2020年病毒滴度测定.pdf
使用TCID50法测定病毒滴度
半数组织培养感染剂量法测定淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒优势分析连亨宁成都军区总医院呼吸内科，成都610083摘要：目的寻找简便的淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒LCMV病毒滴度测定方法。
方法采用半数组织培养感染剂量(TCID50)法检测LCMV病毒滴度，记录期间细胞形态变化。
结果实验后第5天获得与空斑实验一致的病毒滴度结果,但实验流程更为简单。
结论TCID50法测定LCMV病毒滴度相对于空斑实验更为简便。
关键词：半数组织感染剂量；空斑实验；淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒；病毒滴度中图分类号：Q939.47 文献标识码：AThe advantage of Lymphocytic Choriomeningitis Virus quantification by 50% Tissue culture infective doseLian Hengning（Department of Respiratory Medicine ，Chengdu Military General Hospital ，Chengdu 610083）Abstract：To determine a convenient method to quantify Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV) ,LCMV titer was measured by the 50% Tissue culture infective dose (TCID50) method . The result was got 5 days post-infection , similar with plaque assay ,but the protocol is easier than plaque assay .This experiment showd that TCID50 is more convenient than plaques assay .Key words:50% Tissue culture infective dose(TCID50);Plaques assay;Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV); Virus titer空斑实验是检测病毒滴度最为经典的方法[1]。
2020年病毒TCID50测定.pdf
病毒TCID50测定操作步骤(1) 准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。
每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。
细胞对照选取16个孔即可。
滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。
也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。
(2) 稀释待测病毒液。
A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。
A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。
向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。
B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。
首次滴定可以多稀释几个滴度。
根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl孵育液中。
若接种8个孔，则相应增加液体量。
上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。
【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。
2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。
2）此过程中需要使用加样器和tip头。
使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。
使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。
】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。
将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。
病毒滴度测定
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1． VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2． GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3． PFU（空斑形成单位）4． TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2． GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP 或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3． PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4． TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
病毒滴度测定
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3．PFU（空斑形成单位）4．TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
测定病毒滴度的方法
测定病毒滴度的方法Protocol:1) 转导前一天（第 1 天），胰酶消化细胞并计数细胞密度，按照合适的细胞密度接种到 6 孔板中，能使转染当天的融合度达到 30%-50%。
放置 37℃、 5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养。
例如：如果用HT1080细胞测定滴度，通常一个六孔版的孔接种 2×105 个细胞；2) 转导当天（第 2 天），融解病毒，准备 10 倍稀释系列样品，稀释倍数从 10-2到10-6。
对于每一个稀释样品，用完全培养液稀释病毒至总体积 1mL 。
避免漩涡震荡；3) 去除细胞中的培养液，加入已含有不同病毒量的完全培养液。
另外，保留一孔不添加病毒的细胞，作为空白对照组。
注：每孔加入的培养液的体积应为 1mL ；4) （可选）在含有病毒的培养液中加入聚凝胺，促进病毒感染细胞。
轻轻地摇晃培养板以混匀聚凝胺。
放置 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养；注：一般 polybrene 的储液浓度是 6mg/ml （用超纯水配制，－20 度储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果）。
工作浓度是 6ug/ml 。
5) 转染后一天（第 3 天），去除含有病毒的培养液，加入 2mL 新鲜的完全培养液。
放置 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱过夜培养；6) 转染后两天（第 4 天），去除培养液，加入含有适当浓度的嘌呤霉素的完全培养液以筛选稳定转导的细胞；7) 每 3 天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液；8) 筛选数天后，可以看到对照组没有活细胞，而添加过病毒的 1 个或者更多个的孔会出现药物抗性的克隆。
去除培养液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。
注：筛选所需天数应以对照组的所有细胞死亡为准；9) 先加入95%甲醇固定10min,再 加入结晶紫染色液（6 孔板每孔 1mL ）并放置室温孵育10 分钟；10) 去除染色液，用 PBS 洗涤细胞 2 次；11) 计数被染成蓝色的克隆数目，并计算病毒滴度。
重组腺病毒病毒滴度测定生长状态良...
