基于vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR快速检测创伤弧菌的研究
TaqMan荧光PCR技术在霍乱弧菌毒力基因检测中的应用
TaqMan荧光PCR技术在霍乱弧菌毒力基因检测中的应用曲梅;黄芳;严寒秋;刘桂荣;窦相峰;刘园;吴晓娜;王全意【期刊名称】《中国预防医学杂志》【年(卷),期】2008(9)6【摘要】目的利用快速灵敏的TaqMan实时荧光定量PCR方法检测分离到的81株霍乱弧菌的毒力基因。
方法根据霍乱弧菌毒力基因ctxAB和zot分别设计特异性引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上对分离到的菌株进行毒力基因的检测。
结果81株霍乱弧菌中,有20株菌(24.7%)产CT毒素,来自于外环境的有19株;25株菌(30.9%)携带zot毒素基因;5株菌(6.2%)CT阴性而zot毒素基因阳性。
使用这两套系统检测其他肠道致病菌无交叉反应,检测限可达到2～20cfu/ml。
结论本研究所采用的TaqMan荧光定量PCR 检测霍乱弧菌毒力基因灵敏度高,特异性好,为今后霍乱日常监测和疫情应急处理提供快检的平台。
【总页数】4页(P546-549)【关键词】实时荧光PCR;霍乱弧菌;毒力基因【作者】曲梅;黄芳;严寒秋;刘桂荣;窦相峰;刘园;吴晓娜;王全意【作者单位】北京市疾病预防控制中心【正文语种】中文【中图分类】R446.9;R378.3【相关文献】1.应用改良的实时TaqMan荧光定量 RT-PCR技术检测口蹄疫病毒及其3D基因转录水平 [J], 石立立;顾潮江;张倩;张玮莹;李勇;鲁彬;何成;屈三甫;郑从义2.产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立 [J], 杨辉;龚成;吴丽娟;汪仕奎;蔡剑平;胡继红3.基于TaqMan实时荧光PCR技术检测转基因作物中的调控基因 [J], 罗建兴;海小;刘国强;其勒木格;郭梁4.四种基因定量方法对实时荧光PCR与微滴式数字PCR检测霍乱弧菌基因表达量的分析 [J], 唐静;贾俊涛;赵丽青;王静;张健;姜英辉;徐彪;王昌军;马云5.TaqMan荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立 [J], 黄世旺;卢亦愚;徐丹戈;方叶珍;徐昌平;包芳珍;高海明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PCR-微阵列法检测沿岸海水致病性创伤弧菌及危害评估
PCR-微阵列法检测沿岸海水致病性创伤弧菌及危害评估郑泽军;李永君;魏晓娜;朱琳;黄熙泰
【期刊名称】《海洋环境科学》
【年(卷),期】2009(28)2
【摘要】本研究建立了PCR和寡核苷酸探针阵列杂交技术,方便、快速、准确地检测了海水中创伤弧菌的存在状况。
本项检测针对创伤弧菌的两个重要毒性基因vvhA,viuB,其中viuB可以对普通环境株和致病株进行区分。
渤海湾沿岸6个采样点,共60个沿岸海水样本被用于这一方法的评估,得到了这些采样点所在区域创伤弧菌的分布,毒性株的存在状况的信息。
【总页数】4页(P211-214)
【关键词】创伤弧菌;海水;viuB;vvhA
【作者】郑泽军;李永君;魏晓娜;朱琳;黄熙泰
【作者单位】南开大学生命科学学院生化与分子生物学系;南开大学环境科学与工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】P734.4
【相关文献】
1.Western斑点印迹法检测致病性副溶血弧菌 [J], 杨靖亚;张建;赵勇;陶妍;陆小凡;晁若瑜
2.多重实时荧光PCR法快速检测水体中致病性弧菌的研究 [J], 周冬根;孙大为;倪
敏君;王燕;张升;翟敏
3.PCR-荧光法与 PCR-膜杂交法在检测 HPV-DNA 中的比较分析 [J], 赵一琳;崔映红;黄少芝
4.PCR-核酸薄膜层析法检测创伤弧茵 [J], 石琰璟;王建广
5.建立PC-PCR法快速、半定量检测养殖环境和水产动物中的致病性副溶血弧菌[J], 马妍;李健;王群;何玉英;王斌
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基于vvhA基因检测创伤弧菌实时荧光PCR方法的建立
基于vvhA基因检测创伤弧菌实时荧光PCR方法的建立李丹丹;徐义刚;邱索平;王昱;高会江;高慎阳【摘要】为建立创伤弧菌(W)的快速检测方法,根据whA基因序列设计合成引物和探针,建立实时荧光PCR方法.结果显示:所建立的方法能特异扩增出VV标准阳性菌株,而对其它14种菌株没有扩增;该方法的灵敏度为15 CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值(循环阈值)的变异系数均小于2％;利用该检测方法对采集的156份样品进行检测,共计检出2份VV阳性样品,与行标法(SN/T 1870-2007)检测结果一致.该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2016(032)009【总页数】4页(P31-33,70)【关键词】创伤弧菌;vvhA基因;实时荧光定量PCR【作者】李丹丹;徐义刚;邱索平;王昱;高会江;高慎阳【作者单位】海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心,海南海口570311;东北农业大学动医学院,黑龙江哈尔滨150001;从化出入境检验检疫局,广东从化510900;重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心,重庆404100;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牛遗传育种研究室,北京 100193;辽宁医学院畜牧兽医学院,辽宁锦州121001【正文语种】中文创伤弧菌(vibrio vulnificus，VV)是一种有荚膜的革兰氏阴性菌，广泛分布于蟹、虾、牡蛎等水生动物中，如果人类食用VV污染的食品会引发胃肠炎，严重时还会引发败血症[1-2]，病死率高达到50% 以上[3-4]，是对人类身体健康危害很严重的一种食源性致病菌。
近几年来，中国沿海地区由VV感染引起的人类食物中毒事件频繁发生[5-7]。
所以，建立一种能够快速、准确检测VV的方法刻不容缓。
实时荧光PCR方法由于灵敏度、特异性和精准度都比较高，现今已成为病原体检测的重要方法，并且发展迅速，在生命科学研究的各个领域都得到了广泛应用[8]9-11。
创伤弧菌溶细胞素vvhA融合蛋白细胞毒活性相关分子机制的探讨
创伤弧菌溶细胞素vvhA融合蛋白细胞毒活性相关分子机制的探讨桂静;朱晔晶;楼永良【期刊名称】《检验医学教育》【年(卷),期】2010(017)002【摘要】目的:研究创伤弧菌溶细胞素vvhA融合蛋白(rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(ECV304)凋亡过程中caspase-3,-8,-9活性变化.方法:应用MTT法、Hochest33342/pI荧光双染、流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳分析rVvhA对人ECV304细胞诱导凋亡的影响;比色法测定rVvhA诱导人ECV304凋亡过程中caspase-3,-8,-9活性变化.结果:MTT结果显示rVvhA具有降低人ECV304细胞的存活率活性;浓度为2.0HU/ml的rVvhA作用人ECV304,12小时后,其诱导凋亡的活性高于对照组和浓度为0.5HU/ml的rVvhA处理组,具有剂量依赖性;浓度为2.0HU/ml rVvhA处理组加40μM caspase全酶抑制剂(Z-VAD-FMK)后凋亡率较2.0HU/ml rVvhA处理组有一定程度降低.浓度为2.0HU/ml rVvhA处理人ECV304细胞30分钟后caspase-3活性开始增高,于3小时达高峰,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),caspase-8,-9活性无明显变化.结论:rVvhA对人ECV304具有凋亡诱导的生物学活性,caspase-3可能与活性rVvhA诱导的人ECV304凋亡有关.【总页数】6页(P43-48)【作者】桂静;朱晔晶;楼永良【作者单位】温州医学院,检验医学院,浙江,温州,325035;温州医学院,检验医学院,浙江,温州,325035;温州医学院,检验医学院,浙江,温州,325035【正文语种】中文【相关文献】1.创伤弧菌溶细胞素细胞毒性机制的研究进展 [J], 赵旭鸿;陆淼泉2.创伤弧菌溶细胞素基因在大肠杆菌中的表达及溶血活性鉴定 [J], 李桂军;楼永良;严杰3.创伤弧菌溶细胞素融合蛋白诱导人Jurkat-T淋巴细胞凋亡的研究 [J], 姚蔚;谢旦立;郭雅君;楼永良4.创伤弧菌溶细胞素基因重组蛋白复性条件的优化及溶血活性鉴定 [J], 李桂军;谢旦立;楼永良5.创伤弧菌溶细胞素融合蛋白重组、表达与细胞毒活性鉴定 [J], 桂静;肖美英;楼永良;胡蝶;严杰;朱晔晶因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
