双歧杆菌的分离与培养_秦玲玲
双歧杆菌的分离与鉴定_吴拥军
作者单位:贵州农学院食品科学系 贵阳 550025 中国收稿日期:1997-01-03双歧杆菌的分离与鉴定吴拥军 王嘉福 尹峻峰摘 要 研究了适宜的双歧杆菌分离方法,从婴儿、成人粪便中分离到36株疑似双歧杆菌,经过属和种的系统生化鉴定,确认为青春双歧杆菌(B if idobacterium adoles -centis )20株和长双歧杆菌(Bif idobacterium longum )6株。
关键词 双歧杆菌 分离 鉴定 双歧杆菌是人类肠道正常菌群中一种重要的微生物,它有益于健康的原因被逐渐弄清。
它以生成醋酸为主,同时生成乳酸和少量的甲酸,在肠道中造成低pH 环境,抑制肠道中有害菌和致病菌的生长[1]。
双歧杆菌不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐,其代谢产物可抑制肠道中的硝酸盐还原细菌,可消除或显著减少亚硝酸盐致癌物质对人体的危害,并能合成多种维生素,促使酪蛋白消化,调节菌群失调,激活吞噬细胞活性,消除自由基、过氧化脂质及腐败菌产生的吲哚胺、氨、硫化氢有害物质[6]。
双歧杆菌为专性厌氧菌,对营养条件要求很高,对低pH 的抵抗能力极差,活性保持比较困难。
目前文献报道的方法[2][3][6]大多需要较高的实验条件或重复性差。
因此,研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 样品 分离样品采自贵阳地区婴儿、成人的粪便。
1.1.2 培养基分离培养基(%):蛋白胨2.0,酵母浸膏粉0.25,葡萄糖0.5,磷酸氢二钠0.25,氯化钠0.5,硫代乙醇酸钠0.1,L -半胱氨酸0.1,天冬氨酸0.01,重铬酸钾0.2,琼脂 1.5,牛肉汤50ml,肝汤50ml 。
调至p H7.5,0.7×105Pa 灭菌20min,冷至55℃加入5%～6%的无菌兔血或羊血制成培养皿平板。
增殖、纯化培养基:参照 1.2.1(不加兔血或羊血)。
糖发酵培养基(%):氯化钠0.5,蛋白胨 1.0,酵母浸膏0.25,硫代醇酸钠0.1,20%糖溶液 5.0m l,调节pH7.5,1kg /cm 2,30min 。
双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊的研制(全文)
双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊的研制(全文)AXX：1672979X(2021)07001106目前多数微生态活菌制剂存在以下两个亟待解决的问题：制剂经口服时，活菌因不耐胃酸、胆汁和消化酶等的作用而极易失活；双歧杆菌等厌氧菌易受外界环境因素(如氧气、温度)的影响[2]，常温下货架寿命短，要求在低温下保存销售，因而影响了此类产品的生产、销售和应用。
目前微胶囊技术是保护菌体活力最有效和有用的方法，该技术是利用天然或合成的高分子材料，将固体、液体甚至是气体的微小颗粒包裹在直径从小于1μm至5000μm的半透性或密封囊膜的微型胶囊内[1]。
由于微胶囊内的物质与外界隔离，可免受外界不利环境的影响，若采纳肠溶性囊材，还可幸免口服时胃液的破坏[3]。
空气悬浮法(又称流化床法)制备微胶囊，是将固体囊心物悬浮于由流化床产生的承载气流中，呈沸腾状。
囊液由喷嘴喷出，雾化形成微液滴，在囊室与悬浮的囊心物相遇，液滴在囊心物表面铺展并相互结合。
由于气体的不断流动，溶解囊材的有机溶剂迅速挥发，聚合物在囊心物表面形成囊衣。
被包囊的颗粒随气流在囊室循环，完成包囊与固化过程[4]。
本研究将空气悬浮微胶囊技术应用于微生态制剂，将长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、保护剂和双歧因子包封于肠溶囊膜内，制成长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌制剂，以期提高口服时的菌体存活率和常温下的保存期。
1材料1.1菌种长双歧杆菌(Bifitdobacteriumlongum，简称BL，CICC6068)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus，简称LA，CICC6005)：购自ZG工业微生物菌种保藏中心。