图Ｉ－Ｉ．质粒ｐＡｄｔｒａｃｋ—ＣＭＶ和ｐＡｄＥａｓｙ一１Ｓ《ｍｌ｜捕＆Ｒ●ｇ帆ｈ明ｌｄ●胖Ｈｏｇ｝盯∞Ⅻｆ｝Ⅻ∞３．仪器细胞培养箱ＨｅｒａＣｅｌｌ德国Ｈｅａｒｅｕｓ公司倒置相差显微镜ＣＫＸ３１—１１ＰＨＰ日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司倒置荧光显微镜ＣＫＸ３１一ｌＩＰＨＰ日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司流式细胞仪Ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司微量移液器德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司滤器美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司垂直板凝胶电泳系统美国Ｂｉｏ．Ｐａｄ公司超低温冰箱ＴｈｅｒｍｏＦｏｒｍａ９８３美国Ｆｏｒｍａ台式高速冷冻离心机ｓｉｇｍａ３Ｋ３０美国Ｓｉｇｍａ／ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ核酸蛋白分析仪ＤＵＳ００美国Ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ图像分析仪ＩＢＡＳ２．０德国ＫＯＮＴＲＯＮ酶标仪ＥＬＸ８００美国Ｂｉｏｔｅｋ电泳凝胶成像系统ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ美国ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ雕计３５０５型英格兰ＪｅｎｗａｙＰＣＲ扩增仪ＧｅｎｅａｍｐＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００美国ＡｐｐｌｌｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＳＧ超滤型纯水机ＵｌｔｒａＣｌｅａｒＵＶｐｌｕｓ德国Ｈｅｒａｅｕｓ台式微量离心机Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ１８美国Ｂｅｃｋｍａｎ⑥．加入到Ｔ－２５培养瓶中，３ｍＬ完全培养液，轻轻摇动培养板，使混合物分布均匀。
⑦．４．６ｈ后，更换培养液。
⑧．培养７－ｌＯｄｏ通过荧光显微镜１．２天观察ＧＦＰ的表达。
１－３．３重组腺病毒扩增：ａ）转染７一１０天后的２９３细胞从培养瓶上刮下并转移到５０ｍＬ离心管中，１０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ，去掉上清将２９３重新悬浮在于２ｍＬ无菌ＰＢＳ中。
一２０℃／３７。
Ｃ冻融，然后剧烈的震荡，反复４次或更多。
不要让病毒上清液升温。
短暂的离心后储存在一２０℃。
ｂ）用３０５０％的上述每瓶病毒上清液再分别感染２９３细胞，ＣＰＥ或细胞裂解物在感染２—３天后能够观测。
ｃ）感染后３—５天，１／３—１／２的细胞分开，这时收集病毒液。
病毒滴度检测之慢病毒滴度检测试剂盒方案
病毒滴度检测之慢病毒滴度检测试剂盒方案病毒滴度即病毒的毒力，或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量（MLD）、最小感染量（MID）和半数致死量（LD50），其中以LD50最常用。
它是指在一定时间内能使半数试验动物致死的病毒量。
前面我们介绍过慢病毒包装，这里重点介绍一下病毒滴度，那么什么是慢病毒滴度？慢病毒滴度是用于评估转导一定数量靶细胞所需要的病毒数量，即每升溶液中含有的病毒数量。
转导单位(TU)即能够感染并整合到细胞内的病毒载体基因组。
病毒包装后的效力如何，如何定量，也是必须要检测的，专业术语称为：病毒滴度的测定。
下面我们就来聊下几种常见的慢病毒载体滴度的检测方法。
一、病毒滴度检测ELISA法p24蛋白是慢病毒外壳中含量最大的标志性蛋白。
p24 ELISA法测量病毒上清液中p24衣壳蛋白的量，然后将p24的含量水平与病毒滴度关联起来。
Cell Biolabs提供的基于慢病毒p24蛋白的ELISA分析分两种，一种称为传统的p24蛋白ELISA检测（Quantitation Kit (Traditional HIV p24 ELISA)），能检测所有p24蛋白，从而实现对病毒滴度的定量，可检测1 ng/mL HIV p24蛋白，最后分光光度计读取数据。
但是由于这种传统的p24 ELISA 法能检测所有p24蛋白，所以病毒滴度会偏高。