创伤弧菌溶血素基因vvhA质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用
㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(１):１４７~１５５ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０１.０２０收稿日期:２０２３－０４－０７基金项目:国家重点研发计划 食品安全关键技术研发 重点专项(２０１７ＹＦＣ１６０１４００)ꎻ山东省重点研发计划项目(２０２２ＴＺＸＤ００２２)ꎻ泰山学者工程专项经费资助(ｔｓｑｎ２０１９０９１６８)ꎻ山东省自然科学基金青年基金项目(ＺＲ２０２０ＱＣ２２６)ꎻ济南市 新高校２０条 项目(２０２２２８０６２)ꎻ山东省农业科学院国际科技合作专项(ＣＸＧＣ２０２２Ｆ０９)作者简介:袁玮(１９９７ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为食品微生物检测技术研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:７９４３９３６１７＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:陈相艳(１９７３ )ꎬ女ꎬ研究员ꎬ研究方向为食源性病原微生物检测及标准物质研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:３１５４７８８４５＠ｑｑ.ｃｏｍ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用袁玮１ꎬ２ꎬ陈蕾蕾１ꎬ２ꎬ杨金玉１ꎬ周庆新１ꎬ２ꎬ裘纪莹１ꎬ赵双枝１ꎬ付恩君１ꎬ赵国琰２ꎬ陈相艳１(１.山东省农业科学院农产品加工与营养研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业农村部新食品资源加工重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ２.山东师范大学生命科学学院ꎬ山东济南㊀２５００１４)㊀㊀摘要:针对我国缺乏适用于创伤弧菌检测的质粒标准样品的现状ꎬ本研究开展了创伤弧菌鉴定即用型定性质粒标准样品的研制和应用工作ꎮ首先构建了创伤弧菌毒力基因ｖｖｈＡ的重组质粒ꎬ经测序验证后制备成质粒标准样品冻干粉ꎬ然后对其进行ＰＣＲ定性检测及紫外分光光度计法定量分析ꎮ均匀性检验结果表明ꎬ样品间无显著差异ꎬ均匀性良好ꎬ符合预期目标ꎻ短期稳定性检验结果表明ꎬ样品能在４ħ㊁３７ħ条件下稳定保存１４天ꎻ长期稳定性检验结果表明ꎬ样品能在－２０ħ条件下稳定保存至少１２个月ꎮ研究结果表明ꎬ创伤弧菌质粒定性标准样品的均匀性和稳定性均符合国家定性标准样品的要求ꎬ为创伤弧菌的快速㊁高通量的定性鉴定分析提供了可靠的参考物质ꎮ将标准样品应用于鱼类㊁贝类等１０份海鲜类食品样品的检测中ꎬ经传统培养法验证ꎬ检测结果准确无误ꎮ本研究所研制的创伤弧菌质粒定性标准样品具有较好的商业应用潜力ꎬ为其在食品检测领域的推广应用奠定了重要基础ꎮ关键词:创伤弧菌ꎻ质粒定性标准样品ꎻ水产品ꎻ检测中图分类号:Ｓ８５２.６１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０１－０１４７－０９ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｅｒｔｉｆｉｅｄＰｌａｓｍｉｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｔｅｒｉａｌｆｏｒＨｅｍｏｌｙｓｉｎＧｅｎｅｖｖｈＡｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓａｎｄＩｔ ｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＡｑｕａｔｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＹｕａｎＷｅｉ１ꎬ２ꎬＣｈｅｎＬｅｉｌｅｉ１ꎬ２ꎬＹａｎｇＪｉｎｙｕ１ꎬＺｈｏｕＱｉｎｇｘｉｎ１ꎬ２ꎬＱｉｕＪｉｙｉｎｇ１ꎬＺｈａｏＳｈｕａｎｇｚｈｉ１ꎬＦｕＥｎｊｕｎ１ꎬＺｈａｏＧｕｏｙａｎ２ꎬＣｈｅｎＸｉａｎｇｙａｎ１(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄ＆ＮｕｔｒｉｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏ￣ｐｒｏｄｕｃｔｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｏｖｅｌＦｏｏｄＲｅｓｏｕｒｃｅｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＤｕｅｔｏｌａｃｋｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎＣｈｉｎａꎬａｒｅａｄｙ￣ｔｏ￣ｕｓｅｃｅｒｔｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｈｅｒｅｉｎ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｏｆｖｖｈＡｇｅｎｅｏｆＶ.ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｉｒｓｔｌｙａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｉｒｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｐｏｗｄｅｒｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｆｔｅｒｓｅｑｕｅｎ￣ｃｉｎｇｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｅｉｎｇｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＵＶｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ.Ｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｓａｍｐｌｅｓꎬａｎｄｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙｗａｓａｓｅｘｐｅｃｔｅｄ.Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｅ￣ｐａｒｅｄｐｌａｓｍｉｄｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｂｅｓｔａｂｌｙｐｒｅｓｅｒｖｅｄｆｏｒ１４ｄａｙｓａｔ４ħｏｒ３７ħꎬａｎｄｆｏｒａｔｌｅａｓｔ１２ｍｏｎｔｈｓａｔ－２０ħ.ＴｈｅｏｖｅｒａｌｌｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｖｖｈＡｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｍｅｅｔｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｎａｔｉｏｎａｌｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓꎬｗｈｉｃｈｐｒｏ￣ｖｉｄｅｄｒｅｌｉａｂｌｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＶ.ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ.Ｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ１０ｓｅａｆｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｓｕｃｈａｓｆｉｓｈａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈ.ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｏｂｅａｃｃｕｒａｔｅｂｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ.ＡｂｏｖｅａｌｌꎬｔｈｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｏｆｖｖｈＡｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｈａｄｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｃｏｍｍｅｒｃｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｌａｙｉｎｇａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｏｏｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓꎻＣｅｒｔｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌꎻＡｑｕａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓꎻＤｅｔｅｃｔｉｏｎ㊀㊀创伤弧菌(Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ)是一种革兰氏阴性菌ꎬ主要特性为嗜盐㊁喜温ꎬ自然分布于世界各地沿海和河口水域[１－２]ꎬ是一种人畜共患病原菌ꎬ容易感染鱼㊁虾㊁牡蛎㊁蛤㊁螃蟹等海产品ꎬ人类通过生食或食用未完全煮熟的海产品㊁破损皮肤直接接触被其污染的海水或海产品而患病[３]ꎮ创伤弧菌与霍乱弧菌㊁副溶血弧菌并称为人类三大致病弧菌[４]ꎬ弧菌感染病例具有明显的季节性ꎬ大多数发生在夏季和初秋气温较高的时期[５]ꎮ随着全球气候变暖㊁海洋温度升高等自然条件的变化ꎬ创伤弧菌的感染率也逐年增加ꎮ在全世界范围内创伤弧菌感染的死亡率高达６０％ꎬ在美国约为３３％ꎬ使其成为严重的公共卫生和食品安全问题[６－７]ꎮ创伤弧菌感染的主要症状包括肠胃炎㊁原发创伤性感染㊁败血症和坏死性筋膜炎等ꎬ免疫力低下或患有糖尿病㊁肝脏疾病等慢性基础病的患者属于易感人群[８]ꎮ创伤弧菌伤口感染通常以肿胀㊁红斑和剧烈疼痛为特征ꎬ潜伏期短ꎬ发病迅速ꎬ病变经常演变为可坏死的囊泡或充满液体的大泡ꎬ最终引起多脏器衰竭[９]ꎮ创伤弧菌菌体产生的创伤弧菌外毒素通过特定的毒力机制引发疾病ꎮ创伤弧菌毒力因子主要包括溶细胞素㊁铁载体㊁金属蛋白酶㊁荚膜多糖等[１０]ꎬ由ｖｖｈＡ基因编码的创伤弧菌溶细胞素是唯一分泌到细胞外的外毒素ꎬ具有创伤弧菌种属特异性ꎬ可作为鉴定创伤弧菌的指标[１１]ꎮ当前ꎬ对创伤弧菌进行定量检测主要通过平板计数㊁ＭＰＮ法等传统培养法ꎬ这些方法需要进行过夜培养㊁选择性平板分离㊁生化鉴定㊁血清学检测等繁琐的试验步骤ꎬ不仅耗时费力ꎬ同时样本中杂菌的过量繁殖也会对鉴别结果产生影响ꎮ另外ꎬ由于水产品中的创伤弧菌通常处于 活的且不可培养 的状态[１２－１３]ꎬ传统的培养方法很难对该部分创伤弧菌进行有效鉴定ꎬ严重降低了检测结果的准确度ꎮ作为最危险的食源性细菌之一ꎬ创伤弧菌造成了９５％的海鲜相关死亡ꎬ已成为一个主要的食品安全问题[１４]ꎮ随着食品供应链的全球化ꎬ创伤弧菌的定期监测变得更加重要ꎮ为了满足当下快速㊁高通量检测的需求ꎬ分子生物学方法在食品微生物的检测中得到了越来越广泛的应用ꎬ但相关的参考物质相对匮乏ꎮ食源性微生物检测即用型标准样品的研制ꎬ有助于解决目前国内食品微生物检测中存在的参考物质不足的难题ꎬ使具有自主知识产权的标准样品在相关领域得到更好的推广和应用ꎬ从而摆脱对国外标准样品的依赖ꎮ因此ꎬ建立创伤弧菌鉴定检测即用型质粒定性标准样品用于其快速㊁高通量鉴定ꎬ对提高水产品的质量安全㊁保证人类健康具有重要意义ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料１.１.１㊀菌株来源㊀创伤弧菌(ＣＩＣＣ２１６１５)来源于中国工业微生物保藏中心ꎮ１.１.２㊀主要试剂㊀琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司ꎻＰＮＣＣ增菌液基础培养基㊁ＰＮＣＣ添加剂㊁ｍＣＰＣ琼脂基础培养基㊁多粘菌素Ｅ㊁多粘菌素Ｂ购自北京陆桥技术股份有限公司ꎻ核酸染料ＧｅｌＳｔａｉｎ㊁Ｔｒａｎｓ１５０００ｍａｒｋｅｒ㊁Ｔｒａｎｓ２０００ｍａｒｋ￣ｅｒ㊁质粒大提试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司ꎻ５０ˑＴＡＥ缓冲溶液购自生工生物工程(上海)股份有限公司ꎻ２ˑＴａｑＰＣＲＭｉｘ㊁琼脂糖８４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀凝胶ＤＮＡ回收试剂盒㊁ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司ꎮ１.１.３㊀仪器和设备㊀ＺＨＷＹ－２００Ｈ恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司ꎻＳＷ－ＣＪ－２Ｄ双人净化工作台购自苏州净化设备有限公司ꎻＣ１０００ＴｏｕｃｈＰＣＲ仪㊁ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技公司ꎻＪＹ６００Ｃ水平电泳仪㊁ＪＹ０４Ｓ－３Ｃ凝胶成像系统购于北京君意东方电泳设备有限公司ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀重组质粒的获取与验证㊀创伤弧菌ｖｖｈＡ基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎬ获得重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡꎬ并保存于大肠埃希氏菌Ｔｏｐ１０菌株中ꎮ依据ＧＢ４７８９.４４ ２０２０«食品安全国家标准食品微生物学检验创伤弧菌检验»[１５]中创伤弧菌ＰＣＲ检测的引物序列ꎬ由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物(表１)ꎮ以重组质粒为模板ꎬ利用创伤弧菌鉴定引物ꎬ对目的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析ꎬ使用琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒对ＰＣＲ产物进行胶回收ꎬ使用ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒将ＰＣＲ纯化产物连接至ｐＬＢ－ｓｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ上ꎬ并转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ置于３７ħ培养箱培养１２ｈꎮ从平板上挑取单菌落ꎬ经ＰＣＲ反应鉴定为阳性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定ꎬ测序结果与预期一致的ꎬ即为验证正确的重组质粒ꎮ将携带正确重组质粒的大肠埃希氏菌于－８０ħ超低温冰箱中甘油管保存ꎮ㊀㊀表１㊀创伤弧菌ｖｖｈＡ基因的引物序列引物名称引物序列(５ᶄң３ᶄ)片段大小/ｂｐｖｖｈＡ－ＦＣＣＧＣＧＧＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＡｖｖｈＡ－ＲＣＧＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＧＧＧＣＣ５１９１.２.