2020年病毒滴度测定.pdf

可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。

第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；

第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL；

第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ；

依次类推…

第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ；

第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ；

换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。

稀释计数法

滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天细胞准备

将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。

第二天加病毒

在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。

吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。

第三天追加培养液

在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。

第四天观察结果并计算滴度

在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X 和Y，则滴度（TU/mL）=（X+Y×10）×1000/2/X 孔的病毒液的含量（μL）。

定量PCR 法

病毒感染1 天前，取6 孔板接种HOS 细胞。每孔细胞为5×100 000 个。

接种细胞24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。

弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5 μg/mL polybrene 的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200 倍，也就是取1 μL 病毒加入到199 μL 的培养基中。在3 个培养孔中分别加入0.5 μL，5 μL 和50 μL 的稀释病毒。

感染开始后20 小时，除去培养上清，换为500 μL 含DNaseI 的新鲜培养基。在37℃消化15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2 mL 正常的培养基，继续培养48 小时。

用0.5 mL 0.25% 胰酶-EDTA 溶液消化细胞，在37℃放置1 分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组DNA 。每个样品管中加入200 μL 洗脱液洗下DNA 。用DNA 定量试剂盒定量（Bio-Rad）。基因组DNA 可以稳定保存在-20℃至少两个月。

准备PCR 所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：

Forward primer （100 pmol/mL）：0.1μL ×n

Reverse primer （100 pmol/mL）：0.1μL ×n

Probe （100 pmol/mL)：0.1μL ×n

水：19.7 μL ×n

n = number of reactions。例如：总反应数为40，将1 mL 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，

4 μL forward primer，4 μL reverse primer，4 μL probe 和788 μL 水混和。震荡后放在冰上。

2×T aqMan Master Mix：25 μL ×n

10×RNaseP primer/probe mix：2.5 μL ×n

水：17.5 μL ×n

n = number of reactions。例如：总反应数为40，将1 mL 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，100 μL 10×RNaseP primer/probe mix 和700 μL 水混和。震荡后放在冰上。

在预冷的96 孔PCR 板上完成PCR 体系建立。从总管Ⅰ中各取45 μL 加入到A-D 各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45 μL 加入到E-G 各行的孔中。

分别取5 μL 质粒标准品和待测样品基因组DNA 加入到A-D 行中，每个样品重复1 次。另留1 个孔加入5 μL 的水做为无模板对照（no-template control）。

分别取5 μL 基因组标准品和待测样品基因组DNA 加入到E-G 行中，每个样品重复1 次。另留1 个孔加入5 μL 的水做为无模板对照（no-template control）。

所使用定量PCR 仪为ABI PRISM 7000 定量系统。循环条件设定为：50℃2 分钟，95℃10 分钟，然后是95℃15 秒，60℃1 分钟的40 个循环。

数据分析：测得的DNA 样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。

滴度（integration units per mL，IU/mL）的计算公式如下：

IU/mL= (C ×N×D×1000)/V

其中：C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数；N = 感染时细胞的数目（约为1×100000）D = 病毒载体的稀释倍数；V = 加入的稀释病毒的体积数。

96孔板病毒滴定实验方法总结一

看了前面一个关于病毒滴定方法的帖子,自己也做过不少次,所以想写出一点儿,算是个总结,希望能对各位有所帮助.这里我写2种方法,一种是在稀释好的病毒液里加细胞悬液.另一种是在长成单层的细胞上,加入已经稀释好的病毒液.这两种方法我都做过,效果各有长处.

1.一个确定的地方是,所用细胞是贴壁生长,所以在维持液或者生长液中都不能加入胰酶,这一点和流感病毒病毒滴定测定有很大不同;

2.稀释液配方:MEM(或DMEM)+1%双抗+NaHCO3(加入量由所需要pH值确定,一般以加到pH7.0为主,可用pH试纸测定,NaHCO3的浓度为6%).另,MEM,或DMEM的选择由所培养的宿主细胞决定;

3.细胞悬液为细胞+生长液(MEM+10%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3).在加细胞悬液的病毒滴定测定方法中,如果不加入细胞生长液,则细胞无法贴壁;

方法一.在稀释好的病毒液中加入细胞悬液:

1.一个确定的地方是,所用细胞是贴壁生长,所以在维持液或者生长液中都不能加入姨酶,这一天和流感病毒病毒滴定测定有很大不同;

2.稀释液配方:MEM(或DMEM)+1%双抗+NaHCO3(加入量由所需要pH值确定,一般以加到pH7.0为主,可用pH试纸测定,NaHCO3的浓度为6%).另,MEM,或DMEM的选择由所培养的宿主细胞决定;

3.细胞悬液为细胞+生长液:

MEM+10%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3

加细胞悬液的病毒滴定测定方法中,如果不加入细胞生长液,则细胞无法贴壁;

4.96孔板上做10倍稀释病毒,从10-1开始,一般做5-6个稀释度,即到10-5或10-6即可,每孔25微升,每个稀释度做4孔,或者8孔,一般做4孔即可;

5.消化细胞,并用生长液反复吹打细胞,使细胞充分混允,放入双碟,用排枪将细胞悬液加入相应孔中,每孔100