噬菌斑测病毒滴度
筛库注意
滴度测定时未看到噬菌斑？TOP>>A2.与Lambda噬菌体不同，M13噬菌体是一个非裂解性噬菌体，不产生清晰的噬菌斑。
M13噬菌斑是一块细胞生长力降低的区域，而不是细胞裂解，所以可能会比较难以观察到。
试着将平板对光观察。
此外，由于用来制备文库的载体含有lacZα基因，当用α互补的菌株（如：所提供的ER2738菌株）在含Xgal/IPTG的培养基上铺板时，噬菌斑将呈现蓝色，有助于观察。
另外，还要保证待测滴度的噬菌体稀释范围合适。
扩增的噬菌体：铺10 μl 1:109 - 1:1011稀释的样品；未扩增的淘选洗脱物，前几轮按1:10 - 1:104稀释，后几轮按1:104-1:107稀释。
如果噬菌体得不到充分稀释，噬菌斑将在平板上融合，看起来就像根本没有噬菌斑（或者当用Xgal平板时呈浅蓝色）。
有时PEG沉淀后，噬菌体会凝集成一团不易稀释，导致平板上过多噬菌斑融合在一起。
因此，重悬沉淀时一定要留出足够的时间使噬菌体扩散开（>1小时），并且每个稀释管都要充分混匀（~10秒）。
对任何噬菌体展示系统，污染都是一个极其常见的问题，但幸运的是我们可以采取一系列措施来降到影响：∙所有滴度测定步骤都用Xgal/IPTG平板，如果出现白斑，只挑蓝斑进行测序。
∙在操作手册所述的所有步骤中都使用抗气溶胶吸头和带棉虑芯的移液器。
∙如果污染问题仍然存在，淘选中用到的所有溶液都应当灭菌，但含BSA 的溶液除外，此类溶液应过滤除菌。
噬菌体展示中所用到的溶液不应用于它处。
使用可拆卸移液器，对外管进行灭菌，内部的活塞在去污剂（如：Count-offTM）中浸泡过夜。
∙由于在扩增步骤中野生型噬菌体被优先扩增，三轮淘选洗脱后直接挑噬菌斑进行测序。
不要再扩增第三轮洗脱物直接进行第四轮淘选，除非第三轮测序没有发现任何共有序列。
Q4. 扩增噬菌体滴度太低？TOP>>A4. 为了使M13噬菌体有效扩增，关键是培养物要通气良好，并在细菌生长早期感染噬菌体。
噬菌体效价的测定
（4）为什么选用双层琼脂平板法测定噬菌体效价？
七.实验关键问题，注意事项及实验要求
1.关键问题：稀释，温度，倒板
2.注意事项：移液器使用及登记，
3.实验要求
4.预习报告（写清具体实验步骤），试管清洗，Tip回收，实验室卫生，保持安静，结果观察请于实验后第二日观察。
5.实验报告要求（清晰简洁，记录关键内容）
6.实验过程，实验报告及实验考核综合评定此次实验成绩。
八.物品准备
1.ER2738菌液：每组～10ml（注意保持无噬菌体污染）
2.M13KE：每组一只（1ml）
3.稀释用培养基：无菌水替代（TBS）
4.实验操作无需在超净台进行（原因，另外是否所有测定滴度的实验都可以）
5.EP管，Tip头用量
噬菌体效价的测定
一.目的要求
1.学习噬菌体效价测定的基本方法。
2.掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本方法。
二、基本原理:
噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位(Plaque-forming units,简写成pfu)表示。
(2)凝固后，倒置37℃培养。记录培养时间
5．观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取 30～300个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。
病毒滴度的测定
病毒滴度的测定病毒感染的测量方法–直接计数法将病毒与乳胶颗粒混合电子显微镜观测缺点是无法判断病毒的感染性–间接计数法空斑形成单位plaque forming unitsPFUs 50终点法血凝试验干扰滴定第一节空斑形成单位法一、基本原理原理–空斑形成单位plaque forming unitsPFUs试验将不同稀释倍数的病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合当病毒感染时会造成宿主细胞溶解而形成空斑每个空斑系由一个病毒颗粒引起计数空斑数目再乘稀释倍数得病毒感染的浓度–病毒空斑—蚀斑将病毒稀释后移入单细胞培养瓶中吸附1h后覆盖营养琼脂病毒在琼脂中只感染临近的细胞形成空斑的退化细胞区中性红染色活细胞染红色死细胞无色产生CPU的病毒均可用此方法二、方法与步骤测定病毒空斑的试验方法–病毒杀死感染细胞的检测产生细胞病变效应中型红活细胞染红色台盼兰死细胞染蓝色MTT溴化二苯基四氮唑将活细胞染成深蓝色易于计数易分离病毒转化或有抵抗力的细胞–未能杀死细胞可产生血凝素因能吸附红细胞空斑用血吸附显出用显微镜计数吸附红细胞的空斑–细胞融合病毒感染细胞与临近的未感染细胞融合形成多核细胞用显微镜观查合胞体空斑–空斑中含有病毒的抗原免疫荧光分析–免疫组化技术生物素-抗生物素-过氧化物酶染色技术间接免疫过氧化物酶染色三、空斑形成单位法测定病毒滴度的计算空斑形成单位试验技术–传代细胞平皿法单层细胞浓度为2×106培养液为RPMI1640EagleMEM 病毒液稀释在冰浴盘作10倍稀释每个稀释度培养2瓶每加一次样时要新吸管来回吸三次加至培养瓶无细胞层的瓶壁底角再倾斜来回摇动使病?