２㊀重组质粒的提取㊀将携带重组质粒的大肠埃希氏菌甘油管解冻ꎬ接入４ｍＬＬＢ液体培养基中ꎬ放入２００ｒ/ｍｉｎ的振荡摇床中３７ħ培养１２ｈꎬ取２ｍＬ种子液转接于２００ｍＬ的ＬＢ液体培养基中扩大培养ꎬ获取大量携带重组质粒大肠埃希氏菌的培养液ꎬ利用细菌质粒大提试剂盒提取质粒ꎮ琼脂糖凝胶电泳分析质粒完整性ꎬＰＣＲ验证目的基因ꎬ紫外分光光度计检测质粒的浓度和纯度ꎮ１.２.３㊀重组质粒的含量检测㊀取重组质粒样品１μＬꎬ于ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计中检测浓度ꎬ每管检测两次ꎮ１.２.４㊀重组质粒的分装㊀将大提的质粒样品混合至１管中ꎬ采用紫外分光光度计测定浓度ꎬ然后用无菌去离子水稀释至２０ｎｇ/μＬꎬ每管１００μＬ分装至螺口冻存管中ꎬ贴上标签ꎮ１.２.５㊀重组质粒的冷冻干燥㊀由于质粒样品较为稳定ꎬ分装后可直接冻干ꎮ在－２５ħ㊁真空度为５０Ｐａ条件下冻干２０ｈꎮ１.２.６㊀质粒定性标准样品的均匀性分析㊀按照随机抽号系统抽取的号码ꎬ抽取质粒定性标准样品１２管ꎬ用１００μＬ无菌水溶解质粒冻干粉ꎮ取０.５μＬ溶解的质粒样品作为ＰＣＲ模板ꎬ按照１.２.１方法进行基因定性检测ꎻ取质粒样品２μＬꎬ按照１.２.１方法琼脂糖凝胶电泳分析质粒样品的完整性ꎻ取质粒样品１μＬꎬ采用紫外分光光度计法进行复溶质粒样品的定量试验ꎬ检测样品的浓度ꎬ每管测两次ꎬ核酸含量＝核酸浓度ˑ水化体积ꎬ核酸含量结果统计分析采用方差分析法ꎮ１.２.７㊀质粒定性标准样品的稳定性分析㊀稳定性检验方法同均匀性检验ꎬ核酸含量结果统计分析采用单因素方差分析法ꎮ短期稳定性检验:采取两种短期稳定性试验ꎮ第一种模拟冰袋运输:在４ħ条件下的短期储存稳定性试验ꎬ随机取样２１管置于４ħ保温箱ꎬ分别在第１㊁３㊁５㊁７㊁９㊁１１㊁１４天每天检测３管ꎬ每管２个重复ꎻ第二种模拟高温运输:在３７ħ条件下稳定性试验ꎬ随机取样２１管置于３７ħ保温箱ꎬ分别在第１㊁３㊁５㊁７㊁９㊁１１㊁１４天时每天检测３管ꎬ每管２个重复ꎮ长期稳定性检验:质粒样品经冷冻干燥后ꎬ需要在－２０ħ条件下长期冷冻保存ꎮ为了测定质粒样品长期保存时间及其稳定性ꎬ每次检测时ꎬ从冷冻样品中随机取出３管样品ꎬ每管重复２次ꎮ抽样时间点遵循先密后疏的原则ꎬ分别在第１㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２个月共７个时间点抽样检测ꎮ１.２.８㊀创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测中的应用㊀食品样本的前处理:将购买的食品样本按照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０要求处理ꎬ在无菌条件９４１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用下ꎬ称取鲫鱼㊁偏口鱼㊁银鲳鱼㊁鲤鱼㊁鲅鱼㊁黄花鱼６种鱼类样品的表面组织㊁肠和腮各２５ｇꎬ花蛤㊁海蛎子和生蚝３种贝类样品内容物各２５ｇꎬ明虾的头足部组织２５ｇꎬ分别放入含２２５ｍＬＰＮＣＣ增菌液的无菌均质袋ꎬ用拍打式无菌均质器拍打２ｍｉｎ制成样品匀液ꎻ将均质袋放入培养箱３７ħ培养１８ｈ获得增菌液ꎬ取距液面１ｃｍ深处菌液１ｍＬ放入离心管中ꎬ９０００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ去上清ꎻ用１ｍＬＰＢＳ磷酸盐缓冲液悬浮清洗后９０００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ去上清ꎬ重复２次ꎻ加入１ｍＬ无菌去离子水ꎬ煮沸１０ｍｉｎꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ吸取上清液ꎮＰＣＲ分析:将上清液用作ＰＣＲ反应的ＤＮＡ模板ꎻ随机抽取１管创伤弧菌重组质粒定性标准样品ꎬ加入１００μＬ无菌去离子水溶解ꎬ作为阳性对照ꎻ将大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０００３基因组ＤＮＡ冻干粉用３００μＬ无菌水溶解(终浓度为２０ｎｇ/μＬ)后作为阴性对照ꎻ无菌去离子水为空白对照ꎬ按照１.２.１的方法进行ＰＣＲ分析ꎮ创伤弧菌的分离验证:取检测为阳性的食品样本的增菌液ꎬ用接种环将其划线接种于ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板ꎬ３７ħ培养１８ｈꎬ验证菌落形态是否符合创伤弧菌菌落形态特征ꎬ即圆形㊁扁平ꎬ光照下透明但中心不透明的黄色或橘黄色菌落ꎬ直径１~２ｍｍꎮ创伤弧菌的生化鉴定:按照ＧＢ４７８９.４４２０２０进行创伤弧菌的培养和生化特性鉴定ꎮ１.３㊀数据统计与分析使用ＳＰＳＳ２６.０软件的ＡＮＯＶＡ法进行单因素方差分析ꎬ统计各处理组之间的差异性ꎬ数据用平均值ʃ标准误 表示ꎬＰ<０.０５表示差异显著ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀创伤弧菌重组质粒的验证以创伤弧菌重组质粒为模板ꎬ对其进行目的基因ＰＣＲ扩增验证ꎬ以大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０００３为阴性对照ꎬ无菌去离子水为空白对照ꎮ琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ扩增结果(图１Ａ)显示ꎬ创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ基因为阳性ꎬ条带清晰ꎬ片段大小为５１９ｂｐꎬ符合目的条带大小ꎬ说明成功构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ重组质粒ꎬ质粒图谱如图１Ｂ所示ꎮＭ:Ｔｒａｎｓ２０００ｍａｒｋｅｒꎻ１:ｖｖｈＡ质粒ꎻ２:阴性对照ꎻ３:空白对照ꎮ图１㊀创伤弧菌重组质粒ＰＣＲ扩增(Ａ)及ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡ重组质粒图谱(Ｂ)２.２㊀创伤弧菌重组质粒的浓度及纯度分析取重组质粒１μＬꎬ利用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００测定其浓度和纯度ꎬ结果如表２所示ꎬＡ２６０/２８０㊁Ａ２６０/２３０均超过１.８ꎬ说明所提取的质粒纯度高ꎬ无蛋白质和有机物污染ꎻ对其携带的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果(图２Ａ)显示ꎬ目的基因ｖｖｈＡ条带单一且片段大小符合预期ꎬ质粒完整性分析(图２Ｂ)显示质粒条带完整ꎬ说明所制备的质粒符合预期ꎮ㊀㊀表２㊀创伤弧菌重组质粒的浓度与纯度样品管号浓度/(ｎｇ/μＬ)Ａ２６０/Ａ２８０Ａ２６０/Ａ２３０ＶＡ１１６７.０１.８６２.２１ＶＡ２１８９.５１.８８２.２９ＶＡ３１７３.６１.８８２.２６ＶＡ４８２.１１.８９２.５３０５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀Ｍ:Ｔｒａｎｓ１５０００ｍａｒｋｅｒꎻ１~８:ｖｖｈＡ质粒样品ꎮ图２㊀创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ的ＰＣＲ扩增(Ａ)及质粒完整性(Ｂ)分析㊀㊀将４管大提的创伤弧菌重组质粒样品混合至１管中ꎬ采用紫外分光光度计测定浓度ꎬ然后用无菌去离子水稀释至２０ｎｇ/μＬꎬ取１００μＬ分装至２ｍＬ螺口冻存管中ꎬ所有质粒溶液分装４５０管后ꎬ置于真空冷冻干燥机中按照冷冻程序真空冷冻干燥ꎬ获得白色粉末状的冻干质粒样品ꎬ设计创伤弧菌重组质粒定性标准样品标签纸ꎬ打印并贴在管外(图３)ꎮ质粒定性标准样品置于－２０ħ冰箱冻存ꎮ２.３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的均匀性分析从４５０管质粒标准样品中随机抽取１２管进行ＰＣＲ定性试验ꎬ结果如图４Ａ所示ꎬ各管ＰＣＲ扩增目的基因均为阳性ꎬ条带单一且清晰ꎬ图４Ｂ显示质粒完整无降解ꎮ使用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计进行质粒标准样品的浓度㊁纯度分析ꎬ对所测数据进行单因素方差分析ꎬ结果如表３所示ꎬ在９５％的置信概率下ꎬＦ值小于Ｆ临界值ꎬ各管间质粒含量无显著性差异ꎬ表明质粒定性标准样品均匀性良好ꎮ图３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~１２:ｖｖｈＡ质粒标准样品ꎮ图４㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ)及均匀性(Ｂ)分析㊀㊀表３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品均匀性试验方差分析平方和ＳＳ自由度均方ＭＳＦ值Ｆ临界值置信概率Ｐ值组间０.