同时Cell Biolabs的新Lentivirus Titer Kit(Lentivirus-Associated HIV p24)能分离出包装细胞产生的游离p24蛋白，只检测病毒颗粒表面的p24，因此实验数据更真实准确，可检测1 ng /mL HIV p24蛋白，最后分光光度计读取数据。
1、传统的p24 ELISA法QuickTiter 慢病毒滴度检测试剂盒（p24蛋白ELISA检测）：慢病毒载体的HIV-1 p24核心蛋白的定量是一种确定慢病毒物理滴度的有效且广为人知的方法。
通过病毒外壳蛋白ELISA法测定慢病毒滴度
通过病毒外壳蛋白ELISA法测定慢病毒滴度简介根据ZeptoMetrix的p24试验，确定每毫升慢病毒的转导单位（TU/mL）。
通过使用来自Didier Trono的转换因子，将p24的浓度转换为病毒滴度来确定滴度计算方法。
每pgp24抗原中有大约1 x 104个慢病毒的物理微粒。
根据ELISA试验结果，每pg p24抗原中有100个转导单位（TU）。
材料•靶向选定基因的慢病毒•来自ZeptoMetrix的p24 ELISA•计算器或电子表格程序实验方案1. 稀释样品750到3000倍。
2. 使用p24 ELISA试剂盒，并按照制造商的说明进行操作。
3. 永远用空白对照使读版器“归零”。
4. 永远使用p24标准曲线进行校准。
5. 使用两种独立的稀释液用于制作标准曲线，包括五种浓度和浓度为0的p24。
6. 将标准曲线绘制成p24浓度比OD450。
7. 拟合标准曲线应依从R2> 0.95。
8. 确定斜率m和截距b。
（您也可以下载并使用附件中的电子校准表格。
）9. 根据以下公式计算稀释病毒的滴度TU/mL（您也可以下载并使用附件中的电子表格。
）注意事项下载附件中的电子表格（95 Kb）以计算TU/mL。
转换因子推导：a. （2×103个分子）×（每PP的24×103 Da p24）=（48×106）b. 48×106/Avogadro常数=（48×106）/（6×1023）= 8×10-17 g p24/PPc. 每1×10-16克p24约有1PPd. 每pg p24有1×104 PPe. 每1000PP有100TU。
病毒滴度的测定页PPT文档
(掌握)
血凝试验测定病毒滴度
血凝试验的基本原理(掌握) ➢红细胞凝集现象(血凝现象) ➢红细胞凝集抑制
(红细胞与抗体结合，失去血凝)
➢血凝滴度/血凝单位
干扰滴定测定病毒滴度
小结
主要介绍空斑形成单位法、50%终点法、血凝试 验和干扰滴定法测定病毒滴度的原理及其方法；
重点要掌握空斑形成单位法、50%终点法测定病 毒滴度的原理及其滴度的计算；
适当稀释的病毒悬液与长成单层的宿主细胞混合在细胞上覆以营养琼脂培养基等固体或半固体介质由于琼脂的限制病毒只能感染并破坏临近的细胞造成细胞溶解而形成空斑每个空斑由一个病毒颗粒造成计算空斑数量再乘以稀释倍数即可得知原来的病毒感染单位的浓度
病毒滴度的测定
空斑形成单位法测定病毒滴度
➢原理(重点)：适当稀释的病毒悬液与长成单 层的宿主细胞混合，在细胞上覆以营养琼脂培 养基等固体或半固体介质，由于琼脂的限制， 病毒只能感染并破坏临近的细胞，造成细胞溶 解而形成空斑，每个空斑由一个病毒颗粒造成， 计算空斑数量再乘以稀释倍数即可得知原来的 病毒感染单位的浓度。
熟悉：空斑形成单位法、50%终点法、血凝试验 和干扰滴定法测定病毒滴度的具体方法；
空斑形成单位（Plaque Forming Units, PFUs)
空斑形成单位法测定病毒滴度
空斑显现原理(掌握)：空斑形成后，经中性红 活细胞染色，活细胞显示红色，而空斑区细胞 不着色，形成不染色区域。
➢Procedures
空斑形成单位法测定病毒滴度
适用条件(熟悉)：凡是能在细胞中产生细胞病 变效应(CPE)的病毒都可以采用空斑形成法测 定病毒滴度。
d：稀释系数，即组距
d=lg10-1 = -1
S：CPE(阳性)孔比率总和
2020年病毒的分离鉴定.pdf
病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。
1.病毒的分离1.1标本的处理1.1.1标本的收集a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。
b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。
c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。
1.1.2 除菌处理a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4小时。