1.2培养基长双歧杆菌：大豆蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，酵母粉1.0g，葡萄糖1.0g，低聚木糖0.5g，无机盐溶液4mL，蒸馏水100mL，盐酸半胱氨酸0.05g(培养基热沸后加入)，调pH7.0，121℃灭菌15min。
固体斜面加琼脂1.5～2.0g。
长双歧杆菌22-5胞外多糖(EPS)合成条件的优化
长双歧杆菌22-5胞外多糖(EPS)合成条件的优化
欧阳清波;李平兰
【期刊名称】《中国乳品工业》
【年(卷),期】2005(033)002
【摘要】针对筛选出的产胞外多糖优良菌株长双歧杆菌22-5,采用单因素及正交试验,对其培养基组分及培养条件进行优化,确定生产EPS的最适培养基组成为蔗糖20 g,大豆蛋白胨10 g,MnSO4为5 g,牛肉膏10 g,乙酸钠5 g,柠檬酸铵2
g,K2HPO4为2g,MgSO4·7H2O为058 g,吐温80为1 mL,蒸馏水1000 mL;最适培养条件为初始pH值为5.0,20℃厌氧培养20 h.优化后菌株22-5EPS的产量可提高到1000 mg/L,是为优化前的3倍.
【总页数】4页(P12-15)
【作者】欧阳清波;李平兰
【作者单位】中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083
【正文语种】中文
【中图分类】TQ93.335
【相关文献】
1.双歧杆菌22-5胞外多糖(EPS)的分离、纯化及纯度鉴定 [J], 欧阳清波;李平兰;李伟欣;孙成虎
2.双歧杆菌22-5产胞外多糖发酵条件的优化 [J], 丁薛龙;沈骞;陈倩;尚楠;旭日花;
梁志宏
3.一株中度嗜盐菌胞外多糖合成条件优化及其絮凝性质研究 [J], 高爽;王特;陈箐;李丹妮;张苓花;朱益民
4.乳酸球菌胞外多糖合成条件的优化 [J], 陆冰;张雪;李达;孔保华;杨贞耐
5.植物乳杆菌KF5胞外多糖合成条件的优化研究 [J], 梁增澜;李慧;张睿;白小佳;王艳萍;李超
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
双歧杆菌的分离与培养_秦玲玲
B 3种碳源质量比
1︰1︰1 1︰1︰2 1︰2︰1 2︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3 0.5 0.7 0.9
注：4种氮源比例为：m（大豆蛋白胨）︰m（胰蛋白胨）︰m（酪蛋白水解物）︰m（牛肉浸膏）； 3种碳源比例为：m（葡萄糖）︰m（异麦芽糖）︰m（乳糖）。
2 结果
2.1 菌落与菌体形态特征 含有双歧杆菌的酸奶制品，经过系列稀释、涂布、分离纯
固定维生素、矿物质、L-半胱氨酸、吐温-80的用量，采用正交实验设计(L16(43))优化氮源（A）、碳源 （B）和酵母浸出粉（C）的用量，因素水平见表1。
表1 基础培养基优化正交实验因素水平表(L16(43))
水平
1 2 3 4
A 4种氮源质量比
1︰1︰1︰2 1︰1︰2︰1 1︰2︰1︰1 2︰1︰1︰1
双歧杆菌只生长在接种的穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性。
2.4 生长曲线的绘制
单一菌株的生长曲线如图 5 所示。
由图 5 可知，12 h 之前菌体数量大量增长，12 h 时达到对数生长期，随后菌体数量基本保持不变。 OD 值虽然不能直接准确地反映活菌数，但是可以大 致反映菌液中菌体的多少、菌液的浓度。OD 值越大 表明菌液中菌体含量越多。 2.5 培养基的优化
1︰1︰1
0.5
1.892
大熊猫源双歧杆菌分离株的培养特性及药敏试验
平板 、 普通 肉汤 、 厌氧 肉肝 汤 和改 良肉汤培养 基 中 ， 放 人恒温培养 箱 ３ ７ ℃培 养 ２ ４ ｈ取 出 ， 观察 其 在 血琼 脂
平板上 的菌落形态 、 进行 革兰染 色 后显微 观 察细 菌形
（ １ ． 杨 凌职业技术学 院， 陕西杨凌 ７ １ ２ １ ０ ０ ； ２ ． 陕西 省珍 稀 野 生 动 物 抢 救 饲 养 研 究 中 心 ， 陕西周至 ７ １ ０ ４ ０ ２ ）
摘
要： 双歧杆 菌的培 养特性和 药敏 试验是研 究 双歧杆Байду номын сангаас茵微 生 态制 剂的基 础 。从 大 熊猫 新 鲜 粪便 中分 离
钠， 由沧州 隆 昌化工有 限公 司生产 ， 生产批 号 ０ ９ ０ ８ １ ７ 。
标准抗菌 药物纸片 ， 由杭州天 和微 生物试 剂 有 限公 司