０２１１１０.０２２.７００２.７２０.９５０.０５１组内０.００８１２０.０１２.４㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的稳定性分析温度是运输过程中影响质粒定性标准样品质量的主要因素ꎬ因此设计不同温度模拟质粒样品运输条件ꎬ以质粒标准样品目的基因阳性检出㊁质粒完整性及核酸含量变化确定其短期稳定性(运输稳定性)ꎮ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品分别在４ħ和３７ħ条件下保存１４ｄꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果(图５㊁图６)显示第１天和第１４天目的基因均为阳性ꎬ电泳条带单一ꎬ符合预期条带大小ꎬ质粒无降解ꎻ质粒含量统计学分析结果如图７所示ꎬ各时间点间无显著性差异ꎬ表明质粒含量无明显变化ꎬ说明质粒定性标准样品在上述条件下是稳定的ꎮ因此创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品可与冰袋(４ħ)一起运输ꎬ也可在温度较高(３７ħ)且无降温装置条件下运输ꎮ１５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~６:ｖｖｈＡ质粒标准样品ꎻ７:阴性对照ꎻ８:空白对照ꎬ下同ꎮ图５㊀４ħ条件下保存１天创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图６㊀３７ħ条件下保存１４天创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图７㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准㊀㊀样品短期稳定性定量分析为了分析创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的长期稳定性ꎬ在第１㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２个月随机抽取３管样品进行定性和定量分析ꎮ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在－２０ħ条件下保存１２个月ꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果显示第１个月和第１２个月目的基因均为阳性ꎬ电泳条带单一ꎬ符合预期条带大小(图８Ａ㊁Ｂ)ꎬ质粒无降解(图８Ｃ㊁Ｄ)ꎮ质粒含量统计学分析结果如图９所示ꎬ各时２５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀间点间无显著性差异ꎬ表明质粒定性标准样品在－２０ħ条件下稳定ꎬ说明创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品能在－２０ħ条件下稳定保存至少１２个月ꎮ图８－２０ħ条件下保存１㊁１２个月创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图９－２０ħ条件下创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒㊀㊀定性标准样品长期稳定性定量分析２.５㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在水产品检测中的应用为了验证创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在水产品检测中的应用效果ꎬ将其作为阳性对照ꎬ参照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０的方法ꎬ利用ＰＣＲ对１０种水产品中的创伤弧菌基因ｖｖｈＡ进行检测ꎬ每种样品取样７次ꎬ每个样品７个重复ꎮ结果如表４所示ꎬ在１０种水产品样本中检测出１例ｖｖｈＡ基因阳性ꎮ将阳性样本的增菌液划线至创伤弧菌鉴定平板ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板中ꎬ每种平板重复划线３次ꎬ３７ħ培养１８ｈꎬ平板菌落为黄色㊁圆形且扁平(图１０)ꎮ挑取菌落按照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０要求进行生化鉴定(图１１㊁表５)ꎬ验证此阳性样本感染创伤弧菌ꎮ㊀㊀表４㊀海鲜样品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ检出结果海鲜类型检测份数检出阳性次数鱼类６０贝类３１虾类１０总计１０１㊀㊀表５㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ阳性样本生化鉴定结果项目结果赖氨酸紫色氨基酸对照黄色无盐胰胨水微弱生长６％氯化钠胰胨水生长旺盛８％氯化钠胰胨水不生长１０％氯化钠胰胨水不生长Ｖ－Ｐ半固体穿刺周围扩散增长３５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用图１０㊀ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板创伤弧菌菌落特征图１１㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ阳性样本菌体的生化鉴定结果３㊀讨论与结论本研究构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ的重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡꎬ经测序验证后ꎬ将质粒样品真空冷冻干燥制成创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品冻干粉ꎮ对其进行均匀性和稳定性分析ꎬ检测结果均为阳性且符合目的基因片段的大小ꎬ质粒样品无降解ꎻ均匀性分析定量检测结果表明ꎬ质粒定性标准样品无管间差异ꎬ均匀性良好ꎻ稳定性分析定量检测结果表明ꎬ质粒定性标准样品在低温(４ħ)或高温(３７ħ)下可稳定保存１４天ꎻ在－２０ħ下长期存储１２个月ꎬ亦未观测到不稳定性ꎮ将所研制的创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品应用于１０种海鲜产品的检测ꎬ检出１份阳性样本ꎬ经传统培养法和生化鉴定验证ꎬ证实阳性样本确为创伤弧菌污染ꎬ表明质粒定性标准样品能够满足水产品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ的快速㊁精确检测ꎮ该研究填补了我国创伤弧菌鉴定即用型质粒定性标准样品的空白ꎬ为创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测领域的应用研究打下了良好的基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＹｕｎＮＲꎬＫｉｍＤＭ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ:ａｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｔｈｒｅａｔｔｏｐｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ[Ｊ].ＫｏｒｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉ￣ｃｉｎｅꎬ２０１８ꎬ３３(６):１０７０－１０７８.[２]㊀Ｈｅｒｎáｎｄｅ￣ＣａｂａｎｙｅｒｏＣꎬＡｍａｒｏＣ.ＰｈｙｌｏｇｅｎｙａｎｄｌｉｆｅｃｙｃｌｅｏｆｔｈｅｚｏｏｎｏｔｉｃｐａｔｈｏｇｅｎＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ[Ｊ].ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ２２(１０):４１３３－４１４８.[３]㊀彭钟琴ꎬ黄璐.水产品中创伤弧菌检测方法的研究进展[Ｊ].食品安全导刊ꎬ２０２１(３６):１９０－１９２.[４]㊀ＷａｎｇＭＹꎬＨｕＣＪ.ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓｏｆＶｉｂ￣ｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ｒｅｓｅａｒｃｈａｄｖａｎｃｅｓ[Ｊ].ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏ￣ｅｃｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２９(１２):１４７０－１４７３.[５]㊀ＩｗａｍｏｔｏＭꎬＡｙｅｒｓＴꎬＭａｈｏｎＢＥꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｓｅａ￣ｆｏｏｄ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ[Ｊ].ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉ￣ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓꎬ２０１０ꎬ２３(２):３９９－４１１.[６]㊀ＪｏｎｅｓＭＫꎬＯｌｉｖｅｒＪＤ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ｄｉｓｅａｓｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｅｓｉｓ[Ｊ].ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙꎬ２００９ꎬ７７(５):１７２３－１７３３.[７]㊀ＨｅｎｇＳＰꎬＬｅｔｃｈｕｍａｎａｎＶꎬＤｅｎｇＣＹꎬｅｔａｌ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｂｕｒｄｅｎ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ８:９９７.[８]㊀ＨｏｒｓｅｍａｎＭＡꎬＳｕｒａｎｉＳ.ＡｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃａｕｓｅｏｆｓｅｖｅｒｅｓｅｐｓｉｓａｎｄｓｋｉｎａｎｄｓｏｆｔ￣ｔｉｓｓｕｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓ￣ｅａｓｅｓꎬ２０１１ꎬ１５(３):ｅ１５７－ｅ１６６.４５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀[９]㊀Ｂａｋｅｒ￣ＡｕｓｔｉｎＣꎬＴｒｉｎａｎｅｓＪꎬＧｏｎｚａｌｅｚ￣ＥｓｃａｌｏｎａＮꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｃｈｏｌｅｒａｖｉｂｒｉｏｓ:ｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｂａｒｏｍｅｔｅｒｏｆｃｌｉｍａｔｅｃｈａｎｇｅ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２５(１):７６－８４.[１０]ＬｉＧꎬＷａｎｇＭＹ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｉｎｉｔｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｐｓｉｓ[Ｊ].ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌｏｇｉｃａꎬ２０２０ꎬ６５(２):２６５－２７４.[１１]ＧａｖｉｎＨＥꎬＢｅｕｂｉｅｒＮＴꎬＳａｔｃｈｅｌｌＫＪ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｒｄｏｍａｉｎｒｅ￣ｇｉｏｎｏｆｔｈｅＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓＭＡＲＴＸｔｏｘｉｎｃｏｎｆｅｒｓｂｉｐｈａｓｉｃｅｐｉ￣ｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎａｎｄｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｓｙｓｔｅｍｉｃｓｐｒｅａｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０１７ꎬ１３(１):ｅ１００６１１９.[１２]ＲａｏＮＶꎬＳｈａｓｈｉｄｈａｒＲꎬＢａｎｄｅｋａｒＪＲ.Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎬｒｅｓｕｓｃｉｔａ￣ｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎａｌｙ￣ｓｅｓｏｆｖｉａｂｌｅｂｕｔｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｓｅａｗａｔｅｒ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ３０(８):２２０５－２２１２.[１３]包秋华ꎬ刘倩宇.基于ＷｅｂｏｆＳｃｉｅｎｃｅ细菌活的非可培养状态研究文献的可视化分析[Ｊ].食品科学ꎬ２０２３ꎬ４４(５):２４８－２５６.[１４]ＺｈａｎｇＸꎬＧｕｏＢꎬＹａｎｇＬＨꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ１２ａｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉ￣ｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｏｎｅｔｕｂｅ[Ｊ].ＡｃｔａＢｉｏ￣ｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＳｉｎｉｃａꎬ２０２３ꎬ５５(２):３２２. [１５]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准:食品微生物学检验创伤弧菌检验:ＧＢ４７８９.４４２０２０[Ｓ].北京:中国标准出版社ꎬ２０２０.５５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用。
海洋创伤弧菌LAM P快速诊断方法的建立与评价
海洋创伤弧菌LAM P快速诊断方法的建立与评价张丽娜;王明义;杨小蕾;曹源;张萍萍;胡成进【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2016(037)005【摘要】目的：利用环介导等温扩增（LAM P）技术，建立海洋创伤弧菌快速、简便、特异且敏感的检测方法，并对该方法的特异性和灵敏度进行评价。
方法选取海洋创伤弧菌溶细胞素（vvhA）基因作为靶基因，根据GenBank公布的序列设计4条LAMP引物；对47株细菌（包括20株弧菌属细菌）进行LAMP和聚合酶链式反应（PCR）扩增，并做特异性比较；对创伤弧菌M06株增菌液10倍倍比稀释，提取DNA后进行灵敏度的检测，并与常规PCR作比较；构建含vvhA 基因片段的重组质粒，作为LAM P反应体系的标准阳性对照。
结果常规PCR实验出现假阳性结果，而LAM P实验只有海洋创伤弧菌出现阳性扩增，其他样品均为阴性，无假阳性和假阴性结果，表明引物的特异性较好，加入钙黄绿素和电泳结果相一致；针对vvhA基因建立的LAMP技术其最低检测下限为每个反应4×10 CFU ，是常规PCR（每个反应4×102 CFU ）的10倍，呈现较好的灵敏度。
重复实验过程两遍，PCR和LAMP技术检测结果稳定。
结论建立了一种用于检测海洋创伤弧菌的LAMP检测方法，该方法特异性强，灵敏度高，方便快捷，特别适合用于现场和床旁的快速检测。
