TaqMan探针荧光定量PCR反应试剂盒
乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)操作说明
心数秒，按 43μl/管分装到反应管中。 2. 内参配制 将 n×3μl 内参（单通道仪器不加内参）及 n×50μl 核酸提取液 B 至于一新离心管中混匀备用（混合后避免反复冻融 使用，使用前混匀 5 秒钟） 。 3. 样本、对照品的处理 样本处理：取 100μl 待检血清样本（冻存血清使用前在室温融解，振荡混匀 10 秒钟）分别加入 100μl 核酸提取液 A， 振荡混匀 10 秒种，12000rpm 离心 10 分钟，弃上清；分别加入 50μl 核酸提取液 B 与内参的混合液至沉淀中（使用前一定 要充分混匀， 将颗粒和液体一起加入沉淀中， 其中颗粒量应在 15％以内） ， 振荡混匀 10 秒钟， 100℃保温 10 分钟， 12000rpm 离心 2 分钟。处理后的样品应在 1 小时内使用，或在-20℃～-80℃最长保存 1 个月（不宜反复冻融）。 血清对照品处理：按照血清标本处理方法处理试剂盒内阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照。（冻存血清对照品 使用前在室温融解，振荡混匀 10 秒钟）。 定量校准品处理：定量校准品无需处理，在样本加样前直接将定量校准品 1 号至 5 号振荡混匀 10 秒钟，低速离心数秒 后加样。 4. 样本加样 将样品处理上清液（冻存样品使用前室温充分融化，振荡混匀数秒，12,000rpm 离心 2 分钟）、阳性血清对照、弱阳性 血清对照、阴性对照以及定量校准品各 7μl 分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置定量 PCR 仪上。 5. 仪器扩增程序 1、ABI7300/7500/Mx3000P/SLAN 双通道仪器：反应管先在 50℃反应 2 分钟，然后 94℃保温 5 分钟，再按 94℃10 秒→60℃45 秒 循环 40 次。60℃采集 FAM、JOE 荧光通道的信号。 2、LightCycler 480 仪器：反应管先在 50℃反应 2 分钟，然后 94℃保温 5 分钟，再按 94℃10 秒→60℃45 秒 循环 40 次。 60℃采集 FAM、RED 610 荧光通道的信号。 3、单通道仪器：反应管先在 50℃反应 2 分钟，然后 94℃保温 5 分钟，再按 94℃10 秒→60℃45 秒 循环 40 次，60℃采集 FAM 荧光通道信号。 6. 质量控制 试剂盒中提供定量校准品五个，阴性对照，阳性血清对照和弱阳性血清对照各一个。如试剂质量完好并操作正确，阳性 血清对照、弱阳性血清对照、定量校准品应表现为阳性结果，阴性对照应表现为阴性结果，阳性血清对照定量值为 5.0±2.5 ×10 IU/ml，弱阳性血清定量值为 5.0±2.5×10 IU/ml。如超过范围则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的 误差。在每次检测中都应设置阴阳性对照品。 7. 结果判断 仪器程序运行完成后，按软件要求进行结果保存，输入HBV 定量校准品的量值，选择自动分析模式，软件将自动给出标 准曲线并计算各样本的HBV DNA 含量Q(IU/ml）。
肺炎衣原体Taqman探针实时荧光定量PCR检测法
肺炎衣原体Taqman探针实时荧光定量PCR检测法程永婷;贾晓晖;马良;贾天军【摘要】目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法.方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析.结果肺炎衣原体TaqmanFQ-PCR方法的引物浓度300nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg2+ 4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3％.自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10％vs 10％ (x2 =0.167,P＞0.05),44.44％vs 40.74％(x2 =0,P＞0.05),6.67％ vs3.33％(x2 =0,P＞0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54％ vs 14.96％)比较差异无统计学意义(x2=0.071,P＞0.05).结论本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2016(034)005【总页数】4页(P343-346)【关键词】肺炎衣原体;Taqman探针;实时荧光定量PCR;Cpn0308【作者】程永婷;贾晓晖;马良;贾天军【作者单位】河北北方学院病原生物学与免疫研究所,临床检验诊断学重点实验室,河北张家口075000;河北北方学院病原生物学与免疫研究所,临床检验诊断学重点实验室,河北张家口075000;河北北方学院病原生物学与免疫研究所,临床检验诊断学重点实验室,河北张家口075000;河北北方学院病原生物学与免疫研究所,临床检验诊断学重点实验室,河北张家口075000【正文语种】中文【中图分类】R446.5肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,Cp)感染通常为隐性感染，却可引起严重的并发症[1-2]。
taqman荧光定量pcr基本原理
taqman荧光定量pcr基本原理
TaqMan荧光定量PCR是指采用荧光标记的PCR技术，它可以实现对特定序列DNA的定量分析，即可以直接测量所检测序列在模板文库中的相对浓度。
TaqMan荧光定量PCR可以说是一种双通道的实时PCR技术，最初由PE Applied Biosystems（PE）推出。