宝” ， 然而 由于其 食物 单调 ， 数量 稀少 、 繁殖 率低 下 、 疾 病 等原 因使 得大熊猫 濒临灭 绝 ， 为 了保 护这 一濒 危 动 物， 国家建立 了很多 自然保 护 区进 行人 工饲 养Ⅲ 。饲
菌落 ， 边缘整 齐 ， 隆起 ， 灰 白色 ， 不透明， 表 面光 滑 。分
讯 医疗 器械 厂 生产 ； 恒 温 培养 箱 ， 上海 跃 进 医疗 器 械 状 ， 单生 、 栅栏状 、 “ Ｖ” 字形 或“ Ｙ ” 字 形排 列 ， 菌落 为小 厂生产 ； 冰箱 ， 海 尔集 团生产 。焦性 没食 子 酸 ， 由衢州
的两株 双歧 杆 菌进 行 细菌培 养 、 药敏 试验及 耐温驯化等研 究发现 ， 改 良肉汤培 养基是 双歧杆 菌 大熊猫 分 离株 体 外增 殖理 想 的培 养基 ； ２个双歧杆 菌大 熊猫 分 离株均 对红 霉素 、 氯霉 素等敏 感 ， 对青 霉素 等产 生较 高 的耐 药性 ；
双歧杆菌的分离培养及鉴定
厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。
双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。
初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH8.0~8.5不生长。
其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。
双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。
该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。
该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。
双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。
这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。
本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
实验方案(双歧杆菌的分离)
1双歧杆菌的分离1.1样品取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。
1.2培养基根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。
选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。
1.2.1缓冲蛋白胨水溶液（BP）成份：蛋白胨10gA磷酸氢二钠2g葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g氯化钠5g 蒸馏水1000ml制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121°C，杀菌15min后置4°C的冰箱中备用。
1.2.2选择性改良NPNL培养基（苏世彦）成份：酵母膏5g淀粉0.5g蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g胰蛋白胨5g溶液A10ml大豆蛋白胨5g溶液B5ml葡萄糖10g溶液C50ml乳糖3g琼脂A15g吐温801g pH7.2牛肝提取液150ml制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121C杀菌10min，备用。
溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g 溶于蒸馏水100ml。
溶液B：FeSO ・7H O 0.2g、MgSO ・7H O 4g、MnSO ・4H O4 2 8^42$ 4 20.135g、NaCl 0.2g 溶于蒸馏水100ml。
溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。
