肝微粒体制备
洛克沙胂对猪肝微粒体CYP3A4及CYP2E1蛋白的影响
洛克沙胂对猪肝微粒体CYP3A4及CYP2E1蛋白的影响蒋美琳;李银生;赵春;鲁晓旭;周新初;王秀红;邱江平;艾晓杰【摘要】洛克沙胂是一种常用的饲料添加药物,细胞色素P450酶系(CYP或P450)是动物体内药物代谢的主要酶类.本文研究了洛克沙胂对猪肝微粒体P450酶系中的2种酶CYP3A4和CYP2E1的蛋白表达的影响,为揭示该药的代谢机理、残留机制以及临床安全用药提供理论依据.实验将洛克沙胂以5、25和125 mmol/L 3个剂量,分别添加到猪肝微粒体体外孵育体系中,以生理盐水作对照,于37℃孵育1h,测定微粒体蛋白含量及CYP3A4及2E1的蛋白表达.结果表明中剂量和高剂量的洛克沙胂对猪肝细胞微粒体的CYP3A4及2E1的蛋白表达均呈现抑制作用,而低剂量的洛克沙胂对CYP3A4和CYP2E1的蛋白表达影响很小.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2015(033)004【总页数】6页(P38-42,52)【关键词】洛克沙胂;CYP3A4;CYP2E1;猪肝微粒体;Western blot【作者】蒋美琳;李银生;赵春;鲁晓旭;周新初;王秀红;邱江平;艾晓杰【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240【正文语种】中文【中图分类】S859.791细胞色素P450酶系(cytochrome P450 enzymes,CYP450.CYP)是一类参与机体内内源性和外源性物质以及药物代谢的血红蛋白酶类,在调节机体与外环境的相互作用以及保持机体内环境的稳态中起着重要作用[1]。
药物代谢动物实验基本操作注意事项
动物实验的基本操作
订实验动物 一般计划要做药理实验后，先订动物，饲养中心送动物 过来需要时间，如果动物供应紧张的时候，很可能等的
粪便温孵法 肠菌酶法
单一菌种温孵法
肝微粒体的制备
差速离心法
通过高速离心 使微粒体与其他成 分分离，操作简单， 无需其他试剂辅助， 但需要的时间长， 对设备的整体要求 高。
CaCl2沉淀法 制备肝微粒体， 即在离心前额外加入 CaCl2 ， 促 进 微 粒 体 的聚集和沉降。这种 方法对设备要求降低， 而且缩短了实验所需 的时间，是研究药物 体外代谢，制备微粒 体的常用方法。
药物代谢-生物转化
一相代谢
氧化，还原，水解反应； CYP450酶
二相代谢
内源性物质结合反应； UGTs，SULTs, NAT, GST, MT
药物代谢研究方法
体内代谢法 综合地考虑各种体内 因素对药物的影响,能 够真实全面地反映药 物代谢的体内整体特 征 药物在生物体内的分 布比较广，加上代谢 转化的器官和酶系的 多样性，使药物及其 代谢产物在体内的浓 度低，代谢产物的检 测具有一定的难度
要从尾部下四分之一处进针,血管表浅,好扎,而且如果 万一没打进,还可以向上找位置再打
进针后, 有没有回血很重要,回血肯定扎进了,如果没 有自动回血的话,轻轻回抽下,有回血的话就注射,扎进 血管,注射通畅,没有阻力。如果很难推进，一般是没 扎进，就不要再推了，打到组织里面会水肿，然后整 个血管就看不清了，无法注射。自己觉得没回血最好 别注射，换位置，一般是没进。 注射完毕一定要止血，不然药物可能随血流出来，给 药量不准了。
肝微粒体的制备
肝微粒体的制备肝微粒体是细胞内的一种重要细胞器，其具有多种生物合成和代谢功能。
为了研究肝微粒体的结构和功能，科学家们开展了一系列的制备方法。
肝微粒体的制备方法主要包括离心法、差速离心法和梯度离心法。
离心法是最常用的制备方法之一。
首先需要从动物或人体中提取肝脏组织，然后将组织切碎并加入缓冲液。
接下来，用离心机对混合物进行离心，使得细胞器按照密度分层。
通过不同离心速度和离心时间的调节，可以分离出肝微粒体。
差速离心法是离心法的一种改进方法。
该方法利用不同细胞器的密度差异，通过多次离心来进一步分离纯净的肝微粒体。
首先，将组织切碎并加入缓冲液进行离心，得到一个粗制的肝微粒体上清液。
然后，将上清液进行再离心，获得更纯净的肝微粒体。
通过多次离心，可以得到更高纯度的微粒体。
梯度离心法是一种更为精细的制备方法。
该方法利用不同密度的梯度溶液，通过离心使得细胞器分层。
首先，制备不同浓度的梯度溶液，然后将组织切碎并加入梯度溶液。
接下来，用离心机对混合物进行离心，使得细胞器按照密度分层。
通过调节离心速度和时间，可以分离出纯净的肝微粒体。
肝微粒体的制备方法选择取决于研究的目的和需要。
离心法简单易行，适用于初步的制备。
差速离心法和梯度离心法需要更多的技术和设备支持，但可以得到更高纯度的肝微粒体。
在肝微粒体的制备过程中，需要注意以下几点。
首先，组织的采集和处理需要在低温和无氧条件下进行，以保持微粒体的完整性和活性。
其次，离心速度和时间的选择应根据具体实验要求进行调整，以获得最佳的分离效果。
此外，在制备过程中，需要注意避免污染和交叉感染，以确保实验结果的准确性和可靠性。
肝微粒体的制备是研究肝细胞生物学和代谢过程的重要工具。
离心法、差速离心法和梯度离心法是常用的制备方法，选择适合的方法可以得到纯净的肝微粒体。
在实验过程中，需要注意操作技巧和实验条件的控制，以确保制备的微粒体质量和纯度。
通过这些制备方法，科学家们可以更深入地研究肝微粒体的结构和功能，为相关疾病的治疗和药物研发提供理论基础。
(仅供参考)实验4-肝微粒体制备
6.肝微粒体（hepatic microsome）富含多 种物质代谢酶类，在外来化学物的生物转 化中起着极其重要的作用。某些外来化合 物可通过诱导或抑制肝微粒体代谢酶的活 性，影响其他外来化学物在体内的代谢结 局。
8.离心25000g/min, 15min；
9.按1g肝组织加1ml磷酸缓冲盐溶液,充分混 匀后冻存管分装,置-80℃冰箱内保存待用.
