分子标记相关实验步骤

实验一植物DNA的提取与分离

一、目的：

学习并掌握CTAB法提取植物总DNA的原理和操作步骤。

二、原理和方法

关于植物总DNA的提取方法相关文献报道很多，但从提取原理上看主要有二种:CTAB法及SDS法。

1、CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法：

CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol／L NaCl)是可溶的。采用氯仿／异戊醇抽提蛋白质，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物溶液加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。

CTAB法提取DNA最初用于冷冻干燥的材料。其程序及试剂比例经适当改动后也于新鲜植物组织及细胞器DNA的提取。用冷冻干燥材料提取时，使用1×CTAB。用新鲜材料提取时使用2×CTAB缓冲液。

实验需要注意的问题是CTAB溶液在15℃以下会发生沉淀，所以含CTAB的溶液不能在低温下离心。

与SDS法相比，CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用，该方法另一个特点是在提取的前期能同时得到高含量的DNA和RNA。

2、SDS（十二烷基硫酸钠）法：

其原理是利用高浓度的SDS，在较高温度( 55～65℃ )条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的作法使蛋白质及多糖杂质沉淀 (有的是加 5mol／L的KAC于冰上保温，在低温条件下 KAC与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚／氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

SDS法操作简单，温和，也可提取到分子量较高的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。

三、材料、试剂和仪器

1试验材料：

新鲜或超低温冷冻干燥植物组织0.2g

2试剂：

无水乙醇，70％乙醇，氯仿

2%CTAB提取缓冲液：

2g/100ml CTAB

100mmol/L Tirs·Cl(pH=8.0)

50mmol/L EDTA(pH=8.0)

700mmol/L Nacl(pH=8.0)

3 仪器设备：

恒温水浴锅，离心机，移液器及配套枪头，离心管，研钵

四、步骤

1）取约0.2g叶在含有750ul左右提取缓冲液的研钵中磨碎，后转至1.5ml 的离心管中，60℃水浴30min～1h,其间轻轻颠倒2-3次；

2）取出冷至室温，然后用等体积氯仿-异戊醇（24：1）轻轻混匀并颠倒约5～10min，然后10000r/min离心10min；

3）轻轻取出，用一新的离心管移出上清液，然后用2倍体积的预冷(-20℃)无水乙醇沉淀；

4）待DNA收缩成团后，将其用70%乙醇洗1～2次后,干燥,然后用无离子水溶解后保存在－20℃冰箱中备用。

五、结果

记录观察每个步骤中溶液的颜色、有无沉淀产生、沉淀物颜色等变化。

实验二 DNA的定量分析

一、目的

了解检验DNA定量分析的方法和原理，熟悉检验提取DNA的质量，包括浓度与纯度的具体步骤和操作过程。

二、原理和方法

1、浓度

DNA样品的浓度一般可根据其在260nm的吸收值来确定。

50ug／ml的双链DNA对260nm紫外光的吸收值为1.0。凡是浓度大于0.25 ug ／ml的纯净DNA样品均可按此关系，由其OD260值求出其浓度。

测定时因比色杯最小的容积为0.5ml，微量制备的样品总体积不过20～100ul，因此应从所制备的样品中取出少量稀释后进行测定，根据稀释样品的吸收值及释释倍数计算出原样品的DNA浓度。

测定方法：取20ulDNA样品溶液，加dH2O至3ml，混匀后注入5ml的石英比色杯中，以dH2O为空白对照调零后进行测定。

DNA样品浓度(ug/ul)=OD260×样品稀释倍数×50/1000

2、纯度

纯净的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm的吸收值比应为1.8。

若OD260／OD280大于1.8，表明样品中有较多的RNA，这时应该用RNA酶重新处理样品，若比值小于1.6，则说明样品中蛋白质杂质较多，这时需要用氯仿重新抽提样品进一步去除去蛋白质杂质。

三、材料、试剂和仪器

1 实验材料：提取的植物总DNA

2 试剂：纯水（dH2O）

3仪器设备：紫外分光光度计，石英比色杯，烧杯、洗瓶

四、步骤

（1）预热分光光度计10～20min。

（2）取两只5.0 ml的狭缝石英比色杯，一只装入3.0ml dH2O作为空白溶液，校正分光光度计零点和透光度至100。

（3）测定DNA的浓度与纯度：

1）取20ulDNA待测样品，加dH2O稀释混匀至3000ul。

2）将两只比色杯放置在分光光度计中，调整入射光波长分别为260nm、280nm的OD值。（每次用dH2O液调整零点：T＝100、OD＝0）。

（4）DNA浓度与纯度的计算：

DNA样品的浓度：

DNA样品浓度(ug/ul)=OD260×N（样品稀释倍数）×50/1000 DNA样品的纯度：OD260／OD280

五、结果

计算DNA浓度和纯度，并根据结果进行分析。

实验三 RAPD标记技术

一、目的

学习掌握应用RAPD技术对植物进行DNA水平的遗传多样性检测。

二、原理和方法

利用10碱基RAPD引物进行PCR扩增反应。

三、材料、试剂和仪器

1. 实验试剂与RAPD反应混合物体系：

10×buffer 2ul

25mM MgCl2 1.6ul

2.5 mM dNTP 1.6ul

引物 2ul(40ng)

Taq 酶 0.2 ul (1 U)

DNA 2ul (80ng)

DH2O 10.6

总体积 20ul

2.实验仪器：

PCR仪，移液器，漩涡振荡器，0.2ml离心管

3. 反应程序：

（1） 94℃ 3min ;

（2） 94℃ 1min， 37℃ 1min ，72℃ 2min, 40个循环；

（3） 72℃ 5min；

（4） 4℃下保存待测。