【总页数】4页(P577-579,582)【作者】张丽娜;王明义;杨小蕾;曹源;张萍萍;胡成进【作者单位】辽宁医学院，辽宁锦州121001;威海市立医院，山东威海264200;济南博科生物科技有限公司，山东济南250100;济南军区总医院，山东济南250031;辽宁医学院，辽宁锦州121001;济南军区总医院，山东济南250031【正文语种】中文【相关文献】1.禽流感病毒 LAMP 快速诊断方法的建立 [J], 王辰雨;胡敬东;史玉颖;宋敏训;张鹤晓2.焦磷酸测序快速检测3种海洋性弧菌的方法学建立及创伤弧菌16S rRNA基因分型的研究 [J], 张丽娜;郑妍;胡成进;周月霞;陈英剑3.动物饲料中沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)快速诊断方法的建立 [J], 孙园园;赵鹏4.海产品中创伤弧菌实时浊度LAMP检测方法的建立 [J], 薛超波;黄朱梁;孙瑛;王萍亚5.鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用 [J], 谢晶;康润敏;于吉锋;周泷;曹冶;林毅;李兴玉;肖璐;叶勇刚;潘梦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
用基于TaqMan探针的Real-time PCR技术定量检测副溶血弧菌
用基于TaqMan探针的Real-time PCR技术定量检测副溶血弧菌蔡潭溪;蒋鲁岩;黄克和【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2005(45)4【摘要】副溶血弧菌是一种引起食源性疾病的重要病原菌,传统的鉴定方法费时费力且容易出现假阴性,建立一种定量检测副溶血弧菌基因的方法尤为重要.根据GenBank公布的副溶血弧菌的gyrB基因序列设计一对引物和TaqMan探针,建立了基于TaqMan探针的Real-time PCR方法.通过对9种细菌(12株菌株)的DNA 进行扩增,结果所有4株副溶血弧菌均可产生扩增曲线,其他8株非副溶血弧菌均不产生扩增曲线,证明了引物和探针具有很高的特异性.细菌纯培养物品和人工布菌的检测敏感度分别为1 CFU/PCR反应体系和10 CFU/PCR反应体系,相关系数均为0.99(r2=0.99),整个试验可在1h内完成.建立的方法可用于海产品中副溶血弧菌的快速定量检测.【总页数】5页(P638-642)【作者】蔡潭溪;蒋鲁岩;黄克和【作者单位】南京农业大学动物医学院,南京,210095;江苏省出入境检验检疫局,南京,210001;南京农业大学动物医学院,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】Q81【相关文献】1.基于DNA染料EMA的RT-PCR技术定量检测海产品中病原性副溶血弧菌活细胞 [J], 祝儒刚;吕淑霞;刘月萍;张良2.基于TaqMan探针的双重荧光定量PCR方法检测海产品中的副溶血弧菌 [J], 王淑娜;周向阳;胡兴娟;沈飚;贝文联;朱应伟;陈健舜;方维焕3.基于SYBR Green Ⅰ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7方法的建立[J], 赵娟娟;徐华林;陶弋婧;郭萌萌;周涯;陈超;秦娜琳;郑静;田丹4.基于TaqMan探针的Real-time PCR定量检测空肠弯曲杆菌 [J], 阳成波;蒋原;黄克和;祝长青5.基于Taqman探针三重Real-Time RT-PCR检测PEDV、TGEV、PoRV方法的建立与应用 [J], 李儒曙; 苏惠龙; 蒋郁明; 邓湘辉; 黄铮; 赵福振; 罗宝正因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
用基于TaqMan探针的Real-timePCR技术定量检测副溶血弧菌
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结果
%&’()*+,& -.% 的特异性 定量 !D= 的结果显示， 所有 O 株副溶血弧菌均能产生 ?
（N,, ， < 个 4D0? 平板 FI 板） <PT 培养 NOH 后进行菌落记数， ! 取平均值。挑取可疑的绿色菌落划线接种柯玛嘉平板， 培养 后挑取粉红色的单个菌落， 利用生物梅里埃公司 MU4&V<N 细 菌鉴定系统进行副溶血弧菌鉴定。 !"$ !"$"! %&’()*+,& -.% 模板 WE- 的提取： 取 *$F 细菌纯培养液或样品匀
型扩增曲线， 而其他 R 株非副溶血弧菌均不能产生 ? 型扩增 。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果与 =%5.C 曲线 （图 *） 进一步证实了本试验的特异性。 3#$% !D= 一致，
浆， 用细菌基因组 WE- 抽提试剂盒进行抽提， 通过蛋白核酸 分析仪测定 WE- 的 "#NS, I "#NR, 比值来确定 WE- 的纯度。 （ =1AH%） 上进 !"$"/ !D= 扩 增： !D= 扩 增 反 应 在 F#GH3D2A.%" ： 不同浓度的模板 WE- N 行， 反应体系 （N, F） F，*, X 456758 ! ! 缓冲液 N ! ， F， 9 $$1.IF 7GD.N O F N9$$1.IF /E4! 7#’3@"% N F， ! ! ,+N $1.IF 456758 探 针 * F， ,+9 ! $1.IF 引 物 各 * F， ,+99Y ! ! ! 超纯水 S+O N+9YI! F !$% 聚合酶， F。反应条件： Q9T YEJ 酶， ! *,$#8； Q9T <)， S,T N,)， PNT *,)， O, 个循环。温度转换率为 在每个循环的延伸阶段收集荧光信号， 荧光收集模 N,T I)， 式设为 ;* I;N 。!D= 结束后， !D= 产物用 NK 的琼脂糖凝胶电 泳进行鉴定。 !"0 制作标准曲线 取 *$F 副溶血弧菌纯培养液， *, 倍梯度稀释至终浓度 按上述步骤提取 WE*+, X *, D;YI$F 到 *+, X *, D;YI$F，
TaqManTM实时荧光PCR快速检测副溶血性弧菌的初步研究
TaqManTM实时荧光PCR快速检测副溶血性弧菌的初步研究摘要】目的：建立TaqManTM实时荧光pcr检测副溶血性弧菌的快速检测方法，为食物中毒快速准确的定性检测及食品中副溶血性弧菌染菌率的调查提供手段。
方法：通过分析，最终选择tlh基因作为目的基因，在Genebank进行中查找多条TLH基因序列，并利用DNAssist软件进行同源性分析，选取相对保守区段，用Beacon Designer软件自行设计引物和TaqManTM探针，并利用核酸提取试剂盒煮沸法制备基因组DNA，通过对TaqManTM实时荧光PCR缓冲液浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度和探针浓度等反应条件的优化，初步建立副溶血性弧菌的TaqManTM实时荧光PCR快速检测方法。
结果：选取的tlh基因同源性达到98.9%以上（13/1234），同源性好。
通过对各实验条件的优化，得到副溶血性弧菌TaqManTM实时荧光PCR的最佳反应条件，初步建立TaqManTM实时荧光PCR检测副溶血性弧菌的快速检验方法。
结论：TaqManTM实时荧光PCR检测灵敏度高、特异性好，而且检测周期短，能提高副溶血性弧菌的检出率和检测准确性。
【关键词】副溶血性弧菌；TaqManTM探针；实时荧光PCR；快速检测【中图分类号】R378.3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）18-0091-02【Abstract】Objective To establish a rapid TaqManTM real-time PCR assay for thequalitative detection of Vibrio parahaemolyticus, an alternative method for the rapid detection of Vibrio parahaemolyticus caused food borne disease.Conclusion TaqManTM real-time assay is rapid, sensitive and specific. It could be applied to the rapid diagnosis of Vibrio parahaemolyticus caused food poisoning. 【Keywords】 Vibrio parahaemolyticus; TaqManTM probe; Real- time PCR; Rapid detection副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是革兰阴性嗜盐性细菌，隶属弧菌科弧菌属，它是一种人畜共患病菌。