注意事项：
上述过程应使用预冷的匀浆介质、缓冲液 和离心转头。匀浆器、容器等均应保持在冰 浴中，以维持组织及其制备物在0－4℃的!
4. 将匀浆液离心（4℃，1000g，10min）
5.取上清离心（12000g,10min）；
6.取上清计算体积，按10：1比例加入预冷氯 化钙，冰浴5min，摇匀，以25000g/min离 心15min,弃上清得粉红色微粒体沉淀 。
7.将微粒体沉淀混悬于氯化钾-Tris-盐酸缓 冲液中(2ml)，用漩涡混合器充分混匀；
三、实验步骤
1. 处死小鼠；
2. 快速摘除肝脏，自门静脉注入预冷的冰生理盐水 20-50ml，冲洗肝脏至土黄色，再用生理盐水将 肝脏外周血水冲洗干净，用滤纸擦干净后称重、 记录。
3. 将称重后的肝组织置于烧杯中（置冰板上）剪碎 ，转入匀浆管中，并按每克肝组织加1～2ml预冷 的蔗糖-Tris-盐缓冲液，用电动匀浆机制备匀浆 （转速1000rpm）（冰浴中）,研杵上下移动8－ 10次，定容至5ml。
2.肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微 粒体能够在不同的离心速度之下，从其他 的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。
3.组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线 粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并 分离，而细胞色素P450、内质网碎片及 其他可溶性酶素则保留在上清中。
大鼠肝微粒体的制备教学文稿
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。
合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。
结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。
3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。
4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。
5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。
6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。
7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。
8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。
同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。
9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3−0.5 mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。
实验4-肝微粒体制备-20121108讲课
2.肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微 粒体能够在不同的离心速度之下，从其他 的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。 3.组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线 粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并 分离，而细胞色素P450、内质网碎片及 其他可溶性酶素则保留在上清中。
4.取上清在更快速的100,000g离心旋转之 下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状， 而可溶性酶素则保留在上清中，将沉淀重 悬即可得到微粒体。因此微粒体在细胞生 物学中定义为从内质网的碎片所得到的小 型囊泡。 5.微粒体含有细胞色素P450，由于P450中的 辅助因子、血基质含有铁元素，微粒体常 呈现红褐色。
三、实验步骤 1. 处死小鼠； 2. 快速摘除肝脏，自门静脉注入预冷的冰生理盐水 20-50ml，冲洗肝脏至土黄色，再用生理盐水将 肝脏外周血水冲洗干净，用滤纸擦干净后称重、 记录。 3. 将称重后的肝组织置于烧杯中（置冰板上）剪碎 ，转入匀浆管中，并按每克肝组织加1～2ml预冷 的蔗糖-Tris-盐缓冲液，用电动匀浆机制备匀浆 （转速1000rpm）（冰浴中）,研杵上下移动8－ 10次，定容至5ml。 4. 将匀浆液离心（4℃，1000g，10min）
实验五 肝微粒体制备及相关酶活性测定
肝脏损伤的检测与评价
评价化学毒物引起肝损害的方法有两大类： 1. 体内实验（test）
1. 体内试验 方法是将肝毒物给予受试动物，然后 处死动物或在动物存活的情况下进行各种 生物检测，如动物染毒后的血清酶学分析、 肝脏排泄与分泌功能测定、肝脏化学组成 分析以及肝脏损害的组织病理学检查等。
2. 体外试验 是指采用某种实验技术从动物机体分 离出肝脏或肝细胞的亚细胞结构，让其在 体外与肝毒物接触一定时间，然后进行各 种检测，如动物的离体肝灌流试验、肝细 胞原代培养与肝细胞毒性试验、肝匀浆毒 物代谢试验等。
体外肝代谢系统
体外肝代谢系统【摘要】肝药酶在药物代谢中具有十分重要的作用。
对肝药酶的研究方法中，以动物肝脏或肝细胞为基础，构建体外肝代谢系统是体外代谢研究中最重要的环节之一。
对体外肝代谢的研究，主要是利用肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞培养、肝组织切片及离体肝灌流系统等方法。