揪 ? CO2孵箱吸附90min后再用营养琼脂覆盖培养58d后加入0.01的中性红染色计数空斑病毒滴度的计数–按以下公式计算空斑形成单位PFUs/ml dvnn21X1、X2、Xn表示同一稀释度在不同培养孔板实验单位中数得到的空斑数n表示计数空斑的培养板孔数v表示病毒量mld表示稀释倍数例以稀释成10-4的病毒悬液感染细胞四个培养板孔中的空斑数分别为113及5个接种量为0.2 ml 空斑形成单位PFUs/ml 4100.245311 1.25×105PFUs/ml 空斑形成单位PFUs与重复感染数M.O.I –重复感染数Mutiplicity of InfectionM.O.I是指感染一个细胞的病毒颗粒的平均数–一般来说M.O.I值越大则实验细胞被感染的比例越大–若某病毒的PFUs 已经测得要按一定量的M.0.I进行感染细胞时则所需的病毒量可按公式1和2计算公式1实验细胞数×所需的M.O.I值所需的PFUs 公式2所需的PFUs/实际病毒的PFUs需要加的病毒量例已知某病毒的滴度为1.3×1011 PFUs/ml试验细胞数为每孔1.8 ×106计划M.O.I值为200。
流感病毒滴定,噬斑和血凝抑制
流感病毒滴定，噬斑和血凝抑制实验血凝滴定法在血凝试验中，将连续的病毒稀释液与恒定量的RBC混合。
如果病毒浓度足够高，RBC包含许多血细胞凝集素受体，就会发生凝集。
如果添加血清，流感病毒对红细胞的凝集将被阻止；这是HAI分析的基础。
每种HAI分析中均应包括对照抗血清和抗原，以验证测试的特异性。
实验材料：1，96孔微滴定板：V底板用于鸟类红细胞RBC（erythrocyte/red blood cell），U底板用于哺乳动物RBCs。
2，0.01M的磷酸盐buffer：Ph7.2-7.4.3,标准的RBCs：禽类0.5%，哺乳动物0.75%，通过无菌纱布过滤RBCs，200g在4-8℃离心10min，吸出血浆，加入PBS离心重复两次，用PBS重悬RBCs 和调整到需要的浓度，储存在4-8℃。
鸡红细胞1000rpm/5min。
看是否有沉淀，如果有，就说明这个变质不能用，用PBS洗一次，1000rpm/5min。
用PBS稀释到10mL，滴定板中先加入PBS，再加入病毒，最后加红细胞。
如果对照组有纽扣形成，看实验组。
，在HA测试期间将病毒库存保存在冰上，以保持病毒的感染性。
实验方法：1，将在组织培养或鸡胚鸡蛋中分离的每种流感病毒的等分试样（100μL）放在96孔微量滴定板第一行的孔中。
在第2行至第12行中加入50 μL PBS。
在96孔板上向下进行一系列2倍稀释，将50 μL从第1行转移到第2行，依此类推。
从最后一个孔中取出最后的50 μL。
向所有孔中添加50μL标准RBC。
轻轻拍打板以混合或使用机械摇板。
在室温（20–25°C）下孵育平板30min。
2，培养期后，观察到HAU的凝集终点（图2）。
在阴性样品中，RBC将沉降到V孔微量滴定板的底部，而在阳性样品中，它们将凝集。
第8列中的孔不包含病毒。
凝集的RBC将均匀地分布在孔中，而不凝集的RBC将在V孔底部形成一个纽扣。
HA滴度是显示完全血凝活性的最后稀释液以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。
病毒感染力的滴定
二、病毒蚀斑技术 病毒蚀斑（plaque) 又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形
成的局限性病灶。
原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感
细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基 纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后， 只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期 后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局
每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液
中的感染性病毒浓度。 计算方法： 如用PRV接种PK-15细胞，每孔接种了0.4ml，结 果10-5孔形成了208个空斑，而10-6孔形成了22个空斑，
则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位（PFU）为：
22×106/0.4ml=5.5×107个/ml。
一、病毒TCID50的测定 操作步骤
在青霉素瓶中将病毒作连续 10倍的稀释，从10-1-
