咖啡因在大鼠及小鼠肝微粒体中体外代谢种属差异研究

咖啡因在大鼠及小鼠肝微粒体中体外代谢种属差异研究咖啡因及其代谢产物在临床应用中具有重要作用，该文拟采用高分辨质谱系统对咖啡因经大鼠及小鼠肝微粒体代谢进行系统研究，以全面评价咖啡因体外代谢产物以及体外代谢的种属间差异。

采用基于MMDF的UPLCQTOFMS/MS高分辨质谱系统，借助metabolitepolite软件，分析咖啡因经大鼠及小鼠肝微粒体代谢的产物及种属差异。

研究发现咖啡因经大鼠及小鼠肝微粒体后产生除以往分析中的去甲基、氧化等产物之外，还存在甲基化、双氧化、脱水以及脱羰基新的代谢产物，并发现大鼠及小鼠体外代谢的明显差异。

在小鼠体外代谢物中发现的去甲基代谢物M2（C7H8N4O2）和脱羰基代谢物M6（C7H10N4）在大鼠体外代谢物中并为发现，但是在大鼠体外代谢中发现的M7（C8H12N4O5），在小鼠中并未发现。

咖啡因药物在大鼠及小鼠的体外代谢存在明显种属差异，将对咖啡因进一步代谢研究及安全性评价提供重要参考价值。

标签：咖啡因；微粒体；代谢；种属差异[Abstract]Caffeine and its metabolic products play an important role in clinical applications An ultrahigh performance liquid chromatography/quadrupole timeofflight mass spectrometry （UPLCQTOF MS/MS）method was applied to systemically study the caffeine metabolism in liver microsomes of rats and mice，and comprehensively evaluate caffeine metabolites in vitro and metabolism differences between species The caffeine metabolites and metabolism differences between species in liver microsomes of rats and mice were analyzed by UPLCQTOFMS/MS high resolution mass spectrometry system and metabolitepolite software The results showed that in addition to the demethylated and oxidized products in previous analysis，methylated，double oxidized，dehydrated and decarbonylated metabolites were also found in caffeine metabolism in liver microsomes of rats and mice，with significant difference in metabolism in vitro between rats and mice The demethylated metabolite M2（C7H8N4O2）and decarbonylated metabolite M6（C7H10N4）in metabolism in vitro of mice were not found in rats，and the in vitro metabolite M7（C8H12N4O5）in rats were not found in mice There was significant species difference in caffeine metabolism in vitro between rats and mice，providing important reference value for the further metabolism study and safety evaluation of caffeine[Key words]caffeine；microsomes；metabolism；species differencesdoi：10.4268/cjcmm20161028药物在体内的代谢过程导致药物的药理活性发生变化，直接引起药物活性变化和安全性的风险，药物代谢在新药的设计与开发，药物临床前评价与研究，治疗药物检测以及药物安全性评价等方面都具有重要意义[1]。

但是在实际的临床前评价中并不能直接在人体进行实验，而是通过动物的体内与体外等途径获取申报资料的药效学、药代学以及毒代方便的资料，以判断药物成药的可能性以及在人体应用的安全范围[2]。

由于动物的种属差异、药物代谢途径、代谢速率等都存在着较大的差别，因此，研究药物体外代谢的种属差异对药物代谢研究以及药物安全性评价都具有重要意义[39]。

咖啡因（caffeine）是甲基黄嘌呤生物碱，广泛分布于茶叶、咖啡等多种食物中，纯品咖啡因为白色、强烈苦味的粉状物，化学式C8H10N4O2，化学名1，3，7三甲基黄嘌呤或3，7二氢1，3，7三甲基1H嘌呤2，6二酮。

适度使用咖啡因有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上多应用于感冒药的复方制剂中。

大剂量或长期使用咖啡因具一定的成瘾性，由于药物的耐受性而导致用药量不断增加时，咖啡因不仅作用于大脑皮层，还能直接兴奋延髓，引起阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝、肾等重要内脏器官，诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤等疾病，甚至导致下一代智能低下，肢体畸形，属国家管制的精神药品[5]。

咖啡因体内代谢过程复杂，在尿液中现今已发现咖啡因15种主要的代谢产物，咖啡因的使用与生命健康关系紧密[1011]，并已作为药物代谢酶活性测定的探药，但由于咖啡因代谢产物复杂，检测手段限制，并未完全展现咖啡因的代谢过程。

