不同基因表达载体的优缺点 孟凡顺

不同基因表达达载体的优缺点

理化系生物技术班孟凡顺

进入21世纪以来，基因工程的发展越来越快，也越来越完整，作为新世纪生物科学前沿，基因工程的快速发展也大大的刺激了人们对科学知识的向往，走进基因工程，我们发现在基因工程的四大步骤，目的基因的获取，基因表达载体的构建，将基因表达载体打入受体细胞以及目的基因的监测与鉴定，这其中最重要的是也是最繁琐的莫过于第二步基因表达载体的构建，而在基因表达载体的构建这一过程中，最重要的无疑就是目的基因导入受体细胞，将目的基因导入受体细胞的关键就是运载体的选择，在这里，我们要对运载体的种类进行介绍。

首先我们要知道什么东西可以作为运载体，作为运载体又有哪些特征？

首先，作为运载体的物质它必须可以进行自我复制，这样才可以在它与外源基因融合后，独立在宿主细胞中复制繁殖，其次有至少一个在融合外源基因后仍未被破坏的遗传表型，这便于将载体导入受体细胞后的识别与筛选，通常表现在为抗性与显色表型反应等，再次，载体上至少有一个限制性核酸内切酶的单一识别位点，这样方便了外源基因的插入，最后，要有适当的拷贝数，理论上在一定范围内，拷贝数量越多，越利于载体的制备，所有的基因工程中的表达载体都必须具有以上四个条件。

在这里，我介绍三种载体。

1质粒载体

质粒载体是基因工程中最常用的载体之一，它源于细菌，是一种源于染色体外却可以自由复制的小型环状DNA，大小在1~200Kb之间，质粒通常含有一些编码对细菌有利生存的基因也含有抗生素的抗性基因，经科学家多年的努力，人们终于对一些质粒的生物学特征有了一些了解，进行了比较详尽的研究，比如F质粒那F基因或性质粒，R质粒即抗性因子和col质粒即大肠杆菌因子。

其实，一个质粒就是一个复制子，复制子往往有宿主专一性，但奇怪的是，人们也发现了可以在两种不同宿主内复制的复制子，即可构建的穿梭载体，这种新型载体的发现，大大的推进了克隆

技术的发展，因为这种载体可以运载基因，在两种不同的生物之间穿梭，这大大得简化了克隆的步骤。

质粒分转移型与非转移型，也分高拷贝型和低拷贝型。

转移型质粒是指质粒有一个流动特性，他可以通过接合作用从一个细胞转移到另一个细胞，而非转移型则不存在这样的特性，它想要完成以上过程，就必须依靠部分特定基因的相互作用，和转移型质粒的带动来完成。

在利用质粒载体来进行基因工程技术的操作时，先去天然质粒，然后对其进行修饰改造，那先去掉不必要的DNA区域。除保留质粒复制等必要部分外，尽量缩小质粒的相对分子质量，以提高外源基因片段的装载量然后质粒中限制性核酸内切酶的切点越多切割后形成的DNA片段也就越多，为外源基因的转移提供不便，再次我们在筛选重组质粒时，必须保留标记基因，在众多的标记基因中，最好的就是抗性基因，主要有四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，氨卡青霉素抗性基因，另外组织化学显色法和荧光法也同样是在基因检测时常用到的方法。再后质粒在安全性方面也要进行改造。要求质粒重组后不可以随便转移，避免造成基因污染，最后，因为启动子有强弱之分，所以我们需要对质粒改造或增加基因表达载体的调控序列。

在选取完质粒后，我们同同一种限制性核酸内切酶对目的基因和质粒切割，使他们的的粘性末端或平末端相同，然后在同DNA 连接酶对他们进行不准确对接，最后在对对接后的结果进行筛选，只筛选出重组质粒并进行后续操作。

2噬菌体载体

噬菌体是一种寄生细菌体内的一类病毒的总称，由遗传物质核酸和蛋白质外壳组成，内部核酸一般是双链性DNA分子，当然也有少量的其他形状的，如单链DNA等等，尾部结构多为20面体。说到噬菌体载体，我们必须先了解噬菌体的生命周期，噬菌体的生命周期分为溶酶体周期与溶源周期，因此噬菌体分为两类，第一类是烈性噬菌体，它只有融菌时期，他只对于自身的DNA与蛋白质复制与合成，所以不可用于质粒，而一部分双链DNA的噬菌体在具有感染性的同时，可以将自身的DNA整合到寄生细胞染色体DNA上成为了受体细胞的一部分组成部分，这一部分具有溶源过程温和噬菌体才可以用于作为质粒对DNA

的运输。

噬菌体是一种分子量为3.1×10＜dal的中等大小的温和噬菌体，该噬菌体的双链上有一部分非必要基因区域，所谓非必要基因就是被外源基因取代后并不会影响生命正常活动，所以我们可以有目的基因取代非必要基因，再将噬菌体导入受体细胞，并使其整合到受体细胞上，这样原受体细胞就可以与噬菌体形成一个新的基因这一过程中就是利用噬菌体可以侵染细胞的能力，而温和噬菌体又不具破坏作用。

3柯斯质粒

实际上，除了普通质粒载体，噬菌体载体外还有charon载体，DASH载体，mb噬菌体载体，puc18，puc19载体等等，这些载体都较常规的载体有了很大的进步，在这里我介绍一种新型的优秀载体----柯斯质粒。

常规的噬菌体的克隆DNA能力上极限是23kb，但在有些实验中还远远达不到理论极限要求，柯斯质粒的克隆能力最高可达45kb，而且也可以将柯斯质粒包装成具有感染性的噬菌体颗粒。柯斯质粒具有质粒复制子，可以在寄主细胞复制，并可以在氯霉素作用下扩增，另外柯斯质粒也含有抗菌素抗性基因，也可用来提供标记基因。

其实载体也有好几种特殊的用途。比如有些载体可以启动子探针，我们成为启动子探针，我们还有诱导性表达载体，组织特异性表达载体以及反义表达载体。

启动子探针载体是一种快速分离启动子的工具并且还很经济使用，启动子探针载体除了质粒载体上所具有的结构特性外还有检测部件，检测部件由失去启动子却含有标记基因的源基因与克隆位点组成。

诱导性表达载体的启动子在通常状态下不用启动，只有经过特殊条件下诱导才可以有转录活性或有比较高的转录活性的表达载体。我们可以利用诱导性启动子来人为地控制基因的表达，目前，二价金属离子诱导启动子，红光诱导启动子，诱导启动子和干旱诱导启动子等都是理想的诱导性表达载体的启动子，组织特异性表达载体的出现使人们在对抗一些疾病时，又多了一些筹码，由于一类特殊的调控基因只能在一定的组织中才可以有效的表达，所以人们研制出了组织特异性表达载体的构建，目前，人们以构