最新何水林版基因工程第四章基因操作过程教学版
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连接效率较高 载体和外源片段的末端是互补的粘性末端
是一种通用的体外重组的方法 用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接
基因工程－－第四章 基因操作过程
5 重组率
重组率的定义 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。
基因工程－－第四章 基因操作过程 1 用于基因转移的受体菌或细胞
受体细胞应具备的条件 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体
基因工程－－第四章 基因操作过程 1.1 受体细胞应具备的条件
限制性缺陷型
外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）
重组整合缺陷型
用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）
基因工程－－第四章 基因操作过程
提高重组率的方法 提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：
基因工程－－第四章 基因操作过程 提高重组率的方法过程
第二节 重组体导入
用于基因转移的受体菌或细胞 重组DNA导入受体细胞的方法 转化率 转化细胞的扩增
不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大多数携带有目的 基因的重组质粒
基因工程－－第四章 基因操作过程
2 平末端的连接
不同粘性末端的连接
基因工程－－第四章 基因操作过程
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连 接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接， 因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括：
基因工程－－第四章 基因操作过程
人工粘性末端的连接 5′突出末端
基因工程－－第四章 基因操作过程
人工粘性末端的连接 3′突出末端
基因工程－－第四章 基因操作过程
人工粘性末端的连接 平头末端
基因工程－－第四章 基因操作过程
同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法 主要优点
不易自身环化 同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化
基因工程－－第四章 基因操作过程
具有较高的转化效率 具有与载体选择标记互补的表型 感染寄生缺陷型
防止重组细菌扩散污染，生物武器除外
基因工程－－第四章 基因操作过程
1.2 各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单， 重组子稳定 产结构复杂、种类繁多的内毒素 适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文 库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌
基因工程－－第四章 基因操作过程
3 人工接头连接法
人工接头
又称衔接物、适配子，是人工 合成的具有一个或多个限制性 内切酶识别和切割序列的双平 端DNA短序列，其分子长度约 为8－12bp。
基因工程－－第四章 基因操作过程
粘性末端的更换
基因工程－－第四章 基因操作过程 4 同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接法
同聚物加尾连接：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3′端各 加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体DNA分 子要分别加上不同的寡聚核苷酸
dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。 这种方法可适用于任何来源的DNA片段。 但方法较繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用
基因工程－－第四章 基因操作过程
酵母菌
具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单， 外源基因表达系统完善，遗传稳定 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 适用于外源DNA的扩增NA重组实验 和基因工程重要的真核性受体菌
加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
基因工程－－第四章 基因操作过程
平末端的连接的优点 适用于外源DNA片段与载体只有一个匹配点，同时考虑靶基因 插入方向时使用 靶基因以一个方向插入且非重组克隆背景低 可用T4－DNA ligase连接任何平末端
外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切 割后为非同源互补的黏性末端连接 外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切割 后一侧产生的黏性末端，另一侧产生平未端（可 先生成黏性末端再补平）
基因工程－－第四章 基因操作过程 双酶切片段的定向克隆的优点
外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒中，以便目的基因 的正确转录和表达 载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留，可以随时从重 组载体中通过相应的限制性内切酶切割后分离获得目的基因
基因工程－－第四章 基因操作过程
枯草杆菌
遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培养简 单，不产内毒素 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌
基因工程－－第四章 基因操作过程
链霉菌
抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素 遗传不稳定，生长相对缓慢 主要用于抗生素生产菌株的改良
何水林版基因工程第四章基因 操作过程教学版
基因工程－－第四章 基因操作过程
DNA的体外重组（切、接） 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） 转化子的筛选和鉴定（检）
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
同种内切酶生产的粘性末端的连接
基因工程－－第四章 基因操作过程
同尾酶生产的粘性末端的连接
基因工程－－第四章 基因操作过程
单酶切位点黏性末端 连接法的缺点