它是通过特定的标记技术，开发了FRET和TaqMan技术，结合PCR技术，以达到定量分析和监测某一特定序列DNA的目的，这种技术比以往的技术有很大的优势，更易于完成。
TaqMan荧光定量PCR的基本原理比较简单，大致可以分为以下四步：
（1）样本处理：检测序列DNA及其作为模板的原始样品将在定量PCR试剂盒中经过一系列处理，得到模板文库。
（2）探针标记：样品处理完成后，将开发出一对对应该特殊序列的5'荧光探针—特殊碱基对相对应的序列和3'分子耦合（MolecularBeacon）。
探针内部具有双螺旋结构，当处于开放状态时，荧光物质才能折射发射自己特有的颜色荧光。
（3）反应物添加：在模板文库中添加进Taq DNA 聚合酶、核酸类型的合成引物，以及缓冲液，用水调节总体浓度。
（4）加热-冷却：完成上述步骤，将反应液放入定量PCR仪，按照一定的条件，经由一系列的加热、冷却过程，Taq DNA聚合酶将碱基对引物合成，产生复制模板文库。
同时在复制过程中，反应液中复制数量也不断增加，一旦达到一定温度，则表明文库复制到足够多，荧光探针能够在反应液中爆炸，产生光谱，得以直接测定检测序列DNA的定量。
此外，TaqMan荧光定量PCR技术能够检测DNA的扩增曲线，并由此提供准确的定量结果，同时也不受PCR技术的一些影响，更易于操作。
taqman荧光定量pcr步骤
taqman荧光定量pcr步骤
TaqMan 荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测特定核酸序列的表达水平。
以下是一般的TaqMan 荧光定量PCR 实验步骤：
1. 设计引物和探针：根据目标基因序列，设计合适的引物和TaqMan 探针。
2. 准备模板：提取待测样本的DNA 或RNA，并将其作为模板用于PCR 反应。
3. 反应体系准备：根据试剂盒说明书，准备反应体系，包括反应缓冲液、引物、探针、dNTPs、Taq 聚合酶等。
4. 设定反应条件：根据引物和探针的特性，设置合适的PCR 反应条件，如温度、时间等。
5. 加样和运行PCR：将准备好的反应体系和模板加入PCR 仪中，开始运行PCR 反应。
6. 数据采集和分析：在PCR 反应进行过程中，仪器会实时监测荧光信号，并记录每个循环的荧光强度。
根据荧光强度与循环数的关系，绘制荧光定量曲线，并进行数据分析。
7. 结果解读：根据荧光定量曲线和标准曲线，计算出目标基因的初始拷贝数或相对表达量。
TaqMan One Step RT-qPCR Kit(Probe qRT-PCR)
TaqMan One Step RT-qPCR Kit（Probe qRT-PCR）货号：T2210规格：50T/200T（25μl体系为例）试剂组成：25×One Step RT-qPCR RTase mix5×One Step RT-qPCR Buffer保存：-20℃保存长期保存，使用前应混匀，避免反复冻融。
产品说明：TaqMan One Step RT-qPCR kit（qRT-PCR Probe）是一步法（One Step）RT-PCR荧光定量探针法定性、定量反应的专用试剂，反应过程在同一管内连续进行，避免开管，能有效防止污染。
本品含有高温反转录酶（RNase H-）和新型热启动酶，具有更高的反转录和PCR扩增效率，适合于低浓度RNA模板的高灵敏度扩增。
本试剂采用优化配方的专用Buffer，可以在较宽的定量区域内得到良好的标准曲线，准确进行定量，并与多数厂家的荧光定量PCR仪兼容，如Applied Biosystems、Eppendorf、Bio-Rad和Roche等。
试剂原理：TaqMan One Step RT-qPCR kit首先利用反转录酶RTase将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板通过热启动DNA扩增酶在单管闭管反应体系中连续进行PCR扩增反应，利用荧光标记探针（Probe）水解发光，并对发光信号进行检测。
1.RT-PCR首先采用反转录酶以RNA为模板合成cDNA，然后再以合成的cDNA为模板，经过PCR扩增反应的热变性、引物退火、链延伸三个步骤循环往复，在短时间内扩增得到大量DNA片段。
2.荧光检出TaqMan探针法是使用5’端带有荧光物质，3’端带有淬灭物质的TaqMan探针进行荧光检测的方法。
在探针没有被Taq酶分解时，5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。
而当TaqMan探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。
SHENTEK 质粒 DNA 残留检测试剂盒 （PCR-荧光探针法） 说明书
SHENTEK®质粒DNA残留检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书货号：SK030217PL100版本：A/4仅供研究用湖州申科生物技术有限公司⏹试剂盒简介SHENTEK®质粒DNA残留检测试剂盒用于定量检测基因治疗产品中质粒DNA残留的专用检测试剂盒，如CAR-T细胞治疗中慢病毒载体制备相关的质粒DNA。
本试剂盒利用Taqman探针原理，通过各质粒共有DNA序列，如ColE1/pMB1/pBR322/pUC来源的复制子，定量检测样本中质粒DNA的残留。
客户可以事先将质粒DNA序列给本公司技术人员进行确认。
本试剂盒检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到102copies/μl。
试剂盒配套有质粒DNA定量参考品。
本试剂盒与SHENTEK®宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样本中残留的微量质粒DNA。
⏹试剂盒成份表1.试剂盒组份组份装量储存条件Plasmid DNA定量参考品50μl×1管-18℃及以下Plasmid Primer&Probe MIX300μl×1管-18℃及以下，避光qPCR Reaction Buffer850μl×2管-18℃及以下，避光DNA稀释液 1.5ml×3管-18℃及以下IPC MIX150μl×1管-18℃及以下，避光⏹规格：100Reactions。