本文综述近年国内外所应用的不同体外肝代谢系统，并对各体外代谢研究方法进行比较，指出根据各系统的特性、不同的实验要求和目的，选择适当的研究方法的重要性。
【关键词】细胞色素P450酶；肝微粒体；肝细胞培养；肝组织切片；离体肝灌流药物代谢一般是指药物的生物转化。
药物经生物转化后，可引起药物的药理活性或∕和毒理活性的改变。
因此，研究药物的生物转化，明确其代谢过程，对新药开发、新剂型设计及制定合理的临床用药方案等方面都具有重要的指导意义。
肝脏是药物生物转化的重要器官，含有参与药物代谢重要的酶系组成，主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族［1］。
本文所介绍的各种体外代谢系统均含有一种或多种CYP450酶的同工酶，为研究药物体外代谢提供了研究的对象和基础。
动物肝体外代谢研究可以较好地排除体内因素干扰，直接观察酶对底物代谢的选择性，为整体试验提供可靠的科学依据。
以肝脏为基础的体外代谢系统主要包括肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞、肝组织切片及离体肝灌流。
1肝微粒体肝微粒体的制备多数采用差速离心法［2］，通过高速离心使微粒体与其他成分分离，操作简单，无需其他试剂辅助。
但较耗时，设备要求高，使该法的普及和深入研究受到一定的限制。
针对这些情况，可采用试剂辅助分离的方法［3］，在离心前额外加入一定比例的PEG6000或CaCl2，促进微粒体沉降。
此法对设备要求降低，并缩短了实验周期。
肝微粒体的制备过程均应在4℃下进行。
正确、合理地选择缓冲液，能起到良好介质的作用，按比例加入后进行肝组织的破碎和匀浆，才可有效分离肝微粒体和避免细胞器受损。
肝微粒体的主要应用测定CYP450酶活性测定原理是在特定酶催化下，底物在辅助因子以及适合的温度、时间作用下反应，借助仪器测定生成的特定产物量。
超高效液相色谱-高分辨质谱法检测合成大麻素JWH-073在人肝微粒体中的Ⅰ相代谢产物
超高效液相色谱-高分辨质谱法检测合成大麻素JWH-073在人肝微粒体中的Ⅰ相代谢产物李超;王继芬;徐多麒;王燕燕【摘要】应用超高效液相色谱-高分辨质谱法检测合成大麻素JWH-073在人肝微粒体中的Ⅰ相代谢产物,用肝微粒体体外温孵法制备了加入JWH-073的人肝微粒体,从中了解JWH-073在人体内的代谢过程.JWH-073在人肝微粒体中共产生11种Ⅰ相代谢产物,其代谢途径为羟基化、羧基化、脱烷基化和羰基化,其中羟基化为主要途径,羟基化代谢产物有6种.根据代谢方式、代谢发生的位点及代谢产物的响应强度,推荐羟基化代谢产物(编号M4)作为JWH-073在人体尿液中的中毒标记物.在实际工作中仍需要收集人体尿液样品,通过筛查对比其中的主要代谢产物,最终确认JWH-073的代谢标记物.【期刊名称】《理化检验-化学分册》【年(卷),期】2019(055)008【总页数】7页(P869-875)【关键词】超高效液相色谱-高分辨质谱法;Ⅰ相代谢产物;合成大麻素JWH-073;人肝微粒体【作者】李超;王继芬;徐多麒;王燕燕【作者单位】中国人民公安大学刑事科学技术学院,北京 100038;中国人民公安大学刑事科学技术学院,北京 100038;中国政法大学,北京 100088;北京市公安局司法鉴定中心法庭毒物分析公安部重点实验室,北京 100192【正文语种】中文【中图分类】O657.63合成大麻素［1－2］类新型毒品是我国首批管控的新精神活性物质，也是近几年在我国最常出现的非法制造、贩卖及滥用的一类新型毒品［3－4］。
目前报道的合成大麻素已达251种（占已知新精神活性物质的31．2%），我国已管制53种。
其中JWH－073是我国最早列管的5种合成大麻素中的1种［5］，JWH－073化学名称为1－丁基－3－（1－萘甲酰基）吲哚，分子式为 C23H21NO，属于第一代合成大麻素［6－7］，结构式见图1。
图1 JWH－073的分子结构式Fig．1 Molecular structural formula of JWH－073合成大麻素进入人体后半衰期较短，代谢较快，尿液中几乎无原药［8］。
肝微粒体的制备
肝微粒体的制备2篇肝微粒体的制备（一）肝微粒体（hepatocyte mitochondria）是存在于肝细胞内的细胞器，其主要功能是参与能量代谢和细胞呼吸。
肝微粒体的制备主要通过离心分离的方法实现。
首先，需要准备一定数量的新鲜肝组织，可以选择小鼠或大鼠的肝脏作为材料。
肝脏应在动物安乐死后立即取出，并放入生理盐水中进行冲洗，以去除任何附着在表面的血液。
然后将肝脏切割成小块，并用冰冷的缓冲液洗涤，以进一步清除血液。
接下来，使用钝性杆或刀片将肝组织切成更小的块。
这样做的目的是增加细胞器的表面积，以便更好地制备微粒体。
然后，将这些组织块置于含有细胞质破碎缓冲液（常用的缓冲液为MES缓冲液）的离心管中，经过适当的研磨和振荡，使细胞质破碎，释放出细胞器。
接下来，将细胞质悬液用离心机进行离心分离。
首先进行低速离心，以去除细胞核和细胞碎片，得到一个大部分富含肝微粒体的上清液。
然后，将上清液继续进行高速离心，将肝微粒体沉淀。
离心结束后，将上清液倒掉，得到肝微粒体的沉淀。
最后，可以用适当的缓冲液洗涤肝微粒体沉淀，以去除杂质。
洗涤后，将肝微粒体沉淀进行储存或进一步使用。
制备好的肝微粒体可以用于细胞呼吸和能量代谢的研究。
肝微粒体的制备（二）肝微粒体（hepatocyte mitochondria）的制备是一项重要的技术，常用于研究肝细胞能量代谢和细胞呼吸等领域。
下面介绍一种常用的肝微粒体制备方法。
首先，准备新鲜的肝组织，可以选择小鼠或大鼠的肝脏作为材料。
肝脏取出后立即放入冰冷的生理盐水中冲洗，以去除附着在表面的血液。
然后将肝脏切割成小块，并加入冰冷的细胞质破碎缓冲液（如MES 缓冲液）中。
接下来，使用均质器或超声处理器对肝组织进行细胞质破碎。
通过适当的处理时间和功率，使细胞质完全破碎释放出肝微粒体。
破碎后的细胞质悬液可以通过低速离心去除细胞核和细胞碎片。