1.2.3 NPNL培养基（孙雪）培养基成分及用量：牛肉浸汁粉（oxoid）3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，植胨3g,酵母浸出汁5g,肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml,溶液B 5ml,吐温80 1g,盐酸半胱氨酸0.5g, 琼脂15g，蒸馏水815ml, X-Gal（5-漠-4-氯-3』引噪-。
-D-半乳糖苷）60mg。
pH 7.2, 121 °C, 15min 高压灭菌。
溶液A：K2HPO4 25g, KH2PO4 25g，蒸馏水250ml。
长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的分离及其免疫、抑瘤活性的研究的开题报告
长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的分离及其免疫、抑瘤活性的研究的开题报告一、研究背景与意义长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）是人体肠道中的一种重要益生菌，具有显著的益生作用，能够维持肠道菌群平衡，促进食物消化吸收，增强免疫力等。
近年来，人们越来越关注长双歧杆菌的生物活性成分，尤其是其细胞壁成分。
长双歧杆菌细胞壁包括完整肽、聚糖、脂类和其他辅助成分，其中完整肽和聚糖是最重要的成分。
完整肽和聚糖具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等生物学活性，因此被广泛用于保健品、药品和食品等领域。
然而，目前对长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的研究还比较少，尤其是其免疫和抑瘤活性的研究还不够深入。
因此，本研究旨在分离长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖，并探究其免疫和抑瘤活性，为其应用于保健、药用和食品等领域提供科学依据。
二、研究内容和方法（一）分离长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖采用酶解法和超声波法共同分离长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖，首先用胰蛋白酶、细胞酪蛋白酶等酶对细胞壁进行预处理，然后利用超声波破碎细胞壁，最后通过分级沉淀、凝胶层析和离子交换层析等步骤分离纯化完整肽和聚糖。
（二）免疫活性研究采用小鼠免疫增强实验和脾淋巴细胞增殖实验探究长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的免疫活性，观察其对小鼠克隆增殖、巨噬细胞活性、淋巴细胞增殖及免疫球蛋白（IgG、IgA）等的影响。
（三）抑瘤活性研究采用小鼠肝癌模型和人肝癌细胞系HepG2进行体内和体外实验，研究长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的抑瘤活性，观察其对肝癌生长、肿瘤体积及肝功能等的影响。
三、预期成果与意义预计通过本研究，可以分离纯化长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖，探究其免疫和抑瘤活性。
同时，对长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的检测方法、生物学活性机制等方面也将进行深入探究，为其应用于保健、药用和食品等领域提供科学依据。
本文的意义在于为长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）及其细胞壁完整肽聚糖的生物学性状深入了解，为其在药品、保健品和食品领域的研究和开发提供有益的参考依据。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第 24 卷第 3 期 2008 年 5 月
齐齐哈尔大学学报 Journal of Qiqihar University
Vol.24,No.3 May,2008
双歧杆菌的分离与培养
秦玲玲，廖海印，金雨华，张宁，张鹭
（齐齐哈尔大学 生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔，161006）