10-10。
将稀释好的病毒接种到 96孔微量培养板中，每一
稀释度作8孔，每孔接种100µ l。
在每孔加入细胞悬液100µ l，使细胞量达到3×105 个/ml。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
将培养板臵37℃ 5% CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液， 用含钙、镁的PBS（pH7.4）洗3次。 取1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-42℃，
与等量预热至38-42℃含6%-10%犊牛血清的无酚红
DMEM混合，注入细胞培养板中。
室温放臵直至琼脂糖凝固，或于4℃冰箱放臵几
分钟至琼脂糖凝固，然后于37℃ 5% CO2培养箱
获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。
• 筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，
通过PCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下 一轮空斑纯化。如此3-5轮空斑纯化后即可得到 纯化的病毒粒子。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定是一种用于确定病毒在溶液中的浓度的方法。
它通常用于病毒学研究、疫苗生产和药物研发等领域。
正确的病毒滴度测定方法可以帮助科研人员准确地评估病毒的活性和浓度，从而为相关研究工作提供可靠的数据支持。
下面将介绍几种常用的病毒滴度测定方法。
一、细胞培养法。
细胞培养法是一种常用的病毒滴度测定方法。
首先，将待测病毒样品与细胞培养基混合，然后在培养皿中接种一定数量的细胞，并将混合液加入培养皿中。
接下来，将培养皿放入恒温培养箱中，培养一定时间后观察细胞的感染情况，根据感染细胞的数量可以计算出病毒的滴度。
二、血凝法。
血凝法是另一种常用的病毒滴度测定方法。
这种方法利用病毒对红细胞的凝集作用来确定病毒的滴度。
首先，将一定浓度的病毒样品与红细胞混合，然后在琼脂培养皿中进行凝集反应。
根据凝集的程度和范围可以计算出病毒的滴度。
三、动物接种法。
动物接种法是一种直接将病毒样品接种到动物体内，通过观察动物的感染情况来确定病毒滴度的方法。
这种方法通常用于病毒毒力的测定。
通过确定50%动物传染单位（TCID50）或50%致死剂量（LD50）来表示病毒的滴度。
总结。
以上介绍了几种常用的病毒滴度测定方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在进行病毒滴度测定时，需要根据实际情况选择合适的方法，并严格按照操作规程进行操作，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文对您有所帮助。
病毒滴度的测定
病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。
放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。
第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。
定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。
每孔细胞为5×104个。
接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。
将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。
在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl 的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI 的新鲜培养基。
在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。
然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。
用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。
用培养基吹洗下，离心收集细胞。
腺病毒的一些常见问题及解答
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。
本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。
无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。