然后，将去除细胞核和细胞碎片的细胞质上清液继续进行高速离心，以沉淀肝微粒体。
双峰驼肝微粒体的制备及 CYP1A 酶活性检测
双峰驼肝微粒体的制备及 CYP1A 酶活性检测何兴瀚;张文彬;哈斯苏荣【摘要】为研究双峰驼细胞色素氧化酶1A（CYP1A）的体外活性，首先采用差速离心法制备双峰驼肝微粒体，并用 BCA 法测定其蛋白浓度；然后采用 CO 还原差示光谱法分别测定 CYP 总酶含量和细胞色素 b5含量；最后通过 CYP1A 酶对7-乙氧基香豆素的脱羟基作用评价其体外活性。
结果表明，所制备的双峰驼肝微粒体悬液蛋白浓度为1．652 mg／g±0．341 mg／g，CYP 总酶含量为0．08 nmol／mg±0．014 nmol／mg，细胞色素 b5（Cybts）含量为0．113 nmol／mg±0．036 nmol／mg，且 CYP1A 酶具有降解其特异性底物-7-乙氧基香豆素的活性。
说明所制备的双峰驼肝微粒体悬液蛋白浓度、CYP 总酶和 Cytb5含量以及 CYP1A 酶活性等基本参数均能满足后续的双峰驼 CYP1A 酶体外活性研究基本要求。
%To establish a reliable hepatic microsomal platform for studying the activities of Bactrian camel CYP1A enzyme in vitro ,the Bactrian camel hepatic microsomes were prepared by using differential centrif-ugation,and the protein concentration was determined by BCA method;and then the content of total CYP enzyme and cytochrome b5 were detected by differential spectroscopy;finally the activity of CYP1A en-zyme was evaluated by 7-ethoxycoumarin dehydrogenases.The results showed that the prepared suspension of Bactrian camel hepatic microsomal protein concentration was 1.652 mg/g±0.341 mg/g,total CYP en-zyme content was 0.08 nmol/m±0.014 nmol/mg,cytochrome b5 (Cybts)content was 0.113 nmol/mg±0. 036 nmol/mg,and the CYP1A enzyme can degrade the substrate specificity which is 7-ethoxycoumarin.Therefore,the basic parameters of hepatic microsomal protein,total CYP enzyme and Cytb5 content and CYP1A enzyme activity can meet all of requirements for follow-up study on Bactrian camel CYP1A enzyme activities in vitro .【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】4页(P41-44)【关键词】双峰驼;肝微粒体的制备;评价;CYP1A【作者】何兴瀚;张文彬;哈斯苏荣【作者单位】内蒙古农业大学兽医学院，农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古阿拉善骆驼科学研究所，内蒙古巴彦浩特 750300;内蒙古农业大学兽医学院，农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018; 内蒙古骆驼研究院，内蒙古巴丹吉林镇 750300【正文语种】中文【中图分类】S852.21双峰驼由于长期生活在干旱的半荒漠草原地区，因此具有极强耐受性，能够耐高温、耐饥渴、耐盐碱，对恶劣环境的适应性和抗病力很强。
大鼠肝微粒体细胞色素P450 酶活性研究方法概括
大鼠肝微粒体细胞色素P450 酶活性研究方法概括发表时间：2012-10-10T15:23:31.560Z 来源：《医药前沿》2012年第11期供稿作者：陈焕文[导读] 综述大鼠肝微粒体中细胞色素C Y P450 活性研究方法。
陈焕文（上海市普陀区中心医院药剂科 201203）【摘要】目的：综述大鼠肝微粒体中细胞色素C Y P450 活性研究方法。
方法：查阅国内外文献，对肝微粒体C Y P450 进行介绍，并总结和归纳中药在C Y P450酶活性研究方法的应用。
结果：CYP450 研究方法主要包括体外实验：CO 吹泡法，化学显色法，体外温孵和体内cocktail 探针实验。
该方法的应用从中药单体成分逐渐发展到中药提取物、中药复方。
结论：随着科研水平的提高，体外方法对CYP450 研究越来越深入，合体内cocktail 探针法，提高药物体内代谢清除预测的准确性。
【关键词】中药 P450 酶肝微粒体温孵 cocktail探针中药，具多成分的特点, 每一味中药均含有大量的化学成分，在中医药理论指导下，遵循整体辩证论治的原则进行研究及治疗。
近十几年来，中药在细胞色素P450 方面的应用越来越广泛和深入，不仅仅局限于单体对P450 酶活性的影响，后还有单味药作为研究对象，发展到现在，中药复方对P450 酶的研究越来越受到海内外学者的关注。
体现了中药不仅局限于传统的应用技术上，还不断的融合于新技术、新思维、及新的领域，为更进一步的了解中药多成分，多靶点，多效应的理论基础开创新的依据。