⏹有效期:规定储存条件下24个月。
⏹适用机型（包括但不限于）ABI PRISM®7500Real-Time PCR SystemCFX96(Bio-Rad)Linegene9600plus（博日）⏹实验所需但试剂盒中未含材料1.5ml无菌离心管96孔qPCR板1000μl，100μl，10μl无菌有滤芯枪头⏹相关设备荧光定量PCR仪1000μl，100μl，10μl移液枪⏹操作过程Plasmid DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备Plasmid DNA定量参考品浓度为1.2ng/μl，通过如下公式换算成拷贝数：2.98×108copies/μl。
Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)说明书宝生物工程公司Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)说明书
Takara Code ：DRR390APremix Ex Taq TM(Probe qPCR) （200次量）宝生物工程(大连)有限公司目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●适用的Real Time PCR扩增仪1●保存 1 ●试剂盒原理 1 ●试剂盒特长 2 ●操作注意 2 ●操作方法 2 ◆应用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪的操作方法2◆应用ABI PRISM 7000/7700/7300 Real-Time PCR System，StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法4◆应用ABI PRISM 7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法 5 ◆应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法7◆应用Smart Cycler II System Real Time PCR扩增仪的操作方法8 ●PCR反应条件说明9 ●进行RT-PCR反应时的实验方法9 ●引物设计说明10 ●特别提示：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务11 ●问答11●制品说明本制品是采用探针法（TaqMan®，Molecular Beacon等）进行Real Time PCR（qPCR）反应的专用试剂。
是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。
Mix中添加了Tli RNaseH（耐热性RNaseH），以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。
制品中的DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，与Takara精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。
MP核酸检测试剂盒说明书
肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（PCR荧光法）说明书【产品名称】通用名称：肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（PCR荧光法）英文名称：PCR-Fluorescence Detection Kit for Mycoplasma Pneumonia【包装规格】32人份/盒【预期用途】本产品用于定性检测痰液或咽拭子中的肺炎支原体核酸。
肺炎支原体（）是人类支原体肺炎的病原体，主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，支原体肺炎的临床表现和胸部X线检查并不具特征性，单凭临床表现和胸部X线检查无法做出诊断。
若要明确诊断，需要进行病原体的检测。
而病原体核酸检测是目前最为直接的检测手段。
适应症：由肺炎支原体感染引起的肺炎等疾病。
【检验原理】本试剂盒选用肺炎支原体（MP）保守基因片段设计特异引物及特异Taqman 探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对肺炎支原体核酸的自动化检测。
【主要组成成份】注: 不同批号试剂盒中各组份不可以互换。
【储存条件及有效期】试剂-20℃可保存12个月。
【适用仪器】ABI7300、ABI7500荧光PCR扩增仪。
【样本要求】1. 标本：痰液及咽拭子。
2. 采集器：应当选用国家批准生产的一次性使用的咽拭子，拭子应当包括洁净海绵头、PP杆、PP杆与海绵头应连接牢固，经无尘清洗包装。
3. 采集：样本采集具体方法请参考《微生物标本采集手册》一书。
a. 自然咳痰法以晨痰为佳，用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入痰盒中，标本量应大于等于1ml。
b. 咽拭子取痰法用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，转动拭子取出粘液。
4.存放：2-8℃保存，不超过24小时；-20℃下保存，不超过3个月；-70℃下长期保存，但应避免反复冻融。
烟曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒实验原理