而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。
同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。
而传统的表达载体如INVITROGEN公司（)的pCDNA载体系列，会更好一些。
同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。
正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。
基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。
以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。
但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。
当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。
3.重组腺病毒作基因治疗，因为不是很了解，用AdEasy系统可以吗？具体的实验步骤是来自什么地方？主要细胞及试剂的来源？.BIOgene公司有整个系统，从质粒到细胞都有，我AdEasy的基本原理请参阅文献AVol.95.pp.2509-2514,March 19984.以腺病毒为载体做肿瘤细胞的基因转染，查文献，病毒滴度测定用噬斑法，但所用细胞不统一，是否有统一规定？就用肿瘤细胞来测行吗？只有能反式提供E1的细胞才能用来测腺病毒滴度，一般用HEK293细胞，用肿瘤细胞肯定不能形成噬斑。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法病毒滴度测定方法是一种用于测定病毒在溶液中的浓度的实验方法。
病毒滴度是指单位体积中含有的病毒颗粒数，通常以每毫升（mL）为单位。
病毒滴度的测定对于病毒学研究和疫苗生产具有重要意义。
本文将介绍常见的病毒滴度测定方法及其操作步骤。
一、细胞培养法。
1. 准备培养皿和细胞悬液，将含有适量细胞的培养皿放入培养箱中孵育，直至细胞生长至适当密度。
用无菌PBS或生理盐水洗涤细胞，用含有适量生长培养基的管中悬浮细胞。
2. 制备病毒稀释液，将病毒溶液以一定比例加入生长培养基中，得到一系列不同浓度的病毒稀释液。
3. 感染细胞，将不同稀释度的病毒溶液加入培养皿中的细胞悬液，孵育一定时间后观察细胞形态变化。
4. 计算滴度，根据感染的细胞数量和病毒稀释液的稀释倍数，利用统计学方法计算出病毒的滴度。
二、血凝法。
1. 准备血凝管，将一定量的新鲜血液加入血凝管中，加入适量的病毒溶液，轻轻摇匀。
2. 孵育，将血凝管放置在37摄氏度的恒温箱中孵育一段时间，观察血凝情况。
3. 计算滴度，根据血凝管中凝结的情况，结合之前加入的病毒溶液的稀释倍数，计算出病毒的滴度。
三、组织培养法。
1. 准备组织培养皿和组织细胞，将含有适量细胞的组织培养皿放入培养箱中孵育，直至细胞生长至适当密度。
2. 感染组织细胞，将病毒溶液加入培养皿中的组织细胞，孵育一定时间后观察细胞形态变化。
3. 计算滴度，根据感染的细胞数量和病毒溶液的稀释倍数，利用统计学方法计算出病毒的滴度。
以上是常见的病毒滴度测定方法及其操作步骤，选择合适的方法取决于实验目的、病毒类型和实验条件。
在进行病毒滴度测定实验时，应严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文能对病毒滴度测定方法有所了解和帮助。
噬菌体展示[3篇]
![噬菌体展示[3篇]](https://img.taocdn.com/s3/m/762c57bef424ccbff121dd36a32d7375a417c61d.png)
噬菌体展示[3篇]以下是网友分享的关于噬菌体展示的资料3篇，希望对您有所帮助，就爱阅读感谢您的支持。
噬菌体展示（一）测定噬菌体滴度只有当噬菌体的感染复度MOI (噬菌体数/细菌数)值远低于1时（即细菌过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。
正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。
低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。
1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 ~0.5）。
2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。
保存于45℃备用。
3. 37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。