一、细胞色素P450酶的简介细胞色素P450 酶是肝微粒体混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性和内源性的物质代谢中起着极其重要的作用，并引起自身或其他药动学的改变，使得药效增强或减弱，而导致药物中毒或无效，药物- 药物相互作用的结果，药物对P450 酶系活性的影响是药物代谢相互作用最重要的机制。
药物代谢酶分Ⅰ相和Ⅱ相, 细胞色素P450 酶( 以下简称CYP450 或P450) 是Ⅰ相催化多种药物、前毒物、前致癌物等外源性物质的氧化和还原代谢的主要酶类，细胞色素P450 是由多种同功酶组成的超大“家族”, 与外源性化合物代谢作用有关的约30 多种,主要由CYP1、CYP2 和CYP3 三个族组成, 其中CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6，CYP2E1 和CYP3A4 是最主要的6 种亚型, 含量约占肝内C Y P450 酶总量的80% 以上, 且90% 以上的上市药物是由这6 种亚型代谢的[1-3]。
第六章--致突变作用及其评价
国际环境致突变物致癌物防护委员会 〔ICPEMC〕于1979年曾把致突试验按其观察的 遗传学终点分为四类：
〔1〕基因突变； 〔2〕染色体畸变； 〔3〕不别离； 〔4〕原发性DNA损伤。
1983年重新提出将致突变试验所反响的遗传学终点 分为5类：
〔1〕DNA完整性的改变〔形成加合物断裂、交 联〕；
〔2〕 DNA重排或交换；
1. 试验动物：多用雄性大鼠或小鼠进行。
2. 动物接触被检物的时间：可为一次、5～7天或3个月。 其中3个月者效果较好。然后将雄性与雌性动物按1：2比例 交配，雌性动物不接触化学受试物。小鼠连续交配6周，大 鼠8周，每周更换一批雌鼠。
3. 观察指标
雌鼠受孕后12～13天剖腹取出子宫，检查并记录活胎 数、早期死亡胎数、晚期死亡胎数，并计算总着床数〔可 按早期与晚期死亡胎数和活胎数计算〕以及每只受孕动物 平均着床数。
3 姊妹染色单体交换〔sister chromatid exchange，SCE〕 试验
遗传学终点：①染色体完整性改变②DNA重 排或交换
4 显性致死突变试验〔dominant lethal mutation test〕
遗传学终原理点：：通染过色哺体乳完动物整生性殖改细变胞染色体畸变进行的致
突变作用试验。哺乳动物生殖细胞染色体发生突变时，往 往不能与异性生殖细胞正常结合，易出现受精卵在着床前 死亡和胚胎早期死亡。显性致突变的机理可能是生殖细胞 染色体的断裂和易位。
观察对象：嗜多染红细胞〔PEC〕中的微核发生率， PEC是红细胞成熟发育过程中的一个阶段，此时红
细胞主核已经排出，因细胞质内含有核糖体，Giemsa染色 后呈兰灰色，便于与成熟红细胞鉴别〔成熟红细胞Giemsa 染色后呈桔红色〕，微核与细胞核一致，呈紫红色或紫兰 色。
探针药物法评价苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP3A4的体外抑制作用
探针药物法评价苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP3A4的体外抑制作用郑造乾;骆瑾瑜;陈燕华;王小军【摘要】Objective To investigate the in vitro inhibition of kudiezi injection (KDZi) on liver microsomal CYP3A4 in rats and the potential herb-drug interaction with drugs metabolized by CYP3A4 enzyme in clinical ap-plication. Methods The test groups included a negative control group, an inhibitor positive control group and a KDZi group. After incubating the rat liver microsomes with testosterone, a probe substrate, the reduction of testos-terone were quantitated with HPLC, and IC50 values were calculated to assess the inhibitory effect of KDZi on rat CYP3A4 enzyme. Ketoconazole was used as a positive control. Results In mixture metabolic system of liver mi-crosome enzymes, the most suitable incubationconc entration of testosterone was 100μmol/L, incubation time was 40 min and concentration of microsome protein was 0.5mg/mL, when the concentration of Tris-HCl buffer was 0.1mol/L (pH7.4) at 37℃. The results showed that the IC50 value of positive inhibitors of CYP3A4 was0.0707μmol/L, which indicated that the incubation system satisfied the demands of CYP3A4 enzyme inhibition activity evaluation. The relative inhibitory rate of CYP3A4 in 9 serial volume concentration of KDZi (0,0.01%, 0.10%, 0.20%, 0.50%, 1.00%, 