烟曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒试验原理烟曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒说明书产品特点1. 使用化学修饰的热启动聚合酶，反应特异性高，*程度地避开了非特异扩增；2. 反应缓冲液经充分优化，反应灵敏快速，40个循环只需20多分钟；3. 抗干扰本领强，反应重复性高，适合对土壤、粪便、肿瘤和血液来源的多而杂样本中的靶基因进行检测分析。
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，zui后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
特异性荧光标记：TaqMan法TaqMan探针的特性：（1）5′端标记有报告基团（Reporter, R），如FAM、VIC等（2）3′端标记有荧光淬灭基团（Quencher, Q）（3）探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团汲取，无荧光， R 与Q分开，发荧光（4）Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针烟曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒相对定量通过内标定量：内标（Endogenous Control）通常是βactin、GAPDH基因等看家基因，在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小，内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量。
相对定量分析方法：2ΔΔCt前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：ΔCT（test）= CT（target,test）CT（ref,test）ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）CT（ref, calibrator）2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：ΔΔCT= ΔCT（test）ΔCT（calibrator）3、计算表达水平比率：2 –ΔΔCT=表达量的比值荧光定量PCR检测方法包含以下步骤：（1）将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品依照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线；（2）待测样本与步骤（1）所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因依照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。
HLA-B5801 等位基因荧光探针PCR介绍+说明书
方法如下： （以一次进行 4 个测试为例）
组分名称 主反应液 Taq 核酸聚合酶
灭菌水 核酸样本
总体积
加量 μl/管 3 0.2 13 2
重新测定 注2
1. 本品仅用于科学研究； 2. 需具有经验和专门培训过的人员进行操作； 3. PCR 操作各阶段应在不同的实验室中进行； 4. PCR 操作每个阶段使用专用的仪器和设备； 5. 穿工作服，戴一次性手套； 6. 必须使用一次性吸头，吸完即弃； 7. 用 10%次氯酸或 70%酒精或紫外线灯处理工作台和加样器； 8. 仅严格遵守本说明书规范操作所得到的测试结果为有效测试数据； 9. 本试剂盒所有使用的仪器设备包括荧光 PCR 仪及可调式移液器等均需依照规定进行校正； 10. 实验中使用的 Taq 核酸聚合酶(DNA polymerase) 以 Fermentas 厂牌为标准，使用其它厂牌之 Taq 核酸聚合酶可
本公司人类主要组织相容性抗原分子特异性引物片段 B5801 荧光分型试剂盒以序列特异性引物进行荧光聚合 酶链反应，用以人类主要组织相容性抗原分子型别鉴定。 【检测原理】
本试剂盒以序列特异性引物进行荧光聚合酶链锁反应，用于人类主要组织相容性抗原分子型别鉴定。首先由已 知人类主要组织相容性抗原分子基因序列设计特异性引物及探针，当引物序列与待测标的序列能完全配合时，引物 进行聚合酶链锁反应。特殊核酸片段将被进行复制与放大，同时探针结合上待测标的序列并藉由聚合酶的分解作用 产生荧光。荧光反应产生表示在样本中存在与特异性引物匹配的基因序列，反之则否。
定量pcr实验报告
定量pcr实验报告定量PCR实验报告引言：PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，通过扩增目标DNA片段，可以在短时间内生成大量的DNA。
定量PCR是PCR的一种应用，可以精确测量目标DNA的数量。
本实验旨在使用定量PCR技术，对一种特定基因的DNA进行定量分析。
材料与方法：1. DNA样本：从人体组织中提取的DNA。
2. 基因特异性引物：设计用于扩增目标基因的引物。
3. TaqMan探针：与目标基因序列互补，携带荧光染料和荧光素。
4. 定量PCR试剂盒：包括PCR反应缓冲液、聚合酶、dNTPs等。
5. 实时荧光定量PCR仪：用于检测PCR反应过程中的荧光信号。
实验步骤：1. 样本制备：将DNA样本提取并纯化。
2. 引物设计：根据目标基因序列设计特异性引物。
3. PCR反应体系制备：将PCR反应缓冲液、引物、探针、聚合酶、dNTPs和DNA样本混合。
4. PCR扩增：在热循环仪中进行PCR扩增，包括一系列的变温步骤。
5. 荧光信号检测：实时荧光定量PCR仪会在每个循环结束后检测PCR反应体系中的荧光信号。
6. 数据分析：根据荧光信号的变化，计算目标基因的相对表达量。
结果与讨论：通过实时荧光定量PCR仪检测，我们获得了PCR反应体系中的荧光信号数据。
根据这些数据，我们计算出了目标基因的相对表达量。