建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。
每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
6. 每管加入10 μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。
7. 将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。
适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
8. 待平板冷却5 min后，倒置于37℃培养过夜。
9. 检查平板，计数有~102个噬菌斑的平板上的斑数。
然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
淘选程序最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。
根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法病毒滴度测定是一种用于测定病毒浓度的方法，通常用于病毒学研究和疫苗生产中。
病毒滴度测定的结果可以帮助科研人员和生产工作者准确地了解病毒的数量，为后续的实验和生产提供重要参考。
本文将介绍病毒滴度测定的常用方法及操作步骤。
首先，进行病毒滴度测定需要准备一定数量的培养皿或培养瓶。
在实验操作前，需要将培养皿或培养瓶进行消毒处理，以避免外源细菌的污染对实验结果的影响。
另外，还需要准备好相应的培养基和试剂，以及需要测定的病毒样品。
接下来，将培养皿或培养瓶按照实验要求进行编号，并分别加入适量的培养基。
然后，将待测病毒样品按照一定的稀释倍数进行稀释，并将不同稀释倍数的样品分别滴入已加入培养基的培养皿或培养瓶中。
在滴定完成后，将培养皿或培养瓶进行培养，培养时间根据不同病毒的特性而定，通常在37摄氏度下培养24-72小时。
培养结束后，观察培养皿或培养瓶中的细胞形态和数量，根据病毒感染的细胞数量和形态变化来确定病毒滴度。
通常情况下，病毒感染的细胞数量越多，病毒滴度越高。
在观察完毕后，可以根据所用的稀释倍数和感染细胞的数量来计算病毒的滴度。
除了上述介绍的常规方法外，还有一些改良的病毒滴度测定方法，如TCID50法、PFU法等。
这些方法在实际应用中有其特定的优势和适用范围，可以根据实际需求选择合适的方法进行病毒滴度测定。
总之，病毒滴度测定是病毒学研究和疫苗生产中不可或缺的重要实验方法之一。
通过本文的介绍，相信读者对病毒滴度测定方法有了更清晰的认识，希望能对相关领域的科研人员和生产工作者有所帮助。
噬菌斑测病毒滴度
杆状病毒滴度检测实验概要本实验介绍了检测病毒滴度的方法。
实验原理根据噬菌斑数计算病毒滴度。
工具/原料• 1. 4% agarose gel：2g agrose 50ml 水，高压灭菌•2×Grace（unsupplemented）：9.14g粉末（invitrogen）0.07gNaHCO3 H2O，调PH6.1，定容至100ml，无菌过滤•supplemented Grace：1×Grace添加3.33mg/ml Lactalbumin，3.33mg/ml yeastolate，无菌过滤• 4. 高温灭活FBS•主要设备1. 6孔板2. 12ml离心管3. 100ml无菌玻璃瓶4. 无菌吸管5. 70℃水浴锅•实验材料杆状病毒，SF9：5×105cells/ml方法/步骤1. 1无菌条件下，2ml/孔细胞（5×105cells/ml）种入6孔板，室温孵育1h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度；2. 2将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解，空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热；3. 3将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释：10-1~10-8。
4. 4弃6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒，1ml/孔，复孔，室温孵育1h。
5. 5配置上层琼脂：加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml，25ml 2×Grace（含FBS）12.5ml无菌水12.5ml 4% agarose gel，至预热的100ml无菌瓶，轻轻混匀，放入37℃水浴锅备用；6. 6弃6孔板内上清，快速加2ml上层琼脂，以防菌层干燥，静置10-20min使其凝固；7.7将6孔板放入27℃培养箱，培养4－10天；8.8计数板中噬菌斑，直至连续两天无变化，加1mg/ml中性红0.5ml，室温孵育2h后计数噬菌斑。