2.00%, 5.00%, 10.00%) were 0, 2.94%, 16.44%, 22.70%, 31.44%, 37.47%, 46.37%, 51.74%, and 60.40%, respectively. The IC50 value of KDZi on CYP3A4 inhibition was 3.46%, which wasexceeded their daily-dose concentration. Conclusion In ordinary condition, no significant interaction between KDZi and CYP3A4 is de-tected in vitro, which indicates that KDZi might be used with CYP3A4 enzyme substrates.%目的：观察苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP3A4的体外抑制作用与CYP3A4酶底物合用药时可能产生的相互作用。
IVIVE (in vitro to in vivo extrapolation,体外-体内外推法)
在药物临床开发前，准确的预测人体的肝清除率十分重要且较难。
IVIVE是一种较常见的方法，即根据肝微粒体或肝细胞测得体外固有清除率CLint，再引入MPPGL HPGL liver weight body weight hepatic blood flow等scaling factors，通常采用well-stirred模型计算得到体内肝清除率CLH。
IVIVE法经常出现低估的误差，其中会受到很多因素的影响，如肝脏来源、肝细胞或微粒体的处理方法、蛋白结合、忽略肝外代谢等因素。
详细计算方法和参数推荐值见下文。
目前IVIVE法突出的问题包括两个：1、采用肝微粒体还是肝细胞的代谢稳定性数据进行计算；2、经常出现低估现象，如何校正外推值使其更接近实测值。
肝微粒体易制备、保存的特点，为IVIVE的最常用方法。
理论上而言，肝细胞相比较于肝微粒体更适合IVIVE，因为肝细胞含有肝脏转运体和更多的代谢酶，更接近体内生理条件。
但研究表明，在转运体无显著的主动摄取的前提下，对于CYP3A4的底物而言，肝微粒体的预测值比肝细胞更准确。
对于CYP3A4的底物，肝微粒体的CLint测定值常高于肝细胞；而对于CYP2C的底物两者无明显差别；对于UGT的底物，低清除率条件下，两者接近，随着清除率增加，肝细胞值较高。
对于该现象，猜测可能是由于transporter-enzyme的相互作用仅存在于肝细胞中，CYP3A4和P-gp有着相似的底物特异性，认为药物在进入肝细胞或者肠上皮细胞将要被代谢时，P-gp将其外排避免代谢，由此导致CYP3A4的底物肝细胞CLint偏低。
Lam and benet发现elacridar(P-gp抑制剂)在微粒体中对地高辛的代谢无影响，但是在肝细胞中增加了其代谢。
此外，CLint的大小与预测的准确性也有一定的关联。
高清除率的化合物，当其为CYP2D6的底物时，microsomes与hepatocytesd的差别不显著；为CYP3A4的底物时差异被放大。
基于肝药代谢酶的附子配伍芍药减毒机制研究
基于肝药代谢酶的附子配伍芍药减毒机制研究郭艳丽;鞠爱霞;孙爽;李秋红【摘要】目的:通过建立“Cocktail\"探针药物法及体外肝微粒体孵育体系,测定大鼠肝微粒体中CYP1A2和CYP3A4酶的活性,并从蛋白和转录水平阐释附子芍药配伍对CYP450酶基因表达的影响.方法:采用“Cocktail\"探针药物法,建立同时测定CYP1A2和CYP3A4酶两种探针底物的体外肝微粒体孵育体系;采用RP-HPLC法测定两种探针底物在大鼠肝微粒体孵育体系中的浓度;CO还原差示光谱法测定大鼠肝微粒体中CYP450酶含量;RT-PCR技术测定大鼠肝脏CYP1A2和CYP3A4酶基因mRNA表达量.结果:与空白组比较,芍药组CYP1A2酶活性有显著性差异(P＜0.05),芍药组CYP1A2酶mRNA表达量升高,有极显著差异(P＜0.01);附子芍药组对CYP1A2酶有诱导作用,有极显著差异(P＜0.01),附子芍药组CYP1A2酶mRNA 表达量升高,有显著性差异(P＜0.05).结论:附子配伍芍药能够诱导CYP1A2酶活性,增加CYP1A2酶基因mRNA表达量,加快附子毒性成分的代谢过程,进而达到附子的减毒作用.【期刊名称】《化学工程师》【年(卷),期】2019(000)006【总页数】6页(P83-88)【关键词】附子;芍药;CYP450酶;配伍减毒【作者】郭艳丽;鞠爱霞;孙爽;李秋红【作者单位】黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】R285附子被誉为“回阳救逆第一要药”，《本草汇言》中指出，附子具有回阳救逆、温肾助阳、止痛的作用，多用于心腹冷痛、亡阳虚脱、肢冷脉微、宫冷、阳萎等疾病的治疗[1,2]，临床应用十分广泛。
附子的主要成分是乌头类生物碱，其中双酯型乌头碱、次乌头碱等既是其有效成分，也是其毒性成分[3,4]。
药物代谢研究方法
主要的药物代谢研究方法有：1.肝脏代谢的研究方法肝脏代谢的研究方法中有肝微粒体温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏灌流技术、肝组织切片法、基因重组P450酶系、微透析技术等。
⑴肝微粒体温孵法--肝微粒体法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，一般采用差速离心法获得肝微粒体。
此法制备简单，代谢时间短，易于重现，方便大量操作以积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而应用较为普及。