通过对多个样本进行定量PCR实验，我们可以比较不同样本中目标基因的表达水平。
本实验的结果表明，在不同样本中目标基因的表达水平存在差异。
这些差异可能与个体的遗传背景、环境因素以及疾病状态等有关。
通过定量PCR技术，我们可以更加准确地研究基因表达的变化，从而深入了解相关生物学过程。
定量PCR技术的优点在于其高灵敏度和高特异性。
相比于传统的PCR技术，定量PCR可以提供更加准确的结果。
此外，定量PCR还可以同时检测多个基因的表达水平，从而为生物学研究提供更多的信息。
然而，定量PCR也存在一些局限性。
首先，PCR反应的成功与否取决于引物和探针的设计。
TaqMan-MGB探针荧光定量PCR反应试剂盒
TaqMan-MGB探针荧光定量PCR反应试剂盒使用说明书（Cat#Yu-R01-1）【产品介绍】TaqMan-MGB探针有许多特殊性质：1、Taqman-MGB探针比普通Taqman 探针（比如Taqman-TAMRA探针和Taqman-BHQ1探针）更短，一般为15bp左右；2、MGB可以提高探针Tm值10℃左右，提高配对与非配对模板间的Tm值差异；3、MGB探针特异性更高，可区分模板一个碱基的差异；4、MGB为不发光的荧光基团，并且与报告基团的空间位置更接近，可以使实验的背景更低，信噪比更高，结果更精确，灵敏度更高。
Taqman-MGB探针的特点使其多应用于普通Taqman探针不能胜任的领域，比如SNP分型、已知点突变的突变型和杂合子基因的检测以及microRNA的检测。
由于具有普通外切酶活性的DNA聚合酶很难酶切水解MGB探针。
另外，由于Taqman-MGB探针在识别模板的过程中影响因素较多，普通Taqman探针的荧光定量PCR反应液并不适用于Taqman-MGB探针。
本公司专利技术生产的TaqMan-MGB探针专用荧光定量反应试剂盒在许多性能上完全超越国外同类产品，性能优良，结果可靠。
本产品还可以应用于普通Taqman探针（比如Taqman-TAMRA探针和Taqman-BHQ1探针），同时对FAM、HEX和VIC等荧光物质的有明显的荧光增强效果。
【产品特点】1. 适用于使用TaqMan-MGB探针、Taqman-TAMRA探针和Taqman-BHQ1探针的实时荧光定量PCR，对FAM、HEX和VIC等荧光物质的有明显的荧光增强效果。
结合本公司的各种miRNA 提取试剂盒（Cat#Yu-Mi01-1，Cat#Yu-Mi02-1，Cat#Yu-Mi02-2，Cat#Yu-Mi03-1），可以进行多种游离DNA和miRNA的检测。
2. 灵敏度高：本产品的扩增效率为96.149%，R2为0.995，扩增microRNA的效率是进口产品4倍以上（图1-2，表1-2）。
猪捷申病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用
Chinese Journai of Veterinaa Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第11期37猪捷申病毒TaqMan定量RT-PCR 检测方法的建立和初步应用秦毅斌1,苏乾莲1,赵硕2,卢冰霞1，何颖1,周展宏1,2,李斌1,1,2,赵武1（1.兽医研究所广西兽医生物重验室，530001；2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）摘要:为建立猪捷申病毒(PTV)的TaqMan实时荧光定量RT-CR(RT-qPCR)检测方法，在PTV基因组序列保守区设计引物和TaqMan,重组为阳性标准品，通过优化反应,了PTV的RT-qPCR方法，并进行特异性、感性和重复性试验。
结果表明，该方法仅对PTV出现特异性扩增反应，与猪流行性腹泻、猪状、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒等常见猪病毒均无交叉反应。
该方法的标准曲线Ct值与4.6x108~4.6x102拷贝/$L的质粒浓度范围具有良好线性关系，标准曲线方程为C=-3.201xlog?+40.527,线性相关系数(*)为0.996，检测下为4.6x 101拷贝多L对不同浓度的pMD18-PTV进行组内与组间重复检测，每个浓度重复试验的C值的变异系数均小于4.0%，好的重现性。
应所的方法对235份临床猪腹泻进行，PTV阳性32份，性为13.62%$本试验的RT-qPCR方法为PTV实验及研究分析提供了可靠的$关键词：猪捷申病毒；荧光定量RT-PCR;TaqMan探针中图分类号：S852.65T文献标志码：A文章编号：0529-6005(2020)11—0037—06Development and Preliminary Application of a Real-time TaqMan Fluorescent Quantitative RTPCR Assay for Detection of Porcine TeschovirucQU Yi-bin1，SU Qian-lian1，ZHAO Shuv2，LU Bing-xia1，HE Ying1，ZHOU Zhan-hong1，YUAN Ting-ting2，LI Bin1，DUAN Qun-peng1，OUYANG Kang2，ZHAO Wu1(1.Guangpi Veterinaa Research N s/NN，Guangxi Key Laboatoa of Veterinary Biotechnology，Nanning530001，China；2.Colleae of Anival Science and Technolog，Guangxi Universith，Nanning530005，China)Abstract:To establish a real-time TaqMan fuorescent quantitative RT-PCR(RT-qPCR)assay for the detection of porcine te-schovRus(PTV)，p/mem and TaqMan fluorescent