自身环化 双向插入 多拷贝插入 假阳性
基因工程－－第四章 基因操作过程 双酶切片段的定向克隆
是一种通用的体外重组的方法 用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接
基因工程－－第四章 基因操作过程
5 重组率
重组率的定义 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。
基因工程－－第四章 基因操作过程 1 用于基因转移的受体菌或细胞
受体细胞应具备的条件 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体
基因工程－－第四章 基因操作过程 1.1 受体细胞应具备的条件
限制性缺陷型
外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）
重组整合缺陷型
用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）
基因工程－－第四章 基因操作过程
提高重组率的方法 提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：
基因工程－－第四章 基因操作过程 提高重组率的方法过程
第二节 重组体导入
用于基因转移的受体菌或细胞 重组DNA导入受体细胞的方法 转化率 转化细胞的扩增
不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大多数携带有目的 基因的重组质粒
基因工程－－第四章 基因操作过程
2 平末端的连接
不同粘性末端的连接
基因工程－－第四章 基因操作过程
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连 接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接， 因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括：
基因工程－－第四章 基因操作过程
人工粘性末端的连接 5′突出末端
基因工程－－第四章 基因操作过程
人工粘性末端的连接 3′突出末端
基因工程－－第四章 基因操作过程
人工粘性末端的连接 平头末端
基因工程－－第四章 基因操作过程
同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法 主要优点
不易自身环化 同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化
基因工程－－第四章 基因操作过程
具有较高的转化效率 具有与载体选择标记互补的表型 感染寄生缺陷型
防止重组细菌扩散污染，生物武器除外
基因工程－－第四章 基因操作过程
1.2 各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单， 重组子稳定 产结构复杂、种类繁多的内毒素 适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文 库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌
基因工程－－第四章 基因操作过程
3 人工接头连接法
人工接头
又称衔接物、适配子，是人工 合成的具有一个或多个限制性 内切酶识别和切割序列的双平 端DNA短序列，其分子长度约 为8－12bp。
基因工程－－第四章 基因操作过程
粘性末端的更换
基因工程－－第四章 基因操作过程 4 同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接法
同聚物加尾连接：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3′端各 加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体DNA分 子要分别加上不同的寡聚核苷酸
dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。 这种方法可适用于任何来源的DNA片段。 但方法较繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用
基因工程－－第四章 基因操作过程
酵母菌
具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单， 外源基因表达系统完善，遗传稳定 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 适用于外源DNA的扩增NA重组实验 和基因工程重要的真核性受体菌
加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
基因工程－－第四章 基因操作过程
平末端的连接的优点 适用于外源DNA片段与载体只有一个匹配点，同时考虑靶基因 插入方向时使用 靶基因以一个方向插入且非重组克隆背景低 可用T4－DNA ligase连接任何平末端
外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切 割后为非同源互补的黏性末端连接 外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切割 后一侧产生的黏性末端，另一侧产生平未端（可 先生成黏性末端再补平）
基因工程－－第四章 基因操作过程 双酶切片段的定向克隆的优点
外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒中，以便目的基因 的正确转录和表达 载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留，可以随时从重 组载体中通过相应的限制性内切酶切割后分离获得目的基因
基因工程－－第四章 基因操作过程
枯草杆菌
遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培养简 单，不产内毒素 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌
基因工程－－第四章 基因操作过程
链霉菌
抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素 遗传不稳定，生长相对缓慢 主要用于抗生素生产菌株的改良
何水林版基因工程第四章基因 操作过程教学版
基因工程－－第四章 基因操作过程
DNA的体外重组（切、接） 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） 转化子的筛选和鉴定（检）
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
基因工程－－第四章 基因操作过程
同种内切酶生产的粘性末端的连接
基因工程－－第四章 基因操作过程
同尾酶生产的粘性末端的连接
基因工程－－第四章 基因操作过程
单酶切位点黏性末端 连接法的缺点
自身环化 双向插入 多拷贝插入 假阳性
基因工程－－第四章 基因操作过程 双酶切片段的定向克隆