c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。
1.2 病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。
根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。
1.2.1 鸡胚接种a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致 。
b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
c) 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。
①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。
②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。
病毒滴度的测定
病毒滴度的测定◆病毒感染的测量方法–直接计数法将病毒与乳胶颗粒混合,电子显微镜观测缺点是无法判断病毒的感染性–间接计数法空斑形成单位(plaque forming units,PFUs)50%终点法血凝试验干扰滴定第一节空斑形成单位法一、基本原理◆原理–空斑形成单位(plaque forming units,PFUs)试验：将不同稀释倍数的病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒感染时会造成宿主细胞溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒引起，计数空斑数目再乘稀释倍数，得病毒感染的浓度–病毒空斑—蚀斑将病毒稀释后移入单细胞培养瓶中，吸附1h后，覆盖营养琼脂病毒在琼脂中只感染临近的细胞，形成空斑的退化细胞区中性红染色：活细胞染红色；死细胞无色产生CPU的病毒均可用此方法二、方法与步骤◆测定病毒空斑的试验方法–病毒杀死感染细胞的检测：产生细胞病变效应中型红：活细胞染红色台盼兰：死细胞染蓝色M TT：溴化二苯基四氮唑，将活细胞染成深蓝色，易于计数，易分离病毒转化或有抵抗力的细胞–未能杀死细胞可产生血凝素因能吸附红细胞，空斑用血吸附显出用显微镜计数吸附红细胞的空斑–细胞融合：病毒感染细胞与临近的未感染细胞融合形成多核细胞，用显微镜观查合胞体空斑–空斑中含有病毒的抗原免疫荧光分析–免疫组化技术生物素-抗生物素-过氧化物酶染色技术间接免疫过氧化物酶染色三、空斑形成单位法测定病毒滴度的计算◆空斑形成单位试验技术–传代细胞平皿法单层细胞浓度为2×106，培养液为RPMI1640，Eagle，MEM病毒液稀释在冰浴盘作10倍稀释，每个稀释度培养2瓶，每加一次样时要新吸管，来回吸三次，加至培养瓶无细胞层的瓶壁底角再倾斜来回摇动，使病毒均匀C O2孵箱吸附90min后，再用营养琼脂覆盖培养5~8d后，加入0.01%的中性红染色，计数空斑◆病毒滴度的计数–按以下公式计算空斑形成单位(PFUs/ml) = d vn n ∙∙X +X +X 21 X1、X2、Xn ：表示同一稀释度在不同培养孔板（实验单位）中数得到的空斑数；n 表示计数空斑的培养板孔数；v 表示病毒量（ml ）；d 表示稀释倍数例：以稀释成10-4的病毒悬液感染细胞，四个培养板孔中的空斑数分别为1，1，3及5个，接种量为0.2 ml空斑形成单位(PFUs/ml) = 4100.245311⨯⨯+++ = 1.25×105PFUs/ml ◆ 空斑形成单位（PFUs ）与重复感染数（M.O.I ）– 重复感染数（Mutiplicity of Infection ，M.O.I ）是指感染一个细胞的病毒颗粒的平均数– 一般来说， M.O.I 值越大，则实验细胞被感染的比例越大– 若某病毒的PFUs 已经测得，要按一定量的M.0.I 进行感染细胞时则所需的病毒量可按公式1和2计算公式1：实验细胞数×所需的M.O.I 值=所需的PFUs公式2：所需的PFUs/实际病毒的PFUs=需要加的病毒量例：已知某病毒的滴度为1.3×1011 PFUs/ml ，试验细胞数为每孔1.8×106，计划M.O.I 值为200。
2020年病毒滴度测定.pptx
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可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。