probe were desianed according tr the conserved reaion of PTV genome sequence.A recombinant plasmid was constructed as the positive standard sample，and RT-qPCR was developed by optimization of reacting conditions./urthermoro，the specificity，sensitivity and repeatabilith of the established RT-qPCR were tested.Results showed that there was no cross-reaction with conventionai porcine viruses，such as porcine epidemic diarrhea virus，porcine tansmissible gastroenteritis，porcine deeacoanavRus，porcine rotavirus group A，and et ai.The assay was lineas for the template plasmin pMD18-TTV in the range from4.6x108copies/$L te4.6x102copies/$L，the standard equation was C=-3.201x log?+40.527，coeelation coefficient was*=0.996，and detection limit was low te4.6x101copies/$L.Also，the assay showed the good reproducibility with the coefficient of variation(CV)less than4%both in intra-5ssay and inter-5ssay.ThRty-two of the235clinicai fecai samples collected from dVferent areas in Guangi were positive for PTV tested by the developed assay.In conclusion，the development of this assay provides a convenient，specific and sensitive diagnostic method for the PTV detection and epidemiologicai investigation.Key words:porcine teschovRus；real-Cme TaqMan Iuorescent quantitative PCR；TaqMan Iuorescenco probeCorressonding author：ZHAO Wu，E-maii:zhaowul68866@收稿日期：2020—05—10基金项目:广西创新驱动发展专项资金项目（桂科AA17204057）；广西基本科研业务费专项（桂科专项202/19-2）；广西自然科学基金项目（2017GXNSFBA198092）；广西兽医生物技术重点实雌开放基金课题（16A?0A5氨A/17A59A6氨A）；广西柳州市科技计划（2018BH20501）作者简介:秦毅斌（1983-）,男，高级兽医师，硕士，研究方向为动物传染病病原与分子生物学,E-mel：qmymm51??@163•com通讯作者:赵武,E-maii:zhaowu168866@163-com38中国兽医杂志2020年(第56卷)第11期Chinese Journai of Veterinao Medicine猪捷申病(Porcina teschen disease,PTD)，又称塔尔凡病或脑脊髓炎，是由猪捷申病毒(Porcine tv-schovirus,PTV)感染引起的一种猪病毒性传染病$该病首次于1929年在捷克斯洛伐克的捷申地区发现，故命名为“捷申病”，随后传播至北美%非洲、澳大利亚和日本等国家，目前已散布于世界各养猪国家(1猪群感染PTV后，主要表现为腹泻、脑脊髓灰质炎⑵、肺炎、心包炎、心肌炎、皮肤损坏等症状,母猪还可导致繁殖障碍［3］,感染发病猪具有较高的病死率,给养猪业带来了较大经济损失$PTV属于小RNA病毒科(PRomavibdae)捷申病毒属(Teschovirus)成员，病毒粒子呈球形,外层包裹衣壳，无脂蛋白，病毒基因组为单股正链RNA,长约7.2kb,仅含有1个完整的编码1个多聚蛋白的开放阅读框!0RF)，该多聚蛋白被蛋白水解酶裂解为非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D和结构蛋白L、VP1、VP2、VP3%VP4(45)$PTV至少有11个血清型［6］,并且还不断出现新的血清型PTV12(7)、PTV13［8］$研究表明，我国猪群PTV感染较为普遍。
沙门氏菌属(shlmonellaspp)荧光定量PCR
沙门氏菌属（shlmonella.spp）荧光定量PCR 检测试剂盒操作手册（第一版）适用于各种食品类材料、卫生监督、疾病控制等来源的临检样品2006.12深圳易瑞生物技术有限公司试剂盒组成产品介绍✧本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，用于沙门氏菌的PCR体外特异性检测。
✧本试剂盒灵敏度为100拷贝/ml。
定量检测线性范围为：10-1010拷贝/ml。
贮存与运输条件✧本试剂盒必须在-20℃下避光保存，有效期为6个月。
✧需在低温下运输。
注意事项✧本试剂盒仅用于体外检测使用，操作人员必须经过培训并具有一定的经验，试剂盒使用前请仔细阅读说明书全文。