⑵肝细胞体外温孵法--本法同肝微粒体法相似，即以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应，适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性，在评估药物代谢过程中药物间的相互作用时，该方法得到广泛的应用。
⑶肝脏灌流技术--该技术使肝脏具有独立并接近于生理条件的循环体系，在严格控制的条件下，药物与灌流肝脏接触，然后通过肝静脉液与门静脉液分析、肝脏生化指标的测定以及肝脏纵切片检查，以确定药物在肝脏发生的变化以及对肝脏的效应。
肝脏灌流技术大体上可分为3大类：离体肝灌流、在体肝灌流及在体肠-肝灌流技术，又同时分为：循环型和一过型。
⑷肝组织切片法--肝组织切片法不破坏肝脏的细胞构成和组织结构，不仅完整保留了所有肝药酶及各种细胞器的活性，而且保留了细胞与细胞间的联系及一定的细胞间质，因而更能反映药物在体内生理条件下的实际代谢情况，代谢活性可保持8~24h，但因为组织切片机的价格昂贵，所以应用受到限制。
⑸基因重组P450酶系--基因重组P450酶系具备分子生物学技术优势，因而具有分子水平的特点，较其他的体外肝代谢方法更能具体量化的研究药物代谢，在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法，并可为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息。
⑹微透析技术--微透析技术是一种在体取样技术，可连续跟踪体内多种化合物随时间的变化；取样无需匀浆过程，可真实代表取样位点化合物的浓度，且样品因不含蛋白质、酶等大分子物质，可不经预处理直接用于测定；用于研究药物代谢，可维持实际生理条件，消除了传统药物代谢研究中因组织均匀化破坏细胞隔室造成对代谢研究结果的影响，并可获得有关药物代谢中间过程的信息，而传统方法只能了解代谢的最终产物，不能反映其中间过程。
半夏厚朴汤及君臣配伍对小鼠肝脏CYP450和肾脏离子转运子的影响
V ol 36, Issue 1 January, 2011
药理
半夏厚朴汤及君臣配伍对小鼠肝脏 CYP450 和肾脏离子转运子的影响
王抚梦, 卢燕, 孔令东*
(南京大学 医药生物技术国家重点实验室, 江苏 南京 210093)
[ 摘要 ] 目的: 研究半夏厚朴汤中君药半夏、臣药厚朴、君臣药对以及全方对小鼠体内肝脏微粒体 CYP450亚型和肾脏离 子转运子的影响, 以期从肝脏代谢和肾脏排泄能力 的角度, 评价 半夏厚 朴汤的 配伍意 义及合理 性。方法: 将小 鼠随机 分为半 夏组、厚朴组、半夏厚朴 配伍药对 组、复 方的原方剂 量组和高 剂量组, 分别给予 水提取物。采 用常规生 化、RT PCR 和 W estern b lo tting等检测方法, 分别测定各组动物肝脏微粒体 Cyp2e1和 Cyp3a11亚 型的活 性及其 mRNA 和 蛋白表 达, 以 及肾脏 有机阴 离子转运子 OAT 1和 OAT3、有机阳离子转运子 OCT 1和 OCT 2的 mRNA 和蛋白表达。结果: 君药半夏增加了 小鼠肝脏 Cyp2e1 和 Cyp3a11活性和表达。半夏和厚朴均可提高肾脏 OAT 1 /3, OCT1 /2 mRNA 和蛋白表达。半夏厚朴药对及复方 则使之恢复至 正常, 复方的协同作用优于君臣配伍药对, 且原方剂量组 的作用 强于高 剂量组。结 论: 半夏厚 朴配伍 及复方协 同改善 了半夏 对肝脏 Cyp2e1活性和表 达的激活作用, 避免了肝脏 过氧化 和中毒 等损伤以 达到减 毒目的; 同 时它们 逆转了单 味半夏 对肝脏 Cyp3a11活 性与表达的增加, 弥补药 物在 肝脏 代谢 太快 的不 足。并平 衡君 药半 夏、臣 药厚 朴单 独使 用所 引起 肾脏 OAT1 /3, OCT1 /2 mRNA 或蛋白的表达增加以达到增效目的。为 半夏厚朴 汤增效 减毒的 组方合 理性及 临床半 夏厚朴君 臣配伍 发挥相 须相使的疗效提供了 重要的药理学依据。
肝微粒体的提取及其含量测定
人肝微粒体的提取及其含量测定第一部分：人肝微粒体的提取一、仪器及试剂：仪器：内切式匀浆机，高速离心机，超速离心机，表面皿数个，冰袋数个，碎冰，装碎冰烧杯，匀浆用玻璃管，不锈钢剪刀试剂：含0.15M KCl的100mM磷酸钾缓冲液（PH＝7.4）,100mM磷酸钾缓冲液材料：8号人肝（称取重量29.95g）二、实验流程：组织（记录死亡时间、储运条件）37度水浴解冻含0.15 M KCl 的100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）漂洗，除去表面血迹及组织液（缓冲液事先已置于冰箱中冷藏）将组织置于下垫冰块的表面皿中，用剪刀手动剪碎内切式均浆机匀浆（过程中注意将组织置于冰块包围住，保持低温环境）9000 ×g离心20 min，取上清，即得S9超速离心机105,000 ×g 超速离心60 min取沉淀（过程中防止上清表面的油膜粘附到沉淀表面，应用吸管将油膜慢慢吸出，而不能倾倒）重悬于100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中（重悬过程中应注意不要产生气泡）105,000 ×g 超速离心60 min取沉淀，用100mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）重悬得微粒体（此次重悬时应使用尽量少的缓冲盐体积，以防止微粒体浓度被过于稀释，重悬过程同样注意油膜与气泡）磷酸盐缓冲液中，分装塑料小管中，-80°C贮存三、实验结果：一共称取8号人肝组织29.95g，提取出肝微粒体23mL，经蛋白含量测定，微粒体二次重悬液蛋白含量以牛血清白蛋白计为37.4mg/mL，加入100mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4）稀释至86mL，得10mg/mL的微粒体储备液，分装保存于-80度待用。