噬菌体滴度测定方法
噬菌体滴度测定方法
噬菌体滴度测定是一种用于测定噬菌体（一种寄生于细菌的病毒）浓度的方法。
这种方法通常用于实验室中对噬菌体的研究和生产中的质量控制。
噬菌体滴度测定可以通过以下步骤来进行：
1. 制备宿主细菌，首先，需要培养并生长宿主细菌，通常是大肠杆菌等细菌。
这些细菌将被用作噬菌体的寄主。
2. 制备稀释系列，将噬菌体样品进行一系列的稀释，通常是1:10的稀释系列，以便在测定时得到合适的滴度范围。
3. 混合噬菌体和宿主细菌，将每种稀释倍数的噬菌体样品与宿主细菌混合，并在琼脂平板上均匀涂布。
4. 孵育，将含有噬菌体和宿主细菌的琼脂平板在适当的温度下孵育一段时间，通常是在37摄氏度下孵育。
5. 计数形成的克隆，在孵育后，观察并计数每个琼脂平板上形成的克隆（也就是细菌克隆）。
根据稀释倍数和克隆的数量，可以计算出噬菌体的滴度。
噬菌体滴度测定的结果通常以噬菌体的孔径形成单位（PFU）表示，这是一种衡量噬菌体浓度的常用单位。
这种方法对于确定噬菌体溶液的浓度以及在实验室中进行噬菌体相关实验和研究中都具有重要的意义。
除了上述步骤外，还有一些改进的噬菌体滴度测定方法，如双层琼脂平板法和流式细胞术等，可以根据具体实验需求选择合适的方法进行测定。
总的来说，噬菌体滴度测定方法是一种重要的实验技术，对于噬菌体研究和应用具有重要意义。
噬菌体滴度法在微生物领域中的广泛应用
噬菌体滴度法在微生物领域中的广泛应用噬菌体滴度法（phage titering）是一种常用于测定噬菌体浓度的方法，在微生物领域中具有广泛的应用。
噬菌体是一种寄生在细菌上生长和复制的病毒，因此噬菌体滴度法在研究噬菌体感染性和生物防治等方面发挥着重要作用。
本文将介绍噬菌体滴度法的原理、操作步骤以及在微生物领域中的应用。
噬菌体滴度法的原理主要基于噬菌体感染细菌的特性。
该方法通过将噬菌体与感受器官细菌接种于富含寄主菌的培养基上，在合适的条件下进行培养，细菌在噬菌体的作用下发生裂解，形成溶解斑。
通过对溶解斑的计数，可以推断出噬菌体的浓度。
操作步骤：1. 准备工作：准备所需培养基和材料，消毒培养器具。
2. 预处理寄主菌：将寄主菌培养至对数期，以确保寄主菌的生长状态良好。
3. 制备噬菌体溶液：将噬菌体溶液与寄主菌混合，使其充分混合均匀。
4. 随机加入不同稀释度的噬菌体样品：将已稀释好的噬菌体样品分别滴入含有寄主菌的培养基上。
5. 培养：将接种好的培养基置于合适的温度和条件下培养，培养一定时间后出现溶解斑。
6. 溶解斑计数：使用透明的计数板，对溶解斑进行计数。
噬菌体滴度法在微生物领域中具有广泛的应用。
首先，它被广泛应用于噬菌体的产量评估。
噬菌体作为一种与细菌共生的生物体，在基因工程和抗生素研发中起着重要作用。
通过噬菌体滴度法，可以快速而准确地测定噬菌体产量，从而评估噬菌体的增殖能力和生产效率。
其次，噬菌体滴度法也被广泛用于研究噬菌体感染性和生物防治。
通过测定噬菌体的感染能力，可以评估噬菌体的抗菌活性以及其对不同细菌菌株的选择性。
此外，噬菌体滴度法还可以用于评估噬菌体在环境中的存活能力和传播能力，这对噬菌体在生物防治中的应用具有重要意义。
另外，噬菌体滴度法还被应用于噬菌体基因组的研究。
噬菌体基因组通常包含多个基因，这些基因在噬菌体的感染和复制过程中发挥着重要作用。
通过测定噬菌体滴度，可以对噬菌体基因组进行分析和研究，揭示噬菌体与细菌之间的相互作用和进化关系。
关于噬菌斑筛选法的原理
关于噬菌斑筛选法的原理噬菌斑筛选法（bacterial plaque screening）是一种常用于筛选具有特定生物活性的噬菌体（bacteriophage）的方法。
噬菌体是一种侵染细菌的病毒，能够选择性地感染特定的宿主细菌，并在其内部复制。
通过噬菌斑筛选法，可以从海量的噬菌体库中筛选出具有特定功能的噬菌体，这对于研究细菌感染机制、发现新的抗菌剂以及开发新的生物材料具有重要意义。
噬菌斑筛选法的原理是利用噬菌体的侵染能力和细菌的生长特性。
首先，需要构建一个含有待筛选靶标的细菌群落，这些靶标可以是蛋白质、多肽、DNA序列等。
然后，将这个细菌群落均匀涂布在富含营养物的琼脂平板上，使其形成一层均匀的细菌草皮。
接下来，将待筛选的噬菌体库与细菌草皮接触，让噬菌体感染细菌并在其内部复制。
经过适当的培养和处理，可以观察到在细菌草皮上形成的透明区域，这就是噬菌斑。
噬菌斑的形成是由于噬菌体感染细菌后，利用细菌的生长和复制机制，在细菌草皮上形成一个局部的溶解区域。
噬菌体通过识别和结合特定的受体蛋白，侵入细菌并释放其基因组。
在细菌内部，噬菌体利用细菌的生物合成机制合成自身的蛋白和核酸，并组装成新的噬菌体颗粒。
随着噬菌体的复制和积累，细菌被逐渐破坏，形成透明的噬菌斑。
通过噬菌斑筛选法，可以筛选出具有特定生物活性的噬菌体。
比如，如果我们希望筛选出具有抗菌活性的噬菌体，可以将细菌草皮接种在含有抗生素的琼脂平板上，只有感染并杀死细菌的噬菌体才能在抗生素浓度高的环境下生存并形成噬菌斑。