✧请严格按照基因扩增检验实验室的管理规范进行实验操作：如PCR实验严格分区操作；各区应有专用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循从一区到二区的单方向工作原则，各工作区相对隔离；进行PCR实验的工作桌面和及相关物品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精、1mol/L盐酸或紫外灯进行灭菌和消毒。
✧试剂盒中各试剂充分融化后请短暂离心。
反应液分装时应尽量避免产生气泡。
上机前应注意检查各反应管是否盖紧，以免污染仪器。
适用荧光PCR仪品牌与型号✧Cepheid公司的SmartCycler✧ABI公司的Prism7000、7700、7500、9600系列✧Stratagene公司的MX3000、MX4000✧Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000✧Bio-Rad公司的iCycler系列、MJ opticon2✧Roche公司的LightCycler等实验操作步骤✧DNA提取：取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，10,000rpm离心5min，弃去上清；加入50µl DNA提取液，充分混匀后沸水浴5 min，13,000rpm离心5min，取上清液进行检测或保存于-20℃以待检测。
✧扩增试剂准备（在试剂贮存和准备区完成）➢从试剂盒中取出PCR反应液，冰盒上融化后混匀。
2-ΔCT(试剂盒说明书)
荧光定量PCR基因表达检测试剂盒说明书(通用版)前言随着荧光定量PCR技术的成熟和荧光定量PCR仪的普及，用传统的半定量方法检测目的基因表达量的升高或者降低，已经远远不能满足当前科研的需要，针对当前研究的热点基因，闪晶生物及时地从美国biosuper公司引进不同物种、不同基因的荧光定量PCR检测试剂盒。
该试剂盒包含了目的基因和管家基因的引物、taqman探针(荧光探针)、反转录试剂、荧光定量PCR试剂、操作说明书等，用户只需将提好的RNA加入就可以进行荧光定量PCR实验，操作方便简单、适合多种荧光定量PCR仪，同时也避免了自己设计、合成引物探针的烦恼。
基本原理先用随机引物将RNA反转录成cDNA，然后设计特异性的引物和荧光探针(TaqMan探针),进行荧光定量PCR检测。
TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。
荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。
当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，但在进行延伸反应时，qTaq聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离,荧光强度得到检测。
随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
试剂盒规格25 次100次试剂盒组成序号 名称 25次 100次1 RT-buffer 325 ul 1300 ul2 Mix enzyme 50 ul 200 ul3 T-probe 25 ul 100 ul4 T-fluo-PCR buffer 650 ul 2600 ul5 I-probe 25 ul 100 ul6 I-fluo-PCR buffer 650 ul 2600 ul7 qTaq polymerase100 ul 400 ul8 DEPC-H2O 1支 1支9 说明书 1份 1份试剂说明：RT-buffer:含有dNTPs、oligo(N)等Mix enzyme:含有反转录酶、RNA酶抑制剂等T-probe:检测目的基因的荧光探针，5’端fam标记，3’端tamra标记T-fluo-PCR buffer:含有目的基因的特异性引物、dNTPs等I-probe:检测管家基因的荧光探针，5’端fam标记，3’端tamra标记I-fluo-PCR buffer: 含有管家基因的特异性引物、dNTPs等RNA的提取请参照Trizol说明书，本试剂盒不提供RNA提取试剂和操作流程。
尼帕病毒TaqMan_探针荧光定量PCR_检测方法建立
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报收稿日期：2022-03-11基金项目：国家重点研发计划（2022YFD1800504）作者简介：孙彤，女，兽医学硕士，主要从事动物疫病检测通信作者：陈鸿军，E-mail：***************.cn 2024,32(1):122-128·研究论文·尼帕病毒TaqMan 探针荧光定量PCR 检测方法建立摘 要：尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病，为能够快速特异检测该病毒，本研究根据尼帕病毒（NiV ）N 基因序列保守区设计特异性引物和探针，建立一种针对NiV 的TaqMan 探针荧光定量PCR （qPCR ）检测方法，该方法特异性好、敏感性高、稳定性强，可鉴别NiV 与其他猪病病毒，扩增效率为102%，最低检测限14.8 copies/μL ，敏感性高于常规PCR 10倍，该检测方法的建立可为NiV 的快速检测提供技术手段，对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。
