDP CDF
E
E
D
Plasminogen
plasmin
plasmonogen plasmin
3、产品纯化制备工艺
采用Streamline SP-阳离子交换色谱— Sephacryl S-200HR凝胶色谱—对氨基苯甲醚 亲和色谱—QAE-Sepharose阴离子交换色谱四 步纯化工艺，从1909升培养上清，获得半成 品80g，回收率70%以上，纯度高于98%，单链 含量98%。半成品加入保护剂和赋形剂后， 经无菌过滤、分装、冻干，即成产品78.4g。 连续生产5批产品，其中三批样品送国家卫生 部生物制品检定所检定，23项指标全部合格。
（2） 第二个酶切位点在135和136两个赖 氨酸之间，高分子双链UK可被纤溶酶继续 水解该酶切位点，并脱去N-末端的第 136 位赖氨酸，变成低分子双链UK，分子量为 33KD，其活性与高分子UK相同； （3）第三个酶切位点在 143 位谷氨酸与 144 位亮氨酸之间，蛋白酶可裂解该肽键 产生分子量为32KD的单链低分子尿激酶原 (pro-UK)，其溶血栓活性生花特性与高分
八、尿激酶原的生产工艺
1、尿激酶原工程细胞的构建
将人体分泌尿激酶的Detroit562细胞RNA提取出 来，用反转录及基因重组技术得到构建了Detroit 562细胞cDNA文库，用合成的基因探针筛选获得人尿 激酶原全长cDNA，并构建成含人尿激酶原全长cDNA 的重组表达质粒pMTSVT-du，采用磷酸钙法将质粒转 染CHO细胞。经酶切鉴定正确后，最终挑选得到表达 水平最高的CL-11G工程细胞株。该工程细胞株进行 了一系列鉴定的结果表明，它符合生物制品生产细 胞的要求。
尿激酶原的研究概况
军事医学科学院生物工程研究所 张正光
一、前言
尿激酶原（Pro-urokinase, Pro-UK） 单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (Single-Chain Urokinase-type Plasminogen Activtor) 尿型纤溶酶原激活剂 (Urinary -type plasminogen activtor )
4. pro-UK的特殊毒性试验研究结果
1).小鼠骨髓细胞微核试验 昆 明 小 鼠 静 脉 注 射 pro-UK90mg
/kg后，12、24、36、48及72小时取 材检查，对多染红细胞微核率及红 系细胞造血均无明显影响。各取样 点的微核率及PCE/NCE值均在正常 范围之内。
2). pro-UK的遗传毒性研究
十一、pro-UK的药效学试验结果
11.1 pro-UK对家兔外源性血栓的溶栓作用:
用体外血栓形成仪制备血栓，染色后经颈静 脉注入家兔体内，观察不同剂量 pro-UK的溶栓 作用，并与UK进行比较。结果表明，pro-UK与 UK同等剂量的溶栓作用相似， pro-UK的溶血栓 功能随剂量增加而增强， 其溶栓率与对照组比 较差异非常明显 ( P0.001) ，正常家兔对注入 的血栓有一定生理性溶解作用。揭示pro-UK对 家兔试验性血栓有明显的溶解作用。
3 Wistar大鼠的长期毒性试验
大鼠静脉注射pro-UK 3、10和30mg/kg后， 三 个剂量组受试动物均未出现毒性反应症状，食 量、体重增长正常。13项血液学检查结果显示， RBC、Hgb、Reti、HCT、MCHC、MCH与对照 组比较有显著差别或非常显著差别（P 0.05, P 0.01 )，但都在正常范围波动，没有明显的时 效关系和量效关系。 TP、Alb与对照组比较有 升高趋势， APTT 时间明显延长，组织病理学 检查及脏器系数测定均未发现具有毒理学意义 的改变。
尿激酶原的结构
Pro-UK属于丝氨酸蛋白酶类，分子内有12 对二硫键。pro-UK分子按结构功能可分为四个 结构域，依次为： （1）表皮生长因子结构域(第5-49位氨基酸残 基），与表皮生长因子高度同源，其功能与促 进pro-UK的生物合成有关，该区有三对二硫键， 即在11与19、13与31、33与42氨基酸残基之间 各有一对二硫键； （2）Kringle（指环）结构域（第50-136位氨 基酸残基），其功能与血小板蛋白和细胞膜蛋 白结合有关，该区也有三对二硫键，即 50 与 130、71与113、102与126氨基酸残基之间各有
三、国内研究概况
〝七五〞期间，北京大学、南京大学和 军事医学科学院生物工程研究所开始研 究重组人尿激酶原，都得到国家科技部 〝 863 〞委员会的资助。我所率先获得 全长人尿酶原基因cDNA克隆，接着又 构建出高产工程细胞株。并于〝八五〞 中期和〝九五〞期间完成了重组尿激酶 原的中试工艺研究和临床前安全评价， 于2001年完成Ⅰ期临床试验。
一对二硫键；
（3）丝氨酸蛋白酶结构域(144-411位氨 基酸残基),位于其羧基端的His204、Asp255 与Ser356 三个氨基酸残基构成该酶的活性 中心，Asn302 为糖化位点, 该区共有5对 二硫键，即在 148-279、189-205、197 268、293-258和368-380氨基酸残基之间 各有一对二硫键；
4℃以下是稳定的。
七、尿激酶原的血栓溶解特异性
1、pro-UK本身活性很低，在血浆中只有 微弱的活性，对体内纤溶系统影响很小， 当给药剂量太大时（超过1mg/kg），部 分水解成双链UK，则对体内纤溶系统有 影响。pro-UK到达血栓表面，被那里的 纤溶酶激活，部分变成双链UK，后者激 活结合在血栓表面构型有所改变的纤溶 酶原变成纤溶酶，使血栓纤维蛋白部分 溶解。