另外，噬菌斑筛选法还可以用于筛选出具有特定结合活性的噬菌体，比如针对某种蛋白质或多肽的结合。
在细菌草皮上形成的噬菌斑可以通过特定的染色或检测方法来鉴定，从而筛选出具有特定结合活性的噬菌体。
噬菌斑筛选法在生物医药研究领域有着广泛的应用。
通过这种方法，研究人员可以从海量的噬菌体库中快速筛选出具有特定功能的噬菌体，如抗菌活性、结合活性等。
这些具有特定生物活性的噬菌体可以用于治疗细菌感染、开发新的抗菌剂、研究细菌感染机制等。
病毒TCID50滴度
PFU:plaque forming unit，空斑形成单位。
感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。
由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。
因此建议也可使用TCID50法。
MOI :multiplicity of infection，感染复数。
传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。
其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。
噬菌体的数量单位为pfu。
一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。
后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。
然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。
能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。
传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。
其公式为：P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。
其中：P 为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则：P(0) = 1% = 0.01 m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。
TCID50 Protocol：1：制备96孔板单层细胞2：将病毒做系列稀释，横向接种单层细胞板，每稀释度重复3孔3：每日观察细胞病变，记录高于50和低于50％病变孔的病毒稀释度，4：计算比距，获得TCID50计算比距：（高于50％的病变率－50％）/（高于50％病变率－小于50％病变率）＝比距；比距与接近50%病变率的病毒的稀释度的指数相加，就获得了指数。
比如：比色计算或者显微镜观察病毒的TCID50在10的负7和8次方之间，那么，指数－8与比距相加，获得的新的指数，就是TCID50的指数，TCID50=10的-7.几次方TCID50与PFU换算:PFUs＝0.7×TCID50的滴度病毒TCID50滴度的计算：组织培养半数感染量是病毒感染一半组织细胞时的病毒的稀释度，一般使用Reed-Muench方法计算，详细过程见表1．计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）2．计算阳性和阴性孔的累积数阳性孔累计数由下向上累积（3）；阴性孔累积由上向下累积（4）3．计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/[(3)+（4）]；(6)=（5）×1004．计算距离比距离比例=（大于50%的阳性百分比-50）/（大于50%的阳性比-小于50%的阳性百分比）=（75-50）/（75-0）=0.3TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例x稀释系数的对数=5+0.3×0.5=5.15TCID50=10-5.15/100微升100TCID50/100微升=10-3.15100TCID50/50微升=10-3.15/2=10-3.15+0.3=10-3.15=1：16315．稀释系数的对数1:10稀释为1；半对数稀释为0.5；倍比稀释为0.3；1：5稀释为0.7。
噬菌体空斑实验
噬菌体空斑实验
实验目的：了解M13噬菌体感染特征
实验原理：一个M13噬菌体的病毒颗粒感染1个细菌后形成1个噬菌斑。
从感染细菌释放出来的子代病毒颗粒感染临近细菌，后者又可释放下一代病毒颗粒；如果细菌在半固体培养基上生长，自带病毒颗粒的扩散受到一定限制，诸如M13等丝状噬菌体并不裂解细菌，但可以使细菌生长速度降低至原来的1/2，在上层琼脂中生长的菌台的背景下，生长缓慢细菌形成了一个不断扩大到肉眼可见的噬菌斑。
材料与试剂：待测菌种、对应培养基
四、实验步骤
1.取5ml对应液体培养基于10ml的试管中，加入5ul 四环素（20mg/ml），将待测接入，