关键词：尼帕病毒；N 基因；TaqMan 探针；实时荧光定量PCR 中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2024）01-0122-07Development of a TaqMan Probe Fluorescence Quantitative PCR Method forDetection of Nipah VirusSUN Tong, SUN Zhuyun, LIU Jingyi, WANG Peipei, SU Chang, CHEN Hongjun(Evaluation Center for Veterinary Drug, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)孙 彤，孙竹筠，刘静宜，王培培，苏 苌，陈鸿军（中国农业科学院上海兽医研究所 兽药评价中心，上海 200241）Abstract: Nipah virus (NiV) infection is a severe infectious disease and also a zoonotic illness. In order to detect the virus quickly and specifi cally, specifi c primers and probe were designed in this study based on the conserved region of the NiV N gene . Subsequently, a TaqMan probe fluorescence quantitative PCR ( q PCR) method was developed for detection of NiV. This qPCR method had good specificity without reaction with other swine viruses and high sensitivity with 10 times sensitive than conventional PCR and strong stability. In addition, its amplifi cation effi ciency reached to 102% and the minimum detection limit was 14.8 copies/μL. Availability of this qPCR method provided a technical means for the rapid detection of NiV and was of great signifi cance to pig industry. Key words: Nipah virus; N gene; TaqMan probe; quantitative PCR尼帕病毒（Nipah virus, NiV）为副粘病毒科，亨尼病毒属，具有宿主范围广、致死率高的特点，尼帕病毒病（Nipah virus disease, NVD）为人畜共患的自然疫源性疾病，于1998年首次在马来西亚被发现，随后在新加坡、马来西亚、印度等国家暴发[1]，给养猪业造成巨大经济损失，为公共卫生带来巨大威胁。
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TaqMan探针荧光定量PCR反应试剂盒使用说明书
（Cat#Yu-R01-2）
【产品介绍】
TaqMan荧光探针的5’末端连接荧光基团，而淬灭剂则在3’末端。
PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
本公司专利技术生产的TaqMan探针荧光定量PCR反应试剂盒含有荧光增强剂，对FAM、HEX和VIC等荧光物质的有明显的荧光增强效果，灵敏度高，结果可靠，性能优良，在许多性能上完全超越国外同类产品。
【产品特点】
1. 适用于使用Taqman-TAMRA和Taqman-BHQ1等探针的实时荧光定量PCR，对FAM、HEX和VIC等荧光物质的有明显的荧光增强效果。
结合本公司的各种游离DNA提取试剂盒（Cat#Yu-CF-01-1，Cat#Yu-CF-01-2，Cat#Yu-CF-02-1，Cat#Yu-CF-02-2），可以进行游离DNA的定量检测。
2. 灵敏度高：本产品的扩增效率明显高于进口产品（图1）。
3. 稳定性好：本产品重复好，CV值<2%。
4. 操作简单：只需在反应体系中加入引物、探针、模板和ROX。
5. 本产品使用热启动酶，可以进行Hot Start法PCR反应。
6. 本产品无本品无OSHA规定的危险物品，安全无化学污染。
【适用仪器】
Thermal Cycler系列荧光定量PCR仪、Applied Biosystems系列荧光定量PCR 仪、Roche Diagnostics LightCycler系列荧光定量PCR仪、Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System等。
【试剂盒组成】
【规格】50T/盒
【贮藏与有效期】PCR反应预混液-20℃保存，有效期12个月。
开盖后，4℃保存，有效期2周。
Rox dye 2（50×）-20℃保存，有效期24个月。
【有效成分】Tris-Hcl，氯化钾，氯化镁
【自备试剂】无
【注意事项】
使用前务必认真阅读以下注意事项。
1. 使用前充分融解，轻轻颠倒混匀，避免起泡，短暂离心后使用。
2. 反应液的配制和分装务必使用无污染的尖嘴、EP管等。
3. 如果配制试剂时间较长，请将融解后的反应液于冰上放置。
4. 试剂盒仅供科研使用。
【操作步骤】
1、在无菌洁净PCR管中依次加入以下试剂：
注：以下仅为建议，最佳条件需要各个实验室摸索。
①通常引物浓度为0.2µM可以获得很好的结果。
反应不佳时，引物浓度可以在
0.1~1µM范围内调整。
②使用的探针浓度与定量PCR仪、探针种类和荧光标记物质有关。
通常探针终浓度在0.1~0.5µM范围内调整。
③模板添加量因模板溶液中靶基因的拷贝数不同而不同，模板添加量最好在100ng以下。
④ Rox是否加入视仪器而定。
2、充分混匀后短暂离心。
3、扩增：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火40秒，共40个循环。
注：以下仅为建议，扩增最佳条件需要各个实验室摸索。
①本试剂盒扩增结束后的ΔRn值一般大于1.0，如果ΔRn值小于0.8可视为扩增效果不佳。
②扩增效果不佳时可以考虑改变退火温度，或由两步法改为三步法。