摘要：利用大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶且活性较高的特性，在改良的 MRS 培养基中加入 X-Gal（5-溴-4-氯
pH
B
C
4.18
4.11
4.24
4.14
4.14
4.15
4.06
4.21
0.18
0.10
从表3可以看出：3个因素对2个指标值的影响均是 B > A > C ，即碳源比例对指标的影响最显著，氮
源次之，酵母粉的添加量对指标值的影响最小；对OD值和pH的影响，碳源与氮源差别不显著，说明碳源
与氮源是影响双歧杆菌增菌效果的2个重要因素。由于酵母粉主要是 提供维生素，又因为在基础培养基中添加了维生素溶液，所以可能 造成酵母粉对指标值的影响偏小。综合2个指标值可以看出：A因素 的4水平、B因素的4水平、C因素的3水平组合在一起，增菌菌液吸 光值最高，pH较低，说明此种组合增菌效果最显著。以此组合做验
实验号 1
A 4种氮源质量比
1︰1︰1︰2
B 3种碳源质量比
1︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3
指标
OD 600nm
pH
1.761
4.02
2
1︰1︰1︰2
1︰1︰2
0.5
1.641
4.18
3
1︰1︰1︰2
1︰2︰1
0.7
1.769
4.09
4
1︰1︰1︰2
2︰1︰1
0.9
1.831
4.03
5
1︰1︰2︰1
1 材料与方法
1.1 材料与培养基 含有双歧杆菌的酸奶制品，购自齐齐哈尔医学院研究所。 改良的 MRS 固体培养基：胰蛋白胨 5 g、酵母浸出粉 5 g、柠檬酸铁铵 2 g、乙酸钠 5 g、Na2HPO4 2 g、
MnSO4 0.05 g、MgCl2 0.5 g、葡萄糖 15 g、乳糖 5 g、L-半胱氨酸 0.5 g、X-Gal 0.06 g、吐温-80 1ml、琼脂 25 g、水 1 000 ml。调 pH7.0，121℃灭菌 15 min。
B 3种碳源质量比
1︰1︰1 1︰1︰2 1︰2︰1 2︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3 0.5 0.7 0.9
注：4种氮源比例为：m（大豆蛋白胨）︰m（胰蛋白胨）︰m（酪蛋白水解物）︰m（牛肉浸膏）； 3种碳源比例为：m（葡萄糖）︰m（异麦芽糖）︰m（乳糖）。
2 结果
2.1 菌落与菌体形态特征 含有双歧杆菌的酸奶制品，经过系列稀释、涂布、分离纯
端尖锐[6]。
2.3 生理生化反应测定பைடு நூலகம்果
2.3.1 革兰氏染色
·80·
齐齐哈尔大学学报
2008 年
染色后，细胞保留初染剂的颜色蓝紫色，则判断双歧杆菌为革兰氏阳性菌。
2.3.2 KOH 试验
抬起接种环后无拉丝现象，则双歧杆菌为 KOH 阴性菌。
2.3.3 过氧化氢酶测定
无气泡产生，则判断为过氧化氢酶阴性反应。
菌种活化扩培后，以 2.5%的接种量接种于改良的 MRS 液体培养基中，37℃厌氧培养，分别于 0，4， 8，12，16，20，24，28，32 h 取样，用 UV7500 紫外分光光度计在 600 nm 条件下比色，测定菌液的吸光 值，以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制生长曲线，同时测定培养基的 pH[5]。 1.3.4 培养基的优化
21 世纪是生命科学的世纪，社会的进步促使人们的精神压力和工作压力增大，寻求健康长寿提高生活 质量是生命科学研究的主题，双歧杆菌的开发与利用有其巨大的潜力和广阔的市场，也必将促进微生态学、 生理学、营养学、病理学、食品开发学、保健科学出现新的显著性突破[8-10]。
参考文献
[1] 吕志勇，吕志刚. 双歧杆菌的保健功能及其产品研发[J]. 安徽农业科学，2006，34（19）：5031-5032. [2] 吴拥军，王嘉福，蔡金腾，等. 耐氧双歧杆菌生长代谢过程的研究[J]. 食品科学，2001，（10）：40-43. [3] 赵红梅，朱恩波. 荆州地区牛乳中双歧杆菌的选择性培养[J]. 乳品加工，2000，（10）： 48-49. [4] 刘兰，曹郁生，黄筱萍. 双歧杆菌选择计数方法的研究进展[J]. 食品与发酵工业，1999，25（4）：61-63. [5] 沈萍，范秀容，李广武. 微生物学实验[M]. 3 版. 北京：高等教育出版社，2002：119-123. [6] 凌代文. 乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M]. 