本文拟借助高分辨LCMS/MS系统，进一步分析咖啡因在微粒体中的体外代谢过程，更深入的了解咖啡因的代谢产物，并对其在大鼠及小鼠肝微粒体中的体外代谢进行种属差异研究，为咖啡因的药物代谢研究以及药物安全性评价提供参考意义。

1材料Triple TOF 4600高分辨质谱系统（美国ABSCIEX公司）；LC30AD超高效液相系统（日本SHIMADZU公司）；R21G型高速冷冻离心机（日本日立公司）；Elix10超纯水净化系统（美国MILLIPOER公司）；组织匀浆机（德国IKA公司）；XS105 1/10万精密电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。

咖啡因（caffeine，Agilent Technologies，Kit for capillary LC OQ/PV，批号N080776）；小牛血清蛋白（Albumin Bovine V，批号020*********）；NADPH 还原型辅酶Ⅱ（triphosphopyridine nucleotide，SigmaAldrich公司，批号N7505）；无水氯化镁（magnesium chloride，阿拉丁公司，批号1107758）；甲酸（formic acid，SigmaAldrich公司，批号5630210ML）；乙腈、甲醇均为色谱纯（美国Fisher公司），其他试剂均为市售分析纯，水为超纯水。

清洁级雄性SpragueDawley （SD）大鼠、清洁级昆明小鼠各5只，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格许可证号SCXK（渝）20070002 。

2方法21大鼠及小鼠肝微粒体蛋白的制备分别脱臼处死后立即取肝脏，用含015 mol·L-1KCl的100 mmol·L-1磷酸钾缓冲盐（pH 74）冲洗至土黄色，各自冰上匀浆。

采用差速离心法制备微粒体[12]，以小牛血清蛋白为对照品，采用Lowry 法测定微粒体蛋白含量[13]。

22咖啡因经大鼠及小鼠肝微粒体的代谢为了检测咖啡因经大鼠及小鼠肝微粒体代谢的产物，分别取500 mg·L-1咖啡因对照溶液20 μL加入终体积200 μL 微粒体反应体系中，肝微粒体反应酶体系[11]包括05 g·L-1大鼠或小鼠肝微粒体蛋白，4 mmol·L-1MgCl2溶液20 μL，100 mmol·L-1 PBS缓冲液140 μL。

于37 ℃循环水浴中预孵3 min，加入10 mmol·L-1NADPH 20 μL起始反应。

分别于37 ℃循环水浴中反应0，30 min，分别加入冰乙腈200 μL终止反应，4 ℃下以12 000 r·min-1离心15 min，取上清于4 ℃保存至检测。

23Triple TOF 4600高分辨质谱系统的分析条件取离心后上清液5 μL进样分析。

超高效液相检测条件：Kinetex XBC18柱（21 mm×100 mm，26 μm），流动相含01%甲酸的超纯水（A）乙腈（B），梯度洗脱，0～1 min，10%B，1～5 min，10%～80%B，5～7 min，80%B，7～701 min，80%～10%B，701～10 min，10%B，流速300 μL·min-1；柱温30 ℃。

Triple TOF 4600高分辨质谱系统采用ESI离子源，分别采用positive和negative 2种离子化方式，质量扫描范围m/z 50～300，鞘气55 Pa，辅助气55 Pa，气帘气25 Pa，雾化温度600 ℃，采用TOFMSProduct IonIDA扫描模式，TOF/MS 一级预扫描和触发的二级扫描Product IonIDA离子累积时间分别为250，100 ms，采用多重质量亏损（MMDF）和动态背景扣除（DBS）作为二级触发条件，解簇电压80 V，CE碰撞能量为35 eV，CES碰撞能量叠加为（35±15）eV。

3结果与讨论通过查阅文献对咖啡因已知代谢途径进行分析，咖啡因的代谢物主要有15种。

根据已知信息，采用Analyst TF16，Peakview （Version 12，AB SCIEX）以及MetabolitePilot （Version 15，AB SCIEX）软件对咖啡因代谢后质谱数据进行处理分析。

以相对分子质量与理论精确相对分子质量的偏差<10为原则，确定各色谱峰对应化合物的分子式，在已获知的咖啡因代谢物信息中检索匹配的化合物。

31咖啡因对照品质谱信息分析咖啡因对照品采用23项下方法进行分析，结果见图1。