第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ；依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ；换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。
稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。
放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。
第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。
第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X 和Y，则滴度（TU/mL）=（X+Y×10）×1000/2/X 孔的病毒液的含量（μL）。
定量PCR 法病毒感染1 天前，取6 孔板接种HOS 细胞。
每孔细胞为5×100 000 个。
接种细胞24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5 μg/mL polybrene 的新鲜培养基。
将浓缩病毒用培养基稀释200 倍，也就是取1 μL 病毒加入到199 μL 的培养基中。
在3 个培养孔中分别加入0.5 μL，5 μL 和50 μL 的稀释病毒。
感染开始后20 小时，除去培养上清，换为500 μL 含DNaseI 的新鲜培养基。
在37℃消化15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。
然后换为2 mL 正常的培养基，继续培养48 小时。
用0.5 mL 0.25% 胰酶-EDTA 溶液消化细胞，在37℃放置1 分钟。
用培养基吹洗下，离心收集细胞。
按照DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组DNA 。
每个样品管中加入200 μL 洗脱液洗下DNA 。
用DNA 定量试剂盒定量（Bio-Rad）。
基因组DNA 可以稳定保存在-20℃至少两个月。
准备PCR 所需的试剂和样品。
为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：Forward primer （100 pmol/mL）：0.1μL ×nReverse primer （100 pmol/mL）：0.1μL ×nProbe （100 pmol/mL)：0.1μL ×n水：19.7 μL ×nn = number of reactions。
例如：总反应数为40，将1 mL 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，4 μL forward primer，4 μL reverse primer，4 μL probe 和788 μL 水混和。
震荡后放在冰上。
2×T aqMan Master Mix：25 μL ×n10×RNaseP primer/probe mix：2.5 μL ×n水：17.5 μL ×nn = number of reactions。
例如：总反应数为40，将1 mL 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，100 μL 10×RNaseP primer/probe mix 和700 μL 水混和。
震荡后放在冰上。
在预冷的96 孔PCR 板上完成PCR 体系建立。
从总管Ⅰ中各取45 μL 加入到A-D 各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45 μL 加入到E-G 各行的孔中。
分别取5 μL 质粒标准品和待测样品基因组DNA 加入到A-D 行中，每个样品重复1 次。
另留1 个孔加入5 μL 的水做为无模板对照（no-template control）。
分别取5 μL 基因组标准品和待测样品基因组DNA 加入到E-G 行中，每个样品重复1 次。
另留1 个孔加入5 μL 的水做为无模板对照（no-template control）。
所使用定量PCR 仪为ABI PRISM 7000 定量系统。
循环条件设定为：50℃2 分钟，95℃10 分钟，然后是95℃15 秒，60℃1 分钟的40 个循环。
数据分析：测得的DNA 样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。
