草莓脱毒方法

草莓脱毒方法

以药剂处理加茎尖培养可增加脱毒效果,如盐酸四环素对草莓的四种病毒都有一定的抑制作用。

覃兰英等(1988)将草莓在35℃下热处理7 d后,逐步升温至38℃,在湿度40%～68%、光照度4 000～5 000 Lx条件下热处理35 d后,将长出的新茎茎尖再行组培,可获得100%的脱毒苗。

大泽胜次(1982)在进行单倍体育种时发现花培植株的脱毒率达100%。此法不仅可快速繁殖出大量无毒植株,还可省去病毒鉴定工作,在育种与生产应用上可谓一举两得。利用花药培养脱毒苗,其成功与否与花蕾大小的选择有关,应选取处于密封状态的小花蕾,此时的花粉发育期为单核靠边期。花蕾的大小与不同的品种有一定的差异。高庄玉等(1993)用草莓花药组培,其脱毒率达100%，用幼叶和茎尖产生的愈伤组织其再生植株脱毒率只有20%。

艾勇、赵佐敏等(2000)用1/2MS+0.1 mg/L IBA+琼脂4.5～7 g/L+白糖20 g/L诱导丰香草莓试管苗生根,生根率可达100%。移栽时不用任何基质处理,采取试管苗一次性入土移栽(适温20～25℃,1周内保持空气湿度在95%以上),幼苗成活率可达85%,

花药培养

草莓花药培养是获得无毒苗的途径之一，其优点是操作简单，并能大量繁殖。薜光荣等经花药愈伤组织直接分化出花药植株的途径培育出沙尔普斯等5个品种的脱毒苗，脱毒苗在生长、结果、可溶性固形物含量等方面均超过对照株，果实总产和平均果重均大幅度提高。这表明，实现草莓的无病毒栽培，将会给草莓生产带来很大的经济效益。

花药愈伤组织的诱导和再分化培养过程，以添加2 mg/L的6-BA和0.2~1.0 mg/L的NAA 为宜；茎尖分化培养过程中添加6-BA的浓度为0.5~1.0 mg/L；继代分化快繁过程中,6-BA 浓度一定要掌控好，要求6-BA的浓度在0.5~1.0 mg/L范围内不断变换调节，3周左右继代快繁一次,这样苗子在整个继代快繁过程中才能保持生长健壮、分化系数高(达到8~10倍)、无褐化现象发生等。反之，如果6-BA浓度过高(>2 mg/L)时,苗子会出现脆化、黄化、过密、矮化等现象；过低(<0·25 mg/L)时，苗子会出现细弱、弯曲、过高、生根过多等现象，均不利于苗子的分化快繁。生根培养中添加6-BA浓度以0·25 mg/L为最好，苗子生长粗壮、根系发达,发根率为100%。

将花药接种到1号培养基（MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1 mg/L+3%蔗糖）上，1周后花药陆续形成愈伤组织，达78.6%；1个月左右转接愈伤组织到2号培养基（MS+6BA 1 mg/L+NAA 0.l mg/L+3%蔗糖）上。注意观察，当芽长到lmm左右时转接到3号培养基（MS十6-BA 1mg/L+3%蔗塘）上，逐渐形成芽丛，1个月后，把芽丛分开成单芽再分别转接到新的3号培养荃上，让花继续分化生长;以后根据情况每隔10~30天转接一次.这样，年内每个分化组

织可获得5000~20000裸苗.

从培养基中取出草毒苗，洗去培养基后移栽到温室，浇透水，加塑料罩;l~2周内保持湿度95%一100%半月后打开塑料罩.2~3个月后移栽到大田栽培.

分化培养基:MS+BA0.25~0.5mg/L,糖30g/L，琼脂6g/L。每两周可获15~25倍分化苗,然后转移到生根培养基上。

生根培养基:MS+IBA(IAA)0.1~1mg/L,糖30g/L,琼脂6g/L,加入活性炭0.3g/L,增大光照，1个月左右可获得87.5%~100%的生根率。