北京：中国轻工业出版社，1999：1-129. [7] 汤丹剑，卫莉，张文. 培养方式对双歧杆菌检测结果的影响[J]. 中国乳品工业，2000，28（1）：20-22. [8] 陈雪梅，邱翔. 双歧杆菌的研究进展[J]. 营养与日粮，2007，（214）：15-17. [9] Ishibashi N and Shimamura S. Immunpotenttiacting Propeties of Bifodobacterium Longum[J]. Food Technol，1993，（6）：126-135. [10] Hughes D B and Hoover D G. Growth promotion of Bifidobacterum species by whey and casein fraction from human and bovine
收稿日期：2008-03-03 作者简介：秦玲玲(1983-)，女，黑龙江呼兰县人，在读硕士研究生，主要从事微生物遗传学研究，E-mail：qllhzl@。
第3期
双歧杆菌的分离与培养
·79·
根据菌落形态、X-Gal 颜色反应及染色镜检等进行初步菌种鉴定[4]。挑取具有双歧杆菌形态特征的菌株 进行生理生化反应，包括革兰氏染色、KOH 实验、过氧化氢酶实验、明胶液化、吲哚实验、好氧实验、运 动性检测等。 1.3.3 生长曲线的测定
各营养的功能、组成、对菌株生长产生影响的原理，这些都需要讨论。下一步工作的设想是将乳清直 接作为双歧杆菌的培养基，使得乳清中的乳清蛋白和乳糖共同对其生长起促进作用。将乳清培养基与双歧 杆菌基础培养基对其培养的效果进行对比；调整乳清培养基成分以得到更高的双歧杆菌活菌数，降低双歧 杆菌的生产成本，为进一步研究双歧杆菌的高浓度培养奠定基础；对分离的双歧杆菌菌株进行耐药性因子 检测以及耐酸和耐氧驯化，使其成为能够安全食用并应用于生产优良菌株。
图 1 双歧杆菌的形态（100×）
图 2 婴儿双歧杆菌
图 3 两歧双歧杆菌
图 4 长双歧杆菌（100×）
由图 2～图 4 可见，婴儿双歧杆菌，革兰氏阳性、染色不均匀、菌体呈两头尖中间粗或是呈 V 字形；
两歧双歧杆菌，菌体呈 Y 字形，并且分支末端圆形；长双歧杆菌，大多为短杆状，个别呈 Y 字形，分支末
2.3.4 吲哚试验
在乙醚和培养物之间没有产生红色环状物，则为阴性反应。
2.3.5 需氧试验
接种管经培养后，培养液清澈，管底大量菌体沉淀，可判断双歧杆菌为厌氧菌。
2.3.6 明胶液化
将已接种培养的接种管和未接种的对照试管置于冰箱中，对照管凝固时，接种管也凝固，可判断为阴
性反应。
2.3.7 运动性检测
按表1的因素水平表，采用L16(43) 正交实验设计 表实施实验，以培养液pH和吸光值为指标，测定结
OD600nm
1.8 1.6 1.4 1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
4
8
12
16
20
24
28
32
培养时间/ h
图 5 双歧杆菌的生长曲线
果见表2，相应的极差分析见表3。
表2 基础培养基优化的正交实验结果(L16(43))
双歧杆菌（Bifidobacterium）是 Henry Tissier 于 1899 年首次在法国巴斯德实验室从母乳营养儿的粪便 中分离出来的一种厌氧菌，是肠道微生态的重要组成部分，也是人类最早发现的益生菌之一。因其在轻度 弯曲的末端常见分叉，因而命名为双歧杆菌[1]。现已发现的双歧杆菌有 30 多个种，来自人体的有 12 种。 研究表明，双歧杆菌具有维护肠道生态平衡、抗菌、增强免疫功能、抗肿瘤作用等多种生物学功能，在预 防和治疗疾病及促进人体健康方面起着重要作用。目前双歧杆菌类产品主要有食品、保健品、药品等。而 在此类产品的开发中大多数产品活菌量很低，保存不到一个月就全部死亡。因此，如何缩短培养时间并提 高活菌数目，就成为了技术关键[2]。本研究就是基于此目的，优化分离到的双歧杆菌培养基，缩短培养时 间并提高活菌数，为今后产品的开发奠定基础。
-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）作为显色底物，产生颜色反应，进而从市售酸奶中分离出 3 株双歧杆菌，并对其中的
1 株进行生长曲线的绘制及培养基成分的优化，为今后双歧杆菌产品的开发及生物学功能的探索奠定基础。
关键词：双歧杆菌；分离与鉴定；生长曲线；培养基