37℃震荡（80-100rpm）培养过夜（12h）
2.将2ml培养液转入20ml的培养基中（1:10稀释），继续37℃震荡（80-100rpm）培养
4.5h（不宜过快，否则，细菌性毛被破坏，噬菌体无法导入），
3.室温静置5min左右使平板冷却凝固，将培养皿倒置37℃培养过夜
4.第二天观察平板，对培养皿中的噬菌斑进行计数，计算约含有10-100个数量级的平板
噬菌斑的具体数目（y），计算噬菌体效价（pfu/ml）噬菌体效价=y*10x+2puf/ml。
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⑤为当量浓度的二十分之一。在制碱与制碳酸氢铵中用以表示氨水的浓度。
⑥在免疫学中，指通过血清学方法能显示一定反应的抗体或抗血清的最高稀释倍数；如终点稀释度为1/100，则血清的效价（每1ml的血清中抗体效价）为100抗体单位。
⑦在病毒学中，指用噬菌斑方法测得的噬菌体浓度。 噬菌体的效价（滴度）就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。
中文名：滴度
英文名：titer；titre
同义名：效价
符号：tt
效价测定的方法：
一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数目而是用噬菌斑形成单位(Plague-forming units，简写成pfu)表示。
6.6
弃6孔板内上清，快速加2ml上层琼脂，以防菌层干燥，静置10-20min使其凝固；
7.7
将6孔板放入27℃培养箱，培养4－10天；
8.8
计数板中噬菌斑，直至连续两天无变化，加1mg/ml中性红0.5ml，室温孵育2h后计数噬菌斑。
END
注意事项
病毒滴度（pfu/ml）=1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积
杆状病毒滴度检测
实验概要
本实验介绍了检测病毒滴度的方法。
实验原理
根据噬菌斑数计算病毒滴度。
工具/原料
1. 4% agarose gel：2g agrose 50ml 水，高压灭菌
2×Grace（unsupplemented）：9.14g粉末（invitrogen） 0.07gNaHCO3 H2O，调PH6.1，定容至100ml，无菌过滤
supplemented Grace：1×Grace添加3.33mg/ml Lactalbumin，3.33mg/ml yeastolate，无菌过滤
4. 高温灭活FBS
主要设备
1. 6孔板
2. 12ml离心管
3. 100ml无菌玻璃瓶
4. 无菌吸管
5. 70℃水浴锅
实验材料
杆状病毒， SF9：5×6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒，1ml/孔，复孔，室温孵育1h。
5.5
配置上层琼脂：加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml，25ml 2×Grace（含FBS） 12.5ml 无菌水 12.5ml 4% agarose gel，至预热的100ml无菌瓶，轻轻混匀，放入37℃水浴锅备用；
病毒滴度
也即病毒的毒力，或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量（MLD）、最小感染量（MID）和半数致死量（LD50），其中以LD50最常用。它是指在一定时间内能使半数实验动物致死的病毒量。然而，病毒对实验动物的致病作用不一定都以死亡为标志，例如以感染发病作指标，则可以半数感染量（ID50）测定；此外，当实验的材料是鸡胚时则用鸡胚半数致死量（ELD50）或鸡胚半数感染量（EID50）表示；实验的材料是细胞时则用组织细胞培养半数感染量（TCID50）表示。
方法/步骤
1.1
无菌条件下，2ml/孔细胞（5×105cells/ml）种入6孔板，室温孵育1h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度；
2.2
将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解，空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热；
3.3
将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释：10-1~10-8。
滴度
①某一物质与一定容量的另一物质产生反应所需的量。
②所谓滴度即病毒悬液的浓度，就是指pfu的数值。
③滴度是稀释度的倒数。例如上例中的 1 ： 180 的稀释度，其滴度就是 180 。
效价是滴度的同义词。效价即滴度，两者通用。当前虽然专业的化学和免疫学词典和专著中对这些词的使用已规范化，但在不少书刊的文章中常见误用，如称效价 1 ： 40 之类。