滴度（integration units per mL，IU/mL）的计算公式如下：IU/mL= (C ×N×D×1000)/V其中：C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数；N = 感染时细胞的数目（约为1×100000）D = 病毒载体的稀释倍数；V = 加入的稀释病毒的体积数。
96孔板病毒滴定实验方法总结一看了前面一个关于病毒滴定方法的帖子,自己也做过不少次,所以想写出一点儿,算是个总结,希望能对各位有所帮助.这里我写2种方法,一种是在稀释好的病毒液里加细胞悬液.另一种是在长成单层的细胞上,加入已经稀释好的病毒液.这两种方法我都做过,效果各有长处.1.一个确定的地方是,所用细胞是贴壁生长,所以在维持液或者生长液中都不能加入胰酶,这一点和流感病毒病毒滴定测定有很大不同;2.稀释液配方:MEM(或DMEM)+1%双抗+NaHCO3(加入量由所需要pH值确定,一般以加到pH7.0为主,可用pH试纸测定,NaHCO3的浓度为6%).另,MEM,或DMEM的选择由所培养的宿主细胞决定;3.细胞悬液为细胞+生长液(MEM+10%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3).在加细胞悬液的病毒滴定测定方法中,如果不加入细胞生长液,则细胞无法贴壁;方法一.在稀释好的病毒液中加入细胞悬液:1.一个确定的地方是,所用细胞是贴壁生长,所以在维持液或者生长液中都不能加入姨酶,这一天和流感病毒病毒滴定测定有很大不同;2.稀释液配方:MEM(或DMEM)+1%双抗+NaHCO3(加入量由所需要pH值确定,一般以加到pH7.0为主,可用pH试纸测定,NaHCO3的浓度为6%).另,MEM,或DMEM的选择由所培养的宿主细胞决定;3.细胞悬液为细胞+生长液:MEM+10%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3加细胞悬液的病毒滴定测定方法中,如果不加入细胞生长液,则细胞无法贴壁;4.96孔板上做10倍稀释病毒,从10-1开始,一般做5-6个稀释度,即到10-5或10-6即可,每孔25微升,每个稀释度做4孔,或者8孔,一般做4孔即可;5.消化细胞,并用生长液反复吹打细胞,使细胞充分混允,放入双碟,用排枪将细胞悬液加入相应孔中,每孔100微升;6.细胞对照孔:125微升细胞悬液,不加病毒;7.关于96孔板,每孔接种的细胞量:一般在此种测定病毒滴度的方法下,要将细胞密度适当调低,至少要比正常传代时低一些,否则细胞生长速度过快,未到7天则细胞出现死亡,对观察CPE不利.一般情况下,小塑料瓶(8-9ml液体为正常用量),培养长慢单层后,消化细胞,加入6ml培养液,吹匀,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在该瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用显微镜看一下,细胞数过多则补加培养液,少则补加剩余4ml 的细胞悬液;8.37oC, 5％CO2培养7天左右,每天观察结果,从出现CPE的第一天开始记录,一般第7天可以计算病毒滴度;9.计算公式,比较复杂,明天再附上,这里介绍一个简单的计算TCID50的方法:由以上公式求得0.6 加到僅高於50﹪感染率稀釋指數( 此例中為10-3 )得10-3.6<即為病毒作10-3.6稀釋後每0.1ml 含1 TCIP50，亦即該病毒之力價為10-3.6/0.1ml。
这里是以每个稀释度8孔为例,如果做的是4孔一个稀释度,则对应的换一下数字即可.(这里是转自别人的帖子,但是我用了之后觉得比那个很长的公式容易得多,所以推荐给大家)10.本方法的优点:不容易污染;缺点:①.细胞生长周期长,出结果所需时间也长,一般要到第7天才能计算病毒滴度;②. 病毒本身有毒性,所以对细胞的贴壁造成一定影响,这也是此法中细胞生长慢的原因之一;③. 不容易控制细胞数量,需要经验,一旦细胞数量过多,则不到第7天细胞大量死亡,无法判断CPE;若细胞数量过少,则细胞无法正常生长,不能正常增殖,也是造成无法判断CPE的原因之一;还有另外一种方法,明天再写.如果有什么不恰当的地方,希望有经验的高手多多指教,希望大家能多多交流,谢谢!4.维持液,即病毒培养液,配方为:①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;②. MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS(小牛血清).我个人曾经做过实验,在状态很好的细胞上接种病毒,分别使用两种不同的维持液,最终结果是一样的,没有什么不同,所以可以根据个人需要进行选择.另外,曾经请教过专门做中和实验的老师,他认为适当的FBS对细胞有保护作用,而且他说这是国外文献上的报道.。