草莓茎尖组织培养

草莓茎尖培养的目的有三：一是在短期内加速繁殖草莓优良品种以供商品化生产；二是挽救严重感染病毒的草莓优良品种；三是结合辐射诱变进行草莓品种的改良和选育。

草莓的茎尖培养始于20世纪60年代。通过茎尖培养可脱除植物病毒。国内覃兰英等

试验表明，茎尖培养有不同程度的脱病毒作用，茎尖越小，去掉病毒的机会越大。热处理后取茎分生组织培养，脱病毒的效果明显增加，经电镜观察鉴定证明其脱毒效果更为可靠。外植体选择：选择无病虫、品种纯正的健壮植株,栽于盆中,置人工气候箱内40℃处理16 h、35℃处理8 h、变温处理4周。在新生嫩枝上,切取带生长点的茎段3~4 cm为外植体,用流水冲洗干净。茎尖剥离将表面清洗过的外植体置于超净工作台上,用70%酒精表面消毒30 s,再用0.1%升汞消毒5~10min并不断搅动,然后用无菌水冲洗3~5次,去鳞片。在解剖镜下用针挑取茎尖0.2~0.3mm（带1～2个叶原基），立即接种于茎尖分化培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.05mg/L+蔗糖3% )中。培养条件草莓茎尖培养需温度为23~28℃,光照强度1000~3000 lx,光照12~16 h/d。诱导培养2~3个月,待丛生芽形成后转入增殖培养基。快速增殖：选取生长正常的试管苗,在增殖培养基(MS+BA 1·0mg/L+NAA 0·04mg/L+蔗糖3% )上进行增殖。增殖培养每20~30 d继代1次,总继代次数不超过10次。诱导生根：选高2~3 cm 的小苗转入生根培养基(MS+BA 1.0 mg/L+蔗糖3% ),经过20~30 d的生根培养,可形成完整植株的组培苗。不合格的试管苗全部销毁。

炼苗：将生根后的试管苗移栽到经过消毒的苗床或装有消毒基质的穴盘,置网纱(孔径0·42mm)覆盖的网室中,在温度l5~25℃、相对湿度85% ~90%条件下进行炼苗。初期适当遮阳,后期逐渐通风和增加光照, 2~3周后移栽苗成活。

用指示植物检测法进行草毒斑驳病毒、草毒皱缩病毒、草毒镶脉病毒和草莓轻黄边病毒的检测。未检测出病毒的样本,即为原原种苗,可用于原种苗的繁殖。

原种苗的繁殖：将脱毒原原种苗定植于无土壤线虫、无草莓病源和防虫隔离区内,分株繁殖的第1代植株即为脱毒原种苗,可用于生产用苗的繁殖。脱毒原种苗要接受病毒检测机构的定期病毒检测,要求病毒感染率不超过5%,一旦发现问题立即更换。

脱毒生产用苗繁殖：将脱毒原种苗定植于无土壤线虫、无草莓病源和防虫隔离区内,分株繁殖后代即为脱毒生产用苗。脱毒生产用苗直接用于草莓生产。脱毒生产用苗需接受病毒检测机构的定期病毒检测,要求病毒感染率不超过20%。

体细胞突变体筛选

近年来，日本领导的研究小组正致力于筛选草莓抗真菌枯萎病的抗病突变体研究。他们首先建立了叶片再生植株的实验体系，以病原真菌为选择筛选抗性愈伤并诱导成株，将这些再生植株栽培于含病原菌的土壤中，同时人工接种病原胞子液来鉴定植株的抗病性，他们从1225株再生植株中得到两个抗病体细胞无性系。这个结果表明，开展抗性突变体筛选研究有可能在短期内定向选择得到抗病、抗逆或抗除草剂的草莓新品种（系）。

草莓的基因转化

20世纪80年代末，国外一些实验室就开展了草莓的基因转化研究。利用草莓愈伤组织培养再生系统，分别成功地完成从农杆菌介导的基因转化。还建立了由草莓叶盘直接再生不定芽的技术。近年来，由于草莓原生质体再生成株技术的发展，利用原生质体直接吸收外源的草莓基因转化途径的研究也有了长足的进展。

芽诱导培养基为MS+BA 1.0 mg/L，培养温度为25℃,湿度70%~80%,光照强度约2 000Lx,光周期为15h/9h。每3~4周更换一次培养基。观察结果并记录。

继代培养：接种2~3个月左右,当生长点发育成1cm左右的芽团时,将其转移到继代培养基进行快繁培养。继代培养基以MS+BA 0.5mg/L为主,根据芽的生长繁殖状态以及不同阶段的不同需求,适时对BA的浓度进行调整,其他培养条件同上。继代培养时,分割的芽团含4~5个芽。每3周左右更换一次培养基。

诱导生根：生根前的最后一次继代培养将BA的浓度降低到0.2mg/L进行壮苗。尽量选取健壮的无根幼苗接种到生根培养基中诱导生根。生根培养基为MS+BA0.1mg/L+活性碳1.0g/L。移栽驯化：当根系长至2~3cm时,将生根幼苗连瓶一并转移到驯化室内进行练苗7d左右。方法:将培养瓶去掉封口膜后集中到一起,加盖小拱棚及50%遮阳网,注意保持拱棚内的温度及湿度,每天在保证幼苗不萎蔫的前提下逐渐加大小拱棚的放风量。待幼苗逐渐适应驯化室的温度和湿度后,把幼苗从瓶中拿出来,小心洗去根部的培养基,注意不要伤到根,按大小分级后移栽到移植盘中。移栽基质为草碳土∶农家肥=1∶1或蛭石∶农家肥=1∶1。待长出5片左右新叶时,采用小叶嫁接法用UC-5指示植物鉴定其脱毒效果。

草莓试管苗移栽基质以全蛭石效果最好，成活率平均为98.33％，株高及发根数、总根长等几项指标也较为理想。珍珠岩不宜作为草墓试管苗移栽的主要基质，因为幼苗生长黄弱，株高及总根长等项指标均不理想。