第二部分微粒体中蛋白含量测定一、仪器和材料：0.1 N NaOH(2g NaOH溶于500mL水), 1%酒石酸钾（1.342g四水合酒石酸钾溶于100mL 水），2 %无水碳酸钠（溶剂为0.1 N NaOH），0.5 %硫酸酮（溶剂为1%酒石酸钾），甲液（2 %无水碳酸钠50 ml，加0.5 %硫酸酮1 ml，混匀，临用时现配），牛血清蛋白标准液500 μg / ml(溶剂为0.1 N NaOH)Folin酚(福林试剂)试剂：1份Folin酚原液用蒸馏水稀释3倍得工作液，Folin酚试剂原液配制方法如下：1000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 50 g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 12.5 g蒸馏水350 mL85%磷酸25 mL浓盐酸50 mL文火回流10h。
肝微粒体代谢
肝微粒体代谢肝微粒体代谢是指在肝细胞内的微粒体内进行的代谢活动。
微粒体是一种细胞内的膜包被结构，是肝细胞中重要的代谢活动场所，具有氧化、解毒、合成、分解等多种代谢酶。
本文将从微粒体的结构与功能，细胞色素P450系统、柠檬酸循环等方面对肝微粒体的代谢进行详细介绍。
一、微粒体的结构与功能微粒体是一个直径约0.2~1μm的球形膜包被，由内部核心区域和外部透明区域两部分组成。
核心区域内含有许多含有酶活性的颗粒，称为微半滤泡，是微粒体的重要机能部位。
微半滤泡内含有氧化酶、脱氢酶、羧化酶等多种代谢酶，可以进行多种代谢反应，使微粒体成为肝细胞中重要的代谢活动场所。
透明区域内除了蛋白质外，还含有磷脂、胆固醇和三酰甘油等物质。
微粒体主要有以下3个功能：1. 氧化功能：微粒体内含有多种氧化酶和其他辅助酶，可以将一些有机物质氧化为产生能量或生成活性物质，如柠檬酸循环中的α-酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸酸激酶、甘油酸磷酸酰转移酶等。
2. 解毒功能：微粒体内含有许多解毒酶，如γ-谷氨酰转移酶、酰转移酶、羟醛脱氢酶、过氧化氢酶和催化酶等，可以将入侵机体的毒素和代谢产物脱除或转化成水溶性物质，有利于排泄出体外。
3. 合成与分解功能：微粒体内含有许多酶，可以合成各种胆固醇、激素、脂肪酸等物质，并降解体内各种废弃物质，如脂肪酸代谢产物、血红蛋白等。
二、细胞色素P450系统细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）是微粒体内最重要的催化酶之一，是许多生物合成和降解反应的关键酶系统。
细胞色素P450酶目前已发现有很多种，分布于不同的组织和细胞。
其中的一部分是肝细胞内的酶，被称为肝微粒体细胞色素P450酶系统。
该系统被认为是微粒体最重要的代谢系统之一，参与了人体内许多生物活性物质的合成和代谢。
1. CYP酶的特点CYP酶是一类蛋白质催化酶，分子量约50 kDa，含有一个有着630~700 nm吸收峰的铁血红素分子，这就是著名的色素P450。
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肝微粒体制备
1. 简介
肝微粒体（mitochondria）是细胞中的一种细胞器，主要负责细胞内能量的产生和调节。
肝微粒体制备是一种常用的实验技术，用于研究肝脏中微粒体的结构和功能。
本文将介绍肝微粒体制备的步骤和相关实验方法。
2. 肝微粒体制备步骤
2.1 器材准备
•洗涤缓冲液：含有0.25 M 蔗糖、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA 和0.1% BSA的缓冲液。
•离心管：用于离心过程。
•显微镜滑片：用于观察制备得到的肝微粒体。
2.2 肝脏取材
•将新鲜动物（如小鼠）的肝脏取出，并放入冰冻盒中保持低温。
•快速切碎肝脏组织，以避免氧化酶的活性降低。
2.3 组织匀浆
•将切碎后的肝脏组织加入洗涤缓冲液中。
•使用均质机将组织匀浆，以破碎细胞膜和释放肝微粒体。
2.4 离心分离
•将匀浆后的混合液离心10分钟，以去除未破碎的细胞碎片和细胞核。
•将上清液转移到新的离心管中，并进行第二次离心，以沉淀肝微粒体。
2.5 肝微粒体收集
•将离心得到的沉淀用洗涤缓冲液悬浮。
•用洗涤缓冲液洗涤肝微粒体，以去除杂质。
•最后一次离心后，将上清液倒掉，保留沉淀中的肝微粒体。
3. 肝微粒体制备相关实验方法
3.1 蛋白含量测定
•使用Bradford方法或BCA方法测定制备得到的肝微粒体中蛋白质的含量。
•根据实验需要调整蛋白质的浓度。
3.2 肝微粒体功能检测
•使用荧光探针（如JC-1）检测肝微粒体的膜电位。
•使用呼吸链底物（如琥珀酸、NADH）测定肝微粒体的呼吸功能。
3.3 肝微粒体结构观察
•使用透射电子显微镜观察制备得到的肝微粒体的形态和结构。
•准备样品时要注意避免溶剂残留和样品的干燥。
4. 结论
肝微粒体制备是一种重要的实验技术，用于研究肝脏中微粒体的结构和功能。
通过合理的步骤和实验方法，可以成功制备得到高质量的肝微粒体，并进一步开展相关实验研究。
了解肝微粒体的制备过程对于深入理解细胞内能量代谢和调节机制具有重要意义。
参考文献
[1] Palmeira CM, Rolo AP. Mitochondrially-mediated toxicity of bile acids. Toxicology. 2004;203(1-3):1-15.
[2] Zhang Q, Raoof M, Chen Y, et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 2010;464(7285):104-107.
[3] Koopman WJH, Nijtmans LGJ, Dieteren CEJ, et al. Mammalian mitochondrial complex I: biogenesis, regulation, and reactive oxygen species generation. Antioxid Redox Signal. 2010;12(12):1431-1470.。