特异性靶基因在弧菌PCR快速检测中的应用
特异性靶基因在弧菌PCR快速检测中的应用邵蓬;汪笑宇;徐晓丽【期刊名称】《天津农学院学报》【年(卷),期】2015(022)003【摘要】快速、准确地确定弧菌种类能够有效防治弧菌病的发生,利用PCR技术对水产养殖动物的弧菌病进行诊断,通常需要采用靶基因作为基础.近年来,常用的细菌诊断靶基因主要有:16S rDNA、16S-23S rDNA基因间区序列、gyrB基因、dnaJ 基因等看家基因和某些弧菌特定的毒力基因,如toxR基因、tdh基因、trh基因、vvhA基因、ctxA基因等.【总页数】5页(P49-53)【作者】邵蓬;汪笑宇;徐晓丽【作者单位】天津市水产技术推广站,天津 300221;天津渤海水产研究所,天津300457;天津市水产技术推广站,天津 300221【正文语种】中文【中图分类】S94【相关文献】1.产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立 [J], 杨辉;龚成;吴丽娟;汪仕奎;蔡剑平;胡继红2.以16S 和16S -23S rDNA 间区为靶区建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)PCR 快速检测技术 [J], 邓先余;王智学;陈晓艳;何建国3.toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌 [J],覃倚莹;吴晖;肖性龙;杨晓泉;张经纬;余以刚;李惠芳4.双重PCR在创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolytious）快速检测中的应用 [J], 张新中;文万侥;徐先栋;吴秀红;周永灿;谢珍玉5.双重PCR在创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytious)快速检测中的应用 [J], 张新中; 文万侥; 徐先栋; 吴秀红; 周永灿; 谢珍玉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
创伤弧菌溶血素基因vvhA质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用
创伤弧菌溶血素基因vvhA质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用袁玮;陈蕾蕾;杨金玉;周庆新;裘纪莹;赵双枝;付恩君;赵国琰;陈相艳【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2024(56)1【摘要】针对我国缺乏适用于创伤弧菌检测的质粒标准样品的现状,本研究开展了创伤弧菌鉴定即用型定性质粒标准样品的研制和应用工作。
首先构建了创伤弧菌毒力基因vvhA的重组质粒,经测序验证后制备成质粒标准样品冻干粉,然后对其进行PCR定性检测及紫外分光光度计法定量分析。
均匀性检验结果表明,样品间无显著差异,均匀性良好,符合预期目标;短期稳定性检验结果表明,样品能在4℃、37℃条件下稳定保存14天;长期稳定性检验结果表明,样品能在-20℃条件下稳定保存至少12个月。
研究结果表明,创伤弧菌质粒定性标准样品的均匀性和稳定性均符合国家定性标准样品的要求,为创伤弧菌的快速、高通量的定性鉴定分析提供了可靠的参考物质。
将标准样品应用于鱼类、贝类等10份海鲜类食品样品的检测中,经传统培养法验证,检测结果准确无误。
本研究所研制的创伤弧菌质粒定性标准样品具有较好的商业应用潜力,为其在食品检测领域的推广应用奠定了重要基础。
【总页数】9页(P147-155)【作者】袁玮;陈蕾蕾;杨金玉;周庆新;裘纪莹;赵双枝;付恩君;赵国琰;陈相艳【作者单位】山东省农业科学院农产品加工与营养研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业农村部新食品资源加工重点实验室;山东师范大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】S852.61【相关文献】1.基于vvhA基因检测创伤弧菌实时荧光PCR方法的建立2.创伤弧菌vvhA基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定3.转基因康乃馨Moonlite品系检测用质粒标准样品研制4.基于vvhA基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测创伤弧菌方法的建立及应用5.β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测用质粒标准样品研制因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
创伤弧菌vvhA基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定
创伤弧菌vvhA基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定张家敏;应斌宇;楼永良;严杰【期刊名称】《中国微生态学杂志》【年(卷),期】2006(18)6【摘要】目的克隆创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)溶细胞素基因(vvhA),构建原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性。
方法采用PCR技术从Vv GTC333和WZ01株DNA中扩增全长vvhA基因,T-A克隆后测定其核苷酸序列。
采用pET32a质粒构建vvhA基因原核表达载体,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rVvhA表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯rVvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。
采用兔抗Vv全菌抗体的Western Blot 和兔抗rVvhA血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和免疫原性。
结果所克隆的vvhA基因核苷酸序列与GeneBank公布的同源性分别为96.09%和98.26%。
在0.5 mmol/L IPTG诱导下,rVvhA产量可占细菌总蛋白的18%。
提纯的rVvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。
重组蛋白rVvhA能与兔抗Vv全菌抗体发生特异性结合,免疫家兔可获得高效价抗体。
结论该研究成功地构建了创伤弧菌vvhA基因高效原核表达系统,所表达的rVvhA具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Vv免疫检测试剂盒及疫苗的抗原。
【总页数】3页(P460-462)【关键词】刨伤弧菌;溶细胞素/υυhA基因;克隆;原核表达/提纯;免疫性【作者】张家敏;应斌宇;楼永良;严杰【作者单位】浙江医学高等专科学校;温州医学院;浙江大学医学院【正文语种】中文【中图分类】R378.3【相关文献】1.创伤弧菌铁调基因fur的原核表达及多克隆抗体制备 [J], 李素一;张丽娟;陈华;柯翎;陈叙;林晨韬2.创伤弧菌溶细胞素vvhA基因在大肠杆菌中的表达及其对应激因子的调控 [J], 李桂军;桂静;肖美英;楼永良3.SLT-IIeA基因在原核系统中的克隆与表达及其鉴定 [J], 严振龙;陈雷;姜连连;成大荣;徐建生;董国雄;李俊宝4.海洋创伤弧菌反式翻译系统关键因子SmpB基因的克隆及原核表达 [J], 刘鹏; 岑妍慧; 林江; 梁忠秀; 兰太进; 韩丝银; 陈振兴5.SARS冠状病毒M蛋白基因的克隆、鉴定及原核表达载体的构建 [J], 陈秋霞;吴德;郑焕英;吴忠道;张万里;刁丽梅;万卓越